Содержание к диссертации
Введение
1. Биодеструкция нефти и нефтепродуктов микроорганизмами 7
2. Объекты и методы исследований 38
3. Микроорганизмы процесса самоочищения шельфовых вод северного каспия от нефтяного загрязнения 47
3.1. Распределение нефтяных углеводородов в исследуемой акватории 49
3.2. Физиологические группы микроорганизмов, гипотетически способные к окислению нефтяных'углеводородов 55
3.2.1. Сапрофиты 58
3.2.2. Олиготрофы 60
3.2.3. Фенолокисляющие 62
3.2.4. Углеводородокисляющие 65
4. Микробиологическая активизация процесса самоочищения морской воды от нефти 78
4.1. Моделирование процесса естественного самоочищения 78
4.2. Выделение и изучение свойств микроорганизмов - деструкторов нефти 90
4.3. Активизация процесса самоочищения воды внесением выделенных микроорганизмов 92
4.4. Идентификация наиболее активного и жизнеспособного штамма 96
Заключение 101
Выводы 103
- Физиологические группы микроорганизмов, гипотетически способные к окислению нефтяных'углеводородов
- Углеводородокисляющие
- Выделение и изучение свойств микроорганизмов - деструкторов нефти
- Идентификация наиболее активного и жизнеспособного штамма
Введение к работе
Актуальность проблемы Одним из негативных факторов воздействия на водную среду и биологические ресурсы является широкомасштабное освоение нефтяных месторождений в морях, имеющих важное рыбохозяйственное значение. Нефтяные углеводороды в силу своей биологической активности относятся к наиболее опасным загрязняющим веществам, длительное воздействие которых может нарушать сложившееся равновесие экосистем.
В отличие от ксенобиотиков углеводороды нефти непрерывно поступают в морскую среду за счет подводных выходов нефти из морских месторождений на дне. Такие же или близкие по составу углеводороды продуцируются в результате биосинтетических процессов в живых организмах (Миронов, 1973, 1985; Патин, 1997; Немировская, 2000). Поэтому многие углеводороды являются естественными компонентами органического вещества незагрязненных водных экосистем, а природные микробные ценозы генетически адаптированы к их разрушению (Коронелли и др., 1993; Ильинский, 2000).
Самоочищение экосистем, загрязненных нефтью и нефтепродуктами является стадийным биогеохимическим процессом трансформации загрязняющих веществ, где микробное окисление углеводородов - ведущий фактор процесса элиминации нефти. В результате деятельности микроорганизмов происходит трансформация нефти до простых соединений и, тем самым, включение углеводородных компонентов в общий круговорот углерода в океане.
В силу высокой пластичности обменных процессов микробные популяции являются мощным фактором процессов самоочищения природных вод от нефтяного загрязнения. В отдельную группу большинство исследователей выделяет углеводородокисляющих - представителей гетеротрофных микроорганизмов, способных к окислению нефтяных углеводородов. Изучение углеводородокисляющих микроорганизмов в природных экосистемах обычно связывают с загрязнением их нефтью и нефтепродуктами. Некоторыми отечественными
4 исследователями было предложено использовать их численность для того, чтобы картировать загрязненность водных экосистем нефтью (Миронов, 1971, 1980; Цыбань, 1976; Марголина, 1967, 1973), а саму группу микроорганизмов, способных к росту на нефти и нефтепродуктах считать «индикаторной». Однако известно, что углеводородокисляющие бактерии широко распространены в природе, их пищевые потребности разнообразны и среди них нет узкоспециализированных форм (Шлегель, 1972; 1987). По последним данным литературы (Ильинский, 1979; 2000; Янушка, 1990; Бердичевская и др.,1991; Салманов, 1999; Уцов и др., 1999) эта группа бактерий является постоянным компонентом микробиоценозов, независимым от уровня загрязнения нефтепродуктами. Микроорганизмы, способные к деструкции нефтяных углеводородов, могут входить в различные физиологические группы, в том числе сапрофитные, олиготрофные и фенол окисляющие, поэтому их можно считать гипотетически активными.
Северный Каспий является уникальной акваторией, гидролого-гидрохимический режим которой формируется сложными процессами, обусловленными частой штормовой активностью, конвергенцией вод, мелководно-стью, изменчивостью солености и влиянием речного стока. В связи с освоением шельфа Северного Каспия нефтяные углеводороды могут стать дополнительным фактором загрязнения морской среды.
Именно в ситуации освоения нефтяных месторождений представляет интерес изучение в этой акватории изучение процесса самоочищения и микроорганизмов, обладающих способностью разрушать нефтяные углеводороды. Целью настоящей работы явилось исследование микроорганизмов процесса самоочищения шельфовых вод Северного Каспия от нефтяного загрязнения.
В связи с этим в задачи исследования входило:
Выявить в исследуемой акватории районы с повышенным содержанием нефтяных углеводородов
Изучить распределение и численность физиологических групп микроорганизмов, гипотетически способных к окислению нефти
Исследовать в моделях самоочищающую способность морской воды при различной степени нефтяного загрязнения.
Выделить и изучить свойства активных штаммов микроорганизмов -деструкторов нефти.
Изучить возможность активизации процесса самоочищения внесением выделенных микроорганизмов.
6. Идентифицировать наиболее активный и жизнеспособный штамм.
Научная новизна. В работе показано, что шельфовые воды Северного
Каспия в районе освоения месторождений углеводородного сырья обладают способностью к самоочищению от нефтяного загрязнения. Впервые выделен и изучен новый штамм Phyllobacterium myrsinacearum, способный к деструкции нефтяных углеводородов.
Практическая значимость работы. Результаты комплексных микробиологических и гидролого-гидрохимических наблюдений в районе освоения нефтяных месторождений на шельфе Северного Каспия являются составной частью мониторинга морской среды при проведении буровых работ. Подана заявка о выдаче патента на изобретение «Штамм Phyllobacterium. myrsinacearum DKS-1 для деструкции нефтяных углеводородов солоноватоводных и пресных экосистем» (приоритет от. 31.10.03 № 2003131668). Материалы диссертационной работы входят в раздел «Оценка воздействия на окружающую среду» индивидуальных рабочих проектов по строительству поисково-разведочных скважин ОАО «Лукойл» в северной части Каспийского моря, а также используются в учебном процессе в институте «Биология и природопользование» Астраханского государственного технического университета.
Апробация работы. Основные положения и материалы диссертации были представлены на Международном Форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, 2001), на Международной научно-практической конференции молодых ученых «Проблемы аквакультуры и функционирования водных экосистем» (Киев, 2002), на V Международном конгрессе «Вода: экология
и технология» (ЭКВАТЕК, 2002) (Москва, 2002), на Международной конференции «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах» (Москва, 2002), на XII Международной конференции молодых ученых «Биология внутренних вод: проблемы экологии и биоразнообразия» (п. Борок, Ярославская обл., 2002), на международной научной конференции «Проблемы мониторинга экосистем Каспийского моря» (Махачкала, 2002), на I -м совещании по формированию программы исследований «Мониторинг и биологическая реабилитация загрязненных нефтью и нефтепродуктами территорий» (Астрахань, 2002), на конференции «Биотехнология в охране и реабилитации окружающей среды» (Москва, 2003), на Международной конференции «Рыбохозяй-ственная наука на Каспии: задачи и перспективы» (Махачкала, 2003), на научно-практических конференциях профессорско-преподавательского состава Астраханского государственного технического университета в 2001-2003 гг.
Публикации По материалам диссертации опубликовано 13 работ.
Объем и структура работы Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, списка литературы и приложений, изложена на 159 страницах машинописного текста, иллюстрирована 6 таблицами и 18 рисунками. Список использованной литературы включает 240 источников, из них 78 на иностранных языках.
Автор выражает благодарность научному руководителю доктору биологических наук, профессору И.С. Дзержинской, а также сотрудникам кафедры «Прикладная биология и микробиология» Астраханского государственного технического университета.
Физиологические группы микроорганизмов, гипотетически способные к окислению нефтяных'углеводородов
С целью исследования физиологических групп микроорганизмов (сапро-фитов, олиготрофов, углеводородокисляющих и фенолокисляющих), гипотетически способных участвовать в процессе самоочищения морской воды от нефтяного загрязнения, проводился микробиологический анализ шельфовых вод Северного Каспия, результаты которого отражены в таблице 2 и рисунках 5-20 Приложения 2. Нами была рассчитана также средняя численность бактерий всех исследуемых групп для поверхностного и придонного горизонтов каждой из четырех экспедиций (рис. 5). Оказалось, что средние уровни численности исследованных групп бактерий в каждой из экспедиций изменялись сходным образом. Минимальные уровни средней численности бактерий всех групп для всех горизонтов наблюдались в осенних экспедициях. Наиболее высокие уровни средней численности всех групп бактерий отмечены в поверхностном горизонте вод. 3.2.1. Сапрофиты Результаты микробиологического анализа шельфовых вод Северного Каспия показали, что сапрофиты оказались доминирующими среди исследованных нами групп бактерий. Весной 2000 г. численность сапрофитной микрофлоры (рис. 5 Приложения 2) составляла 1-200 тыс. кл/мл в поверхностном, достигая максимальных значений на мелководных станциях, расположенных около островов Тюлений и Чечень, и 0,85-150 тыс. кл/мл в придонном горизонтах (максимум - на станциях в районе буровой). Средняя численность сапрофитов - 16,44±3,9 в поверхностном и 11,17±2,5 тыс. кл/мл в придонном горизонтах. В осенней экспедиции 2000 г. их численность была в пределах 1-35 тыс., в среднем 7,5±0,83 тыс. кл/мл в поверхностном и 0,8-25 тыс., в среднем 5,6±0,65 тыс. кл/мл в придонном слое вод, достигая максимальных значений на станции 4-7 и на станциях вблизи островов (рис. 6 Приложения 2). Весной 2001 г. распределение сапрофитов было достаточно равномерным, их число составляло 1-30 тыс. и 0,5-20 тыс. кл/мл, при средней численности 11,81±0,8 и 7,1±0,62 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно (рис. 7 Приложения 2). Осенью 2001 г. численность сапрофитной микрофлоры составляла 1-40 тыс. и 0,2-40 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно.
Максимум их развития отмечен на станции 3-10 (в районе буровой установки) на всех горизонтах (рис. 8 Приложения 2). Среднее количество сапрофитов в поверхностном горизонте составляло 6,3±0,89, в придонном - 4,9 ±0,78 тыс. кл/мл. Таким образом, распределение сапрофитных бактерий носит выраженный сезонный характер с преобладанием их численности в весенний период. Причем пространственное распределение характеризовалось наличием участков (вблизи островов Тюлений и Чечень, в районе буровой установки), на которых отмечалась их максимальная плотность (рис. 6). Это может быть связано с проведением поисковых буровых работ, а в мелководных участках - взмучиванием донных отложений сильными волнениями, характерными для исследуемой акватории. 3.2.2. Олиготрофы В период экспедиционных наблюдений численность олиготрофных микроорганизмов в пробах морской воды была менее обильной в сравнении с сапрофитными и углеводородокисляющими. Пространственное распределение олиготрофов характеризовалось наличием тех же участков с максимальной плотностью бактериальной популяции, что и сапрофитов - в районе островов и вблизи буровой установки (рис. 7) Весной 2000 г. наблюдались следующие диапазоны колебания обилия олиготрофных бактерий: от сотен клеток до 30 тыс. кл/мл на всех горизонтах вод. Максимальная численность зарегистрирована в поверхностном горизонте станции 7-6 (около острова Чечень) и в придонном горизонте станций, находящихся в районе буровой установки «Астра» (рис. 9 Приложения 2). Средняя их численность за время экспедиции составила 5,23±0,7 и 3,5±0,62 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно. Осенью 2000 г. поверхностном и придонном горизонтах вод их численность варьировала от сотен клеток до 9 тыс/мл. Причем наибольшее обилие этой группы бактерий зафиксировано на станции 4-7 на всех горизонтах. В районе буровой установки количество олиготрофной микрофлоры колебалось от 0,5 до 6 тыс. (рис. 10 Приложения 2). Средние показатели количественного развития бактерий этой группы составили 2,1±0,21 и 1,3±0,16 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно. В весенней экспедиции 2001 г. среднее количество олиготрофных бактерий было на том же уровне, что и весной 2000 г. - 5,63±0,57 и 3,38±0,44 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно. Их численность варьировала от сотен клеток до 19 тыс. в поверхностном и до 17 тыс. в 1 мл проб воды в придонном горизонтах. Максимальное обилие олиготрофов на всех горизонтах вод наблюдалось на станции 7-6, расположенной между островами Тюлений и Чечень. В районе установки «Астра» их количество составляло 1-18 тыс. и 0,5-10 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно (рис. 11 Приложения 2). Численность олиготрофной микрофлоры в пробах воды осенью 2001 г. варьировала от сотен до 10 тыс. кл/мл при среднем ее значении 2,3±0,23 в поверхностном и 1,4±0,16 тыс. кл/мл в придонном горизонтах, и была в целом весьма близка к таковой, обнаруженной нами осенью 2000 г. Максимальные величины численности олиготрофов в воде отмечены на станции 7-3, расположенной в районе острова Тюлений. В пробах воды со станций в районе «Астры» их количество колебалось от сотен клеток до 2,7 тыс. кл/мл (рис. 12 Приложения 2). Таким образом, распределение олиготрофов носит тот же сезонный и пространственный характер, что и сапрофитов. 3.2.3. Фенолокисляющие Фенолокисляющие бактерии оказались самой малочисленной группой из исследованных нами микроорганизмов шельфовых вод Северного Каспия. Максимальное обилие этих бактерий отмечено в тех же участках акватории, что и для сапрофитов и олиготрофов (рис. 8). 64 В весенней экспедиции 2000 г. их численность составляла от единичных клеток до 20 тыс. в поверхностном и до 10 тыс. кл/мл в придонном горизонтах при среднем значении 4,8±0,63 и 1,4±0,22 тыс. кл/мл (рис. 13 Приложения 2). В пробах воды осенью 2000 г. фенолокисляющие в среднем составляли 3,6±0,39 тыс. в поверхностном и 1,8±0,24 тыс. кл/мл в придонном горизонтах. В поверхностном слое вод их численность колебалась от единичных клеток до 15 тыс., в придонном - до 8 тыс. кл/мл (рис. 14 Приложения 2). Экспедиционные исследования весной 2001 г. показали, что численность фенолокисляющих бактерий значительно ниже таковой, обнаруженной нами в предыдущих экспедициях. Так среднее их количество составляло 1,48±0,24 тыс. и 0,61±0,08 тыс. кл/мл, варьируя от единичных клеток до 12 тыс. в поверхностном и до 3 тысяч клеток в мл в придонном горизонте вод (рис. 15 Приложения 2).
Осенью 2001 г. их численность варьировала от единичных клеток до 12 тыс. в поверхностном и до 10 тыс. кл/мл в придонном горизонтах (рис. 16 Приложения 2) при среднем их количестве 0,9±0,25 и 0,6±0,18 тыс. кл/мл. Наибольшее обилие фенолокисляющих микроорганизмов на всех горизонтах вод отмечено в районе буровой установки за время всех экспедиций, исключая осеннюю 2001 г., когда максимум их численности был на станции 7-3 (в районе острова Тюлений). Основным источником фенолов в Каспийском море является речной сток (Орадовский, 1997). Фенолы поступают в Каспий также со сточными водами нефтехимической промышленности (Шапоренко, 1997). Присутствуют фенолы и в сбросах жидких отходов, если таковые осуществляются, с буровых платформ, в которых их концентрация может достигать 5-6 мг/л (Патин, 1997). Нельзя забывать и о том, что фенольные соединения могут быть не только антропогенного, но и природного происхождения. Фенолы автохтонного происхождения образуются в море в процессе метаболизма различных водных организмов, при отмирании водорослей, при развитии синезеленых водорослей, а также синтезируются многими микроорганизмами (Горбенко, 1990). Зафиксированное в 1997-2000 гг. уменьшение содержания фенолов в северной части Каспия в сравнении с данными прошлых лет (Экологическая политика..., 2000), свидетельствует об отсутствии сбросов загрязняющих веществ в воду при проведении буровых работ. 3.2.4. Углеводородокисляющие Углеводородокисляющие микроорганизмы оказались второй по численности группой в шельфовых водах Северного Каспия. Они присутствовали в пробах воды со всех станциях и со всех горизонтов, причем их пространственное распределение было достаточно равномерным (рис. 9). В весенней экспедиции 2000 г. их количество составляло 0,5-30 тыс. и 0,1-11 тыс. кл/мл при средних величинах 5,6±0,63 и 3,8±0,38 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно. Максимальная их численность отмечена в пробах воды со станции 8-4 структуры «Ракушечная». В пробах воды, взятых со станций в районе буровой установки, их количество составляло от сотен клеток до 15 тыс. в поверхностном и до 10 тыс. кл/мл в придонном горизонтах (рис. 17 Приложения 2)
Углеводородокисляющие
С целью исследования физиологических групп микроорганизмов (сапро-фитов, олиготрофов, углеводородокисляющих и фенолокисляющих), гипотетически способных участвовать в процессе самоочищения морской воды от нефтяного загрязнения, проводился микробиологический анализ шельфовых вод Северного Каспия, результаты которого отражены в таблице 2 и рисунках 5-20 Приложения 2. Нами была рассчитана также средняя численность бактерий всех исследуемых групп для поверхностного и придонного горизонтов каждой из четырех экспедиций (рис. 5). Оказалось, что средние уровни численности исследованных групп бактерий в каждой из экспедиций изменялись сходным образом. Минимальные уровни средней численности бактерий всех групп для всех горизонтов наблюдались в осенних экспедициях. Наиболее высокие уровни средней численности всех групп бактерий отмечены в поверхностном горизонте вод. 3.2.1. Сапрофиты Результаты микробиологического анализа шельфовых вод Северного Каспия показали, что сапрофиты оказались доминирующими среди исследованных нами групп бактерий. Весной 2000 г. численность сапрофитной микрофлоры (рис. 5 Приложения 2) составляла 1-200 тыс. кл/мл в поверхностном, достигая максимальных значений на мелководных станциях, расположенных около островов Тюлений и Чечень, и 0,85-150 тыс. кл/мл в придонном горизонтах (максимум - на станциях в районе буровой). Средняя численность сапрофитов - 16,44±3,9 в поверхностном и 11,17±2,5 тыс. кл/мл в придонном горизонтах. В осенней экспедиции 2000 г. их численность была в пределах 1-35 тыс., в среднем 7,5±0,83 тыс. кл/мл в поверхностном и 0,8-25 тыс., в среднем 5,6±0,65 тыс. кл/мл в придонном слое вод, достигая максимальных значений на станции 4-7 и на станциях вблизи островов (рис. 6 Приложения 2). Весной 2001 г. распределение сапрофитов было достаточно равномерным, их число составляло 1-30 тыс. и 0,5-20 тыс. кл/мл, при средней численности 11,81±0,8 и 7,1±0,62 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно (рис. 7 Приложения 2). Осенью 2001 г. численность сапрофитной микрофлоры составляла 1-40 тыс. и 0,2-40 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно.
Максимум их развития отмечен на станции 3-10 (в районе буровой установки) на всех горизонтах (рис. 8 Приложения 2). Среднее количество сапрофитов в поверхностном горизонте составляло 6,3±0,89, в придонном - 4,9 ±0,78 тыс. кл/мл. Таким образом, распределение сапрофитных бактерий носит выраженный сезонный характер с преобладанием их численности в весенний период. Причем пространственное распределение характеризовалось наличием участков (вблизи островов Тюлений и Чечень, в районе буровой установки), на которых отмечалась их максимальная плотность (рис. 6). Это может быть связано с проведением поисковых буровых работ, а в мелководных участках - взмучиванием донных отложений сильными волнениями, характерными для исследуемой акватории. 3.2.2. Олиготрофы В период экспедиционных наблюдений численность олиготрофных микроорганизмов в пробах морской воды была менее обильной в сравнении с сапрофитными и углеводородокисляющими. Пространственное распределение олиготрофов характеризовалось наличием тех же участков с максимальной плотностью бактериальной популяции, что и сапрофитов - в районе островов и вблизи буровой установки (рис. 7) Весной 2000 г. наблюдались следующие диапазоны колебания обилия олиготрофных бактерий: от сотен клеток до 30 тыс. кл/мл на всех горизонтах вод. Максимальная численность зарегистрирована в поверхностном горизонте станции 7-6 (около острова Чечень) и в придонном горизонте станций, находящихся в районе буровой установки «Астра» (рис. 9 Приложения 2). Средняя их численность за время экспедиции составила 5,23±0,7 и 3,5±0,62 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно. Осенью 2000 г. поверхностном и придонном горизонтах вод их численность варьировала от сотен клеток до 9 тыс/мл. Причем наибольшее обилие этой группы бактерий зафиксировано на станции 4-7 на всех горизонтах. В районе буровой установки количество олиготрофной микрофлоры колебалось от 0,5 до 6 тыс. (рис. 10 Приложения 2). Средние показатели количественного развития бактерий этой группы составили 2,1±0,21 и 1,3±0,16 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно. В весенней экспедиции 2001 г. среднее количество олиготрофных бактерий было на том же уровне, что и весной 2000 г. - 5,63±0,57 и 3,38±0,44 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно. Их численность варьировала от сотен клеток до 19 тыс. в поверхностном и до 17 тыс. в 1 мл проб воды в придонном горизонтах. Максимальное обилие олиготрофов на всех горизонтах вод наблюдалось на станции 7-6, расположенной между островами Тюлений и Чечень. В районе установки «Астра» их количество составляло 1-18 тыс. и 0,5-10 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно (рис. 11 Приложения 2). Численность олиготрофной микрофлоры в пробах воды осенью 2001 г. варьировала от сотен до 10 тыс. кл/мл при среднем ее значении 2,3±0,23 в поверхностном и 1,4±0,16 тыс. кл/мл в придонном горизонтах, и была в целом весьма близка к таковой, обнаруженной нами осенью 2000 г. Максимальные величины численности олиготрофов в воде отмечены на станции 7-3, расположенной в районе острова Тюлений. В пробах воды со станций в районе «Астры» их количество колебалось от сотен клеток до 2,7 тыс. кл/мл (рис. 12 Приложения 2). Таким образом, распределение олиготрофов носит тот же сезонный и пространственный характер, что и сапрофитов. 3.2.3. Фенолокисляющие Фенолокисляющие бактерии оказались самой малочисленной группой из исследованных нами микроорганизмов шельфовых вод Северного Каспия. Максимальное обилие этих бактерий отмечено в тех же участках акватории, что и для сапрофитов и олиготрофов (рис. 8). 64 В весенней экспедиции 2000 г. их численность составляла от единичных клеток до 20 тыс. в поверхностном и до 10 тыс. кл/мл в придонном горизонтах при среднем значении 4,8±0,63 и 1,4±0,22 тыс. кл/мл (рис. 13 Приложения 2). В пробах воды осенью 2000 г. фенолокисляющие в среднем составляли 3,6±0,39 тыс. в поверхностном и 1,8±0,24 тыс. кл/мл в придонном горизонтах. В поверхностном слое вод их численность колебалась от единичных клеток до 15 тыс., в придонном - до 8 тыс. кл/мл (рис. 14 Приложения 2). Экспедиционные исследования весной 2001 г. показали, что численность фенолокисляющих бактерий значительно ниже таковой, обнаруженной нами в предыдущих экспедициях. Так среднее их количество составляло 1,48±0,24 тыс. и 0,61±0,08 тыс. кл/мл, варьируя от единичных клеток до 12 тыс. в поверхностном и до 3 тысяч клеток в мл в придонном горизонте вод (рис. 15 Приложения 2).
Осенью 2001 г. их численность варьировала от единичных клеток до 12 тыс. в поверхностном и до 10 тыс. кл/мл в придонном горизонтах (рис. 16 Приложения 2) при среднем их количестве 0,9±0,25 и 0,6±0,18 тыс. кл/мл. Наибольшее обилие фенолокисляющих микроорганизмов на всех горизонтах вод отмечено в районе буровой установки за время всех экспедиций, исключая осеннюю 2001 г., когда максимум их численности был на станции 7-3 (в районе острова Тюлений). Основным источником фенолов в Каспийском море является речной сток (Орадовский, 1997). Фенолы поступают в Каспий также со сточными водами нефтехимической промышленности (Шапоренко, 1997). Присутствуют фенолы и в сбросах жидких отходов, если таковые осуществляются, с буровых платформ, в которых их концентрация может достигать 5-6 мг/л (Патин, 1997). Нельзя забывать и о том, что фенольные соединения могут быть не только антропогенного, но и природного происхождения. Фенолы автохтонного происхождения образуются в море в процессе метаболизма различных водных организмов, при отмирании водорослей, при развитии синезеленых водорослей, а также синтезируются многими микроорганизмами (Горбенко, 1990). Зафиксированное в 1997-2000 гг. уменьшение содержания фенолов в северной части Каспия в сравнении с данными прошлых лет (Экологическая политика..., 2000), свидетельствует об отсутствии сбросов загрязняющих веществ в воду при проведении буровых работ. 3.2.4. Углеводородокисляющие Углеводородокисляющие микроорганизмы оказались второй по численности группой в шельфовых водах Северного Каспия. Они присутствовали в пробах воды со всех станциях и со всех горизонтов, причем их пространственное распределение было достаточно равномерным (рис. 9). В весенней экспедиции 2000 г. их количество составляло 0,5-30 тыс. и 0,1-11 тыс. кл/мл при средних величинах 5,6±0,63 и 3,8±0,38 тыс. кл/мл в поверхностном и придонном горизонтах соответственно. Максимальная их численность отмечена в пробах воды со станции 8-4 структуры «Ракушечная». В пробах воды, взятых со станций в районе буровой установки, их количество составляло от сотен клеток до 15 тыс. в поверхностном и до 10 тыс. кл/мл в придонном горизонтах (рис. 17 Приложения 2)
Выделение и изучение свойств микроорганизмов - деструкторов нефти
Микроорганизмы, способные к деструкции нефтяных углеводородов, были выделены из проб воды Северного Каспия в районе плавучей буровой установки «Астра» на минеральной среде Миллса с соавторами (среда ММС) (Mills et al., 1978) с добавками нефти через накопительные культуры по общепринятой методике (Руководство по методам биологического анализа морской воды и донных отложений, 1980). Проверку выделенных культур на чистоту осуществляли на мясопептонном агаре. Для культивирования штаммов применяли МПА, агаризованную среду ММС, плотные и жидкие среды Чапека, магниево-калиево-дрожжевую среду (МКД), Маккланга с дизельным топливом и нефтью. В результате выделения были получены два штамма чистых культур, которые оказались доминирующими при высеве на плотные среды с нефтью и нефтепродуктами. Идентификацию выделенных штаммов, используемых для интенсификации процесса самоочищения морской воды от нефти, проводили по общепринятым методикам и определителям (Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, 1984-1989; определителю бактерий Берджи, 1997; монографии Нестеренко с соавт., 1985; монографии Смирнова и Киприановой, 1990). Для определения биохимических свойств микроорганизмов использовали также пластины биохимические для идентификации энтеробактерий (ПБДЭ). Штамм № 1 при культивировании на МПА образовывал круглые колонии, 1-2 мм в диаметре, выпуклые, блестящие, слизистые, с ровным краем. Пигментация колоний от светло-розовой до красной. На МПБ культура образует однородную муть и осадок, на жидкой среде Миллса с нефтью в стационарных условиях появляется пленка розового цвета. Штамм представляет собой грамвариабельные прямые подвижные палочки, не образующие спор. Культура является аэробной, оксидазоположительной, каталазоположитель-ной, галотолерантной (рост в интервале солености 0-20 % NaCl), не гидро- лизует крахмал, казеин, пектин и целлюлозу, не разжижает желатин, не образует сероводород и индол, восстанавливает нитраты в нитриты, образует кислоту из глюкозы, не окисляет лактозу. Выделенный микроорганизм не имеет аргининдегидролазу, лизин - и орнитиндекарбоксилаз, уреазы, фенилаланин-дезаминазы, р-галактозидазы, не утилизирует цитрат и малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой. Штамм № 2 при культивировании на МПА растет в виде бесцветных плоских колоний с расползающимися краями.
Проведенное изучение морфологических признаков культуры путем микроскопирования показало, что это прямые подвижные тонкие грамотрицательные палочки, движущиеся вдоль своей оси и размножающиеся бинарным способом. Биохимические исследования показали, что выделенная культура является аэробной, оксидазополо-жительной, каталазоположительной. Рост на МПБ сопровождается образованием мути, хорошо растет на МПБ с 7 % NaCl, не растет на бульоне с 10 % содержанием соли. На среде Миллса рост сопровождается появлением пленки. Выделенный микроорганизм имеет аргининдегидролазу, но не имеет лизин- и орнитиндекарбоксилаз, уреазы, фенилаланиндезаминазы, Р-галактозидазы. Не образует сероводород и индол, не утилизирует цитрат и малонат натрия, цитрат натрия с глюкозой. Усваивает в качестве источника углерода глюкозу, арабинозу, мальтозу, не усваивает маннит, сахарозу, лактозу, инозит, сорбит. Не способен к денитрификации, не способен к анаэробной ферментации глюкозы, в аэробных условиях окисляет глюкозу до кислоты. Не разжижает желатин. Выделенные штаммы хорошо растут на жидких и плотных средах с нефтью и нефтепродуктами, что позволило использовать их в качестве активных деструкторов нефтяных углеводородов в микроэкосистемах, созданных для активизации процесса самоочищения морской воды от нефтяного загрязнения. 4.3. Активизация процесса самоочищения внесением микроорганизмов — деструкторов нефти Интенсивное загрязнение территорий и акваторий нефтепродуктами требует разработки различных способов их очистки. На основе исследований по изучению способности природных экосистем к самоочищению и определений нефтелитических свойств микроорганизмов-деструкторов разрабатывают биопрепараты для очистки загрязненных нефтью объектов. Однако эффективность применения биопрепаратов зависит от ряда факторов. Зачастую активность внесенных препаратов подавляется аборигенными микробными популяциями. Поэтому наиболее эффективными считают биопрепараты на основе природных углеводородокисляющих микроорганизмов, включающих различные таксономические и физиологические группы. Для интенсификации процесса самоочищения воды от нефтяного загрязнения существует несколько способов, среди них - внесение биогенных элементов, монокультур и ассоциаций микроорганизмов (Изъюрова, 1955; Морозов, Николаев, 1978; Копытов и др., 1982; Мац и др., 1994). Наша задача состояла в выявлении активного штамма для биотехнологических целей. Внесение биогенных или других веществ не дает оценить активность самого штамма. Поэтому для активизации процесса самоочищения морской воды от нефти использовали метод микроэкосистем, заключающийся в том, что к естественной микробной ассоциации воды добавляли чистые культуры микроорганизмов, выделенные нами из проб воды Северного Каспия в районах нефтяной разведки. Контрольными являлись сосуды с морской водой с 1% стерильной нефти без внесения штаммов. Активность исследуемых культур по отношению к деструкции нефти оценивали по изменению суммарного количества нефтяных углеводородов методом, описанным выше. Пробы на анализы отбирали через 3, 10, 20, 30 суток. - В очищаемую от нефти среду рекомендовано вносить не менее 106 бактериальных клеток в 1 мл, причем определение жизнеспособных клеток рекомендуется проводить перед использованием суспензии микроорганизмов (Евдокимова и др., 1994; Ягафарова и др., 1999). Количество жизнеспособной культуры №1 составляло 2,13 106кл/мл. Численность жизнеспособной культуры № 2 была 1,8 10 кл/мл. Сухой вес биомассы штамма № 1 составил 92,4 мг/л, штамма № 2 - 83,3 мг/л. Начальное содержание нефтяных углеводородов во всех вариантах опыта составляло 190 мг/л (рис. 16).
Идентификация наиболее активного и жизнеспособного штамма
При проведении предварительного анализа секвенированного короткого фрагмента, представляющего наиболее вариабельный участок гена 16S рРНК, для исследуемого штамма № 1 было установлено, что он относится к филогенетическому подразделению альфа-протеобактерий. Для окончательного анализа была секвенирована почти полная последовательность (1375 нуклеотидов) гена 16S рРНК изучаемого штамма, что по номенк- латуре E.coli соответствует позициям с 55 по 1465 нуклеотид. На основании проведения сравнительного филогенетического анализа с использованием последовательностей генов 16S рРНК, представленных в базе данных GenBank, было установлено, что внутри подразделения альфа-протеобактерий изучаемый штамм относится к кластеру членов семейства Phyllobacteriacea (рис. 18). Внутри этого семейства изучаемый штамм обнаружил наиболее высокое сходство нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК с аналогичными последовательностями 3 штаммов единственного вида рода Phyllobacterium - Р. myrsinacearum (97.0-97.5%). При этом исследуемый штамм образовывал со штаммами данного вида единый кластер с достаточно высокой степенью достоверности (значение показателя bootstrap-анализа 82). Уровень сходства последовательностей 16S рРНК штамма № 1 с другими представителями семейства Phyllobacte-riacea составлял 96.5-97.3% с видами рода Mesorhizobium и 95.0-96.6% с видами других родов. Согласно существующим представлениям (Stackebrandt, Goebel, 1994) штаммы, принадлежащие к одному виду, должны иметь не более 3% различий в нуклеотидных последовательностях 16S рРНК. По этому критерию возможно отнесение штамма № 1 к виду P. myrsinacearum. Род Phyllobacterium был описан в 1962 г. (Knosel, 1962), но таксономическое описание получил в определителе Берги. По данным определителя бактерий Берги представители этого рода встречаются в узелках на листьях высших растений видов семейств мирзиновых (Myrsinaceae) и мареновых (Rubiaceae). Согласно определителям (Bergey s Manual of Systematic Bacteriology, 1984-1989; Clark et al, 1984) бактерии рода Phyllobacterium являются грамнега-тивными прямыми палочками размером 0,4-0,8 х 0,8-2,0 мкм. Подвижные за счет единственного полярного жгутика или нескольких полярных либо латеральных жгутиков. Являются строгими аэробами с метаболизмом чисто дыхательного типа с использованием кислорода в качестве конечного акцептора электронов. Оптимальная температура для роста 28-34 С. Колонии на агаризо-ванной среде с глюкозой и дрожжевым экстрактом прозрачные, бесцветные или бежевого цвета, слизистые.
Оксидазо- и каталазоположительные. Хемооргано-трофы, используют в качестве источников углерода разнообразные сахара или соли органических кислот. Не образуют крахмал, пектин, целлюлозу, не продуцируют индол, окисляют глюкозу и ксилозу, но не лактозу. Не продуцируют внеклеточные ферменты для гидролиза твина 80, желатины, крахмала, казеина (Gilardi, 1978). По литературным данным род Phyllobactenum относится к почвенным микроорганизмам (Leahy, Colwell, 1990; Antje Lauer, 2001; Hallmann et al, 1999). Phyllobactenum myrsinacearum был выделен из песчаных дюн, загрязненных нефтью в Гваделупе (Megan М.McCoy, 2000). Имеются данные о выделении бактерий рода Phyllobactenum из корней сахарной свеклы (Lambert et al, 1990; Mergaert et al, 2002), известны симбиотические взаимодействия между Phyllobactenum myrsinacearum и водорослью Chlorella vulgaris (Lebsky et al., 2001), a также между Phyllobactenum sp. и Bacillus licheniformis, выделенных из мангровых растений (Rojas et. al., 2001). Известно, что бактерии рода Phyllobacterium обладают свойством стимулировать устойчивость растений к болезнетворным организмам (Lambert et al, 1990), способностью фиксировать азот и производить гормоны роста (Horner, Lersten, 1972; Fletcher et al, 1976; Van Hove, 1976; Lersten, Horner, 1976). Кносель (Knosel, 1962), выделивший и описавший род Phyllobacterium, отмечал его способность стимулировать образование характерных клубеньков в листьях растений (Knosel, 1984). Этот автор базировал свое заключение на более ранних исследованиях (Miehe, 1911; Von Faber, 1912; De Jongh, 1938). Однако не известно, являются ли бактерии, изученные этими исследователями, идентичными тем, которые описал Кносель. Часто представителей рода Phyllobacterium неправильно идентифицируют, относя их к Corynebacterium или Klebsiella из-за их возможной вариабельности в окраске по Грамму, наличия изогнутых клеток с утолщенными концами (Chester, Cooper, 1979). Анализ литературных данных показал отсутствие информации о выделении представителей этого рода бактерий отечественными учеными, а также не обнаружено сведений о них, как деструкторах нефти и нефтепродуктов- Таким образом, нами впервые доказана способность выделенного штамма Phyllobacterium myrsinacearum утилизировать нефтяные углеводороды и активизировать процесс самоочищения воды от нефтяного загрязнения. Выделенный штамм обладает высокой жизнеспособностью и активно разрушает нефтяные углеводороды, что дает возможность использовать его в биотехнологических целях для создания биопрепарата. Подана заявка о выдаче патента на изобретение «Штамм Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1 для деструкции нефтяных углеводородов солоноватоводных и пресных экосистем» (приоритет от 31.10.03 № 2003131668). Изобретение предназначено для использования в экологической биотехнологии, микробиологии при разработке способов биологической очистки водных экосистем от загрязнения нефтью и нефтепродуктами, в частности бактериальным штаммом Phyllobacterium myrsinacearum DKS-1, обладающим способностью активизировать процесс деструкции нефтяных углеводородов.
