Введение к работе
Актуальность темы. В условиях интенсификации молочного животноводства большое значение приобретают респираторные болезни, приводящие к снижению экономической эффективности данной отрасли. В возникновении бронхопневмоний у крупного рогатого скота (КРС) большую роль играют представители семейства Pasteurellaceae: грамотрицательные, факультативно анаэробные палочкообразные бактерии, являющиеся комменсальными обитателями поверхности слизистых оболочек верхнего респираторного тракта животных, способные вызывать вторичные инфекционные болезни. Семейство включает 6 родов (М.А. Сидоров, 1983, 1995; Р. Kuhnert, 2008; S.B. Shivachandra, 2011), но наибольшую роль в патологии животных играют представители родов Mannheimia и Pasteurella, а именно виды: M. haemolytica А1 и P. multocida. Последняя включает 5 капсульных серотипов, но патологию легких у телят чаще вызывают A и D серотипы (М.А. Сидоров, 1983; С.И Джупина, А.А. Колосов, 1992; Э.А. Шегидевич, 1993; S.M. Dabo, 2008). Эти болезни не имеют выраженной сезонности и регистрируются чаще у молодняка 1-6-месячного возраста на фоне стрессов, вирусных инфекций и неудовлетворительных условий кормления и содержания, болеют и взрослые животные (Э.А. Шегидевич, 1993; J. Van Donkersgoed, 1993).
В настоящее время актуальным является изучение распространения и частоты проявления данной патологии у КРС, а также идентификация и определение таксономической принадлежности возбудителей с целью оптимизации противоэпизоотических мероприятий.
Степень разработанности проблемы. На момент начала работы исследований по молекулярной биологии бактерий семейства Pasteurellaceae в нашей стране было недостаточно. Изучению эпизоотологии и разработке средств и методов диагностики пастереллезов сельскохозяйственных животных были посвящены работы М.А. Сидорова (1972-1982), Э.А. Шегидевича (1982-2005), С.И. Джупины, А.А. Колосова (1986-1997) и других. Метод серологической типизации пастерелл, основанный на различиях по капсульному или соматическому антигену не дает точной информации о таксономической принадлежности бактерий и не нашел применения в нашей стране (М.А. Сидоров, 1983, 1995). Поэтому вопрос типизации выделенных культур бактерий остается открытым. Наиболее перспективными в данном направлении являются молекулярные методы, в том числе полимеразная цепная реакция (ПЦР).
В последние годы для выявления Pasteurella multocida разработаны ПЦР-тест-системы на гены: psl (C.W. Lee et al., 2000); kmt (K.M. Townsend et al., 1998); 16S рРНК-23S рРНК (J.K. Miflin et al., 2001), Pm0762 и Pm1231 (D.Liu et al., 2004). Для выявления генома Mannheimia haemolytica используют праймеры на гены HP, Lkt, Lkt2, 16S (C. Ewers, 2006; T.W. Alexander et al., 2008).
В доступной отечественной литературе нам удалось найти только одну работу М.А. Шибаева (2009) посвященную разработке тест-системы для выявления бактерий P. multocida и M. haemolytica с помощью ПЦР в Центральном Федеральном округе (ЦФО) РФ.
Таким образом, возникла необходимость разработки новых, более эффективных методов типирования, основанных на выявлении фрагментов генома бактерии P. multocida и M. haemolytica, в частности, полимеразной цепной реакции, которая позволяет обнаруживать и идентифицировать микроорганизмы непосредственно в пробах биологического материала, смешанных или чистых культурах.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлась биологическая характеристика бактерий семейства Pasteurellaceae, разработка способа их генетической типизации с помощью ДНК-технологий и изучение частоты выявления у крупного рогатого скота в хозяйствах по производству молока при вспышках респираторных болезней.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить распространение болезней крупного рогатого скота, протекающих с участием бактерий сем. Pasteurellaceae, в молочных хозяйствах Сибири с наличием импортного скота. Изучить основные культурально-морфологические, биохимические и патогенные свойства бактерий, выделенных при вспышках респираторных болезней.
-
Разработать способ генетической типизации бактерий семейства Pas-teurellaceae на основе мультиплексной ПЦР, определить ее чувствительность и специфичность, а также - влияние сроков хранения проб биоматериала от животных при различных температурах на пригодность к исследованию в ПЦР.
-
Провести генотипирование выделенных и охарактеризованных культур бактерий с помощью мультиплексной ПЦР, определить ее эффективность на различных этапах бактериологической диагностики. Изучить частоту выявления различных генотипов бактерий в производственных условиях у больных животных. Определить экономическую эффективность ПЦР.
Научная новизна работы. Установлено широкое распространение болезней КРС, протекающих с участием бактерий сем. Pasteurellaceae и их ведущая роль в этиологии массовых респираторных заболеваний телят в хозяйствах Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства, особенно с наличием завозного скота. При помощи общепринятых методов бактериологической диагностики выделены и охарактеризованы 67 культур бактерий. Разработан метод одновременного выявления и дифференциации геномов пяти серо-типов P. multocida и M. haemolytica А1 с помощью мультиплексной ПЦР, показана его высокая диагностическая и экономическая эффективность. Определено место ПЦР в системе бактериологической диагностики пастереллезов КРС. Новизной обладают также данные по определению влияния сроков хранения генетического материала бактерий на пригодность к исследованию в ПЦР. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии циркуляции бактерий P. multo-cida генотипов В, Е и F среди крупного рогатого скота в Сибири.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как дают возможность расширить научные знания относительно роли различных генотипов бактерий сем. Pasteurellaceae в этиологии респираторных болезней КРС на молочных комплексах, особенно с наличием импортного скота. Они могут быть
использованы при дальнейшем изучении эпизоотологии, патогенеза болезней, вызываемых этими бактериями и смешанных вирусно-бактериальных инфекций, протекающих по синергетическому типу. Результаты создают перспективы использования мультиплексной ПЦР для экспресс-диагностики и генотипиро-вания бактерий сем. Pasteurellaceae с целью объективной комплексной оценки эпизоотической ситуации и оптимизации противоэпизоотических мероприятий на крупных молочных комплексах, в том числе – для решения вопроса о специфической профилактике болезней. Кроме того, они расширяют научные знания относительно циркуляции различных генотипов бактерий среди высокопродуктивных животных. Использование мультиплексной ПЦР может быть полезным в дальнейшем при изучении длительности функционирования генов вирулентности бактерий сем. Pasteurellaceae.
Методология и методы исследования. Методологическая основа исследований – анализ и синтез информации по изучению распространения болезней, вызываемых бактериями сем. Pasteurellaceae в Сибири, представленной в отечественных и зарубежных источниках литературы, а также полученной в экспериментальных условиях. Для достижения поставленной цели изучены основные культурально-морфологические, биохимические и патогенные свойства бактерий, выделенных при вспышках респираторных болезней, разработан метод генетической типизации культур бактерий сем. Pasteurellaceae, с помощью мультиплексной ПЦР.
В работе использованы следующие методы исследований: бактериологический, молекулярно-генетический.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Результаты изучения распространения болезней крупного рогатого
скота, протекающих с участием бактерий сем. Pasteurellaceae в хозяйствах ре
гиона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства, нали
чием импортного скота и без него, характеристика выделенных культур.
2. Результаты разработки и применения мультиплексной ПЦР в экспери
ментальных и производственных условиях для изучения частоты выявления и
генотипирования бактерий P. multocida и M. haemolytica.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждается большим объемом исследований, проведенных в динамике с 2010 по 2013 гг., анализом ветеринарной отчетности по регионам Сибири, изучением частоты выявления различных генотипов бактерий в экспериментальных и производственных условиях, а также статистической обработкой полученных цифровых данных.
Материалы диссертационной работы доложены на международных научно-практических конференциях: «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011), «Аграрная наука – с.-х. производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии» (Петропавловск, 2012), «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» (Щелково, 2012), «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых» (Краснообск, 2012) и на международной выставке «Агрорусь 2013» (Санкт-Петербург, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки Российской Федерации («Российский ветеринарный журнал», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»).
Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке методического пособия «Болезни крупного рогатого скота, вызываемые бактериями семейства Pasteurellaceae», утвержденного подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 22 апреля 2013 г.).
Результаты работы используются в учебном процессе для студентов 4-5 курсов по специальности «Ветеринария» в ФГОУ ВПО «Красноярский государственный аграрный университет», а также при разработке новых лекций для студентов 2 курса, обучающихся по специальности 110501 – ветеринарно-санитарная экспертиза, направление подготовки 62- бакалавриат в ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет», внедрены в практику отдела бактериологии ФГБУ «Новосибирская МВЛ» и использованы при проведении совещаний и семинаров со специалистами Ужурского района Красноярского края.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы, списка сокращений и приложения. Работа иллюстрирована 13 рисунками и 15 таблицами. Список литературы включает 294 источника, в том числе 184 зарубежных.
