Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время в России возрастает удельный вес хозяйств по производству молока. В некоторые из них осуществляется ввоз высокопродуктивного скота из других стран. Высокая молочная продуктивность коров часто сопровождается нарушением обмена веществ, что приводит, в частности, к активизации различных инфекционных агентов (А.Г. Шахов и соавт., 2000; Ю.Н. Федоров, 2006). Существуют также молочно-товарные фермы, в которых концентрация животных и их продуктивность бывают разными, а ввод новых животных ограничен. Учитывая существование различных по направлению, численности, концентрации и продуктивности животных хозяйств, эпизоотическая ситуация в них по инфекционным болезням может различаться.
Широкое распространение в молочных хозяйствах получили респираторные болезни животных (О.Г. Петрова и соавт., 2002; К.П. Юров и соавт., 2003; Т.И. Глотова, 2006; М.И. Гулюкин и соавт., 2007; J. Kampa et al., 2009; K.A. Woodbine, 2009; J.F. Ridpath, 2010).
Эти болезни, как правило, протекают с участием нескольких возбудителей, синергетическое взаимодействие которых приводит к усилению тяжести инфекционного процесса (Н.Н. Крюков и соавт., 1984; В.А. Мищенко и соавт., 2000; Н.Ю. Басова, 2002; А.Г. Глотов и соавт., 2008; Н.Р. Будулов, 2009; D.G. Bryson, 2000; K. A. Brogden et al., 2002).
Одним из этиологических агентов данной патологии является респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота (РСВ КРС), относящийся к семейству Paramyxoviridae, роду Pneumovirus. Во многих зарубежных странах его относят к числу наиболее важных патогенов молочного скота (L.E. Larsen, 2000; S. Hagglund, 2005; C. Luzzago et al., 2010; B.W. Brodersen, 2010).
Первые сообщения о РСИ КРС в нашей стране относятся к 1975 году (В.В. Гуненков и соавт., 1975). Изучению болезни и разработке средств и методов диагностики были посвящены работы Г.А. Халенева (1976),
Г.Д. Метревели (1983), Т.М. Кочиш (2004), И.Н. Матвеевой (2008) и других.
Несмотря на относительно высокую степень изученности многих вирусных болезней, в нашей стране данных, касающихся роли этого возбудителя в возникновении респираторных болезней, в том числе в ассоциациях с другими вирусами, недостаточно. Изучение этой инфекции длительное время сдерживалось из-за высокой лабильности вируса и слабой его способности к размножению в культурах клеток, что, в свою очередь препятствовало разработке диагностических препаратов. Поэтому многие вопросы, касающиеся диагностики, особенностей эпизоотической ситуации, возрастной восприимчивости животных к инфицированию вирусом, характера проявления болезни в молочных хозяйствах в зависимости от их специализации и уровня молочной продуктивности коров остаются открытыми.
Цель и задачи исследований. В связи с этим целью работы являлась разработка эффективных способов серологической и вирусологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота и изучение их роли при комплексной оценке особенностей проявления болезни в современных условиях ведения молочного животноводства, в том числе в аспекте смешанных инфекций, протекающих с участием других вирусов и условно-патогенных бактерий.
Для достижения указанной цели были поставлены задачи:
1. Определить и отработать оптимальные параметры выделения, типирования и культивирования РСВ КРС в различных культурах клеток с целью получения антигена, а также – изготовить и испытать эффективность экспериментальных серий эритроцитарного диагностикума в РНГА для выявления антител к вирусу.
2. Изучить пригодность ОТ-ПЦР для типирования вируса в лабораторных условиях, определить ее значение в диагностике болезни у крупного рогатого скота, выяснении роли вируса в этиологии массовых респираторных болезней, а также выявлении наиболее восприимчивых половозрастных групп животных в молочных хозяйствах различного профиля, с учетом наличия импортного и местного скота.
3. С использованием серологического и молекулярного методов исследований провести комплексный анализ особенностей проявления респираторно-синцитиальной инфекции в современных условиях при различных эпизоотических и хозяйственных ситуациях, в том числе в ассоциации с другими вирусными и бактериальными агентами.
Научная новизна. Выделен штамм вируса К-18, депонированный в коллекции микроорганизмов ФГУ ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под наименованием «Штамм вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота К-18, V-406». Подана заявка на получение патента на изобретение РФ № №2010134476 от 17.08.2010 г. «Метод первичной изоляции штаммов вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, штамм вируса Bovine Respiratory Syncitial Virus для изготовления диагностических препаратов».
Новизной обладают данные по изучению чувствительности первично-трипсинизированных и перевиваемых (гомологичных и гетерологичных) линий культур клеток к РСВ КРС. Подобраны и рекомендованы для практического использования наиболее чувствительные культуры клеток. Определены оптимальные условия культивирования, обеспечивающие максимальное накопление вируса. Показана чувствительность к вирусу новой перевиваемой линии культуры клеток ТЭБ, рекомендованной для его выделения из проб биоматериала от животных.
Отработаны методы ранней индикации, контроля размножения и учета инфекционной активности вируса в чувствительных культурах клеток. В том числе показано преимущество ОТ-ПЦР перед традиционными методиками выявления и титрования вируса: цитопатогенное действие (ЦПД); методы бляшкообразующих единиц (БОЕ) и фокусообразующих единиц (ФОЕ); цитоморфологические исследования и электронная микроскопия. Установлены сроки хранения вируссодержащей суспензии и выделенной РНК вируса при различных температурных режимах. Изучена возможность дальнейшего использования штаммов вируса PC-Б и К-18 для изготовления эритроцитарного диагностикума. Показано, что чувствительность культур клеток к вирусу имеет «штаммовую» зависимость. Разработан лабораторный регламент культивирования вируса с целью изготовления специфического эритроцитарного антигена для серологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, овец и коз в РНГА.
С помощью серологических и молекулярных методов исследований показано широкое распространение РСИ КРС в Российской Федерации, а также в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства. При помощи ОТ-ПЦР выявлены наиболее восприимчивые к инфицированию вирусом половозрастные группы животных. Выявлены особенности эпизоотической ситуации по РСИ КРС, а также смешанным вирусно-бактериальным болезням в условиях промышленного молочного животноводства Сибири с наличием или отсутствием импортированного скота. Изучена частота проявления болезни в зависимости от наличия сопутствующих вирусных инфекций (инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея, аденовирусная инфекция и других), а также от некоторых эпизоотологических и хозяйственных факторов. Впервые показана зависимость частоты инцидентности болезни в крупных молочных хозяйствах от уровня серопозитивности и наличия животных, персистентно инфицированных вирусом ВД-БС КРС. Выявлены и изучены ассоциации вирусов и бактерий, возникающие при вспышках массовых респираторных болезней, протекающих у крупного рогатого скота с участием РСВ КРС. Изучена частота выявления вируса в моноварианте и в ассоциациях с бактериями семейства Pasteurellacceae.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты создают перспективы использования серологического и вирусологического методов диагностики РСИ КРС в производственных условиях с целью объективной комплексной оценки эпизоотической ситуации и для оптимизации противоэпизоотических мероприятий в хозяйствах с интенсивным типом ведения животноводства, в том числе решении вопроса о специфической профилактике болезни.
Кроме того, они расширяют научные знания относительно спектра чувствительных культур клеток к РСВ КРС, биологических свойств и роли вируса в этиологии респираторных болезней крупного рогатого скота на крупных молочных комплексах. Комплекс диагностических методов исследований может использоваться также при дальнейшем изучении эпизоотической ситуации, патогенеза РСИ КРС и смешанных вирусных и вирусно-бактериальных инфекций, протекающих по синергетическому типу.
Внедрение полученных результатов. Материалы диссертации использованы при разработке научно-методических рекомендаций и положений:
- «Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота», утвержденных подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 26 января 2010 г.).
- «Вирусные и вирусно-бактериальные респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота», утвержденных научно-техническим советом Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Красноярский государственный аграрный университет" (протокол № 2 от 14 декабря 2010 г.).
- «Стратегия общих и специальных мероприятий при респираторных болезнях молодняка крупного рогатого скота вирусно-бактериальной природы», утвержденных научно-техническим советом Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Красноярский государственный аграрный университет" (протокол № 2 от 14 декабря 2010 г.).
- «Методы молекулярной биологии и их использование в диагностике вирусных болезней крупного рогатого скота», утвержденных подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 11 февраля 2011 г.).
- «Индикация и идентификация респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота в культурах клеток», утвержденных подсекцией "Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока" отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 1 от 11 февраля 2011 г.).
- «Профилактика и лечение вирусных респираторных болезней молодняка крупного рогатого скота", утвержденных научно-техническим советом Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Красноярский государственный аграрный университет" (протокол № 4 от 20 апреля 2011 г.).
Основные положения диссертационной работы использованы при разработке научно-технической документации на:
1. Тест-систему для серологической диагностики респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота, овец и коз в РНГА (ТУ-10-19-162-91).
2. Тест-систему для выявления вируса респираторно-синцитиальной инфекции крупного рогатого скота методом полимеразной цепной реакции» (Свидетельство о Госрегистрации № ПВР-1-8.9/02499).
Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены на: Всесоюзной научно-практической конференции «Интенсификация сельскохозяйственного производства в условиях радикальной экономической реформы», Сумы, 1989; Научной конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ «Наука – сельскохозяйственному производству», Красноярск, 1993; Научной конференции профессорско-преподавательского состава КрасГАУ «Наука – сельскохозяйственному производству», Красноярск, 1995; ХI Международном симпозиуме «Реконструкция гомеостаза», Красноярск, 1998; «Актуальные проблемы ветеринарного обеспечения животноводства Сибири», Новосибирск, 2006; Международной школе – конференции «Социально-экологические проблемы природопользования в Центральной Сибири», Красноярск, 2008; Всероссийской научно-практической конференции ФГОУ ВПО КрасГАУ «Инновации в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития», Красноярск, 2009; Межрегионарной научно-практической конференции «Аграрно-экономическая наука республики Тыва: основные результаты и перспективы», Кызыл, 2009; Международной конференции «Проблемы современной аграрной науки» ФГОУ ВПО КрасГАУ, Красноярск, 2009; Международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 40-летию ВНИТИБП, Московская область, Щелковский район, поселок Биокомбината, ВНИТИБП, 2009; Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина. Современные проблемы и перспективы развития», Саратов, 2010; Международной научно-практической конференции «Современные научно-практические достижения в ветеринарии», Киров, 2010; IV Международной конференции молодых ученых «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых», Новосибирская область, п. Краснообск, 2010; Всероссийской очно-заочной научно-практической конференции «Инновация в науке и образовании: опыт, проблемы, перспективы развития», Красноярск, 2010; Международной научно-практической конференции «Научные основы улучшения ветеринарного благополучия и продуктивности сельскохозяйственных животных», Кызыл, 2010; XIII Международной научно-практической конференции «Аграрная наука - сельскохозяйственному производству Монголии, Сибири и Казахстана», Улаанбаатар, 2010; Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экономического развития и обеспечения безопасности в области ветеринарии», Троицк, 2010; Международной заочно научной конференции «Проблемы современной аграрной науки», Красноярск, 2010; Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня основания Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока «Актуальные вопросы ветеринарной медицины Сибири», Новосибирская область, п. Краснообск, 2010; VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010», Москва, 2010.
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 47 научных работ, в том числе 20 – в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации («Ветеринария», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Вестник КрасГАУ», «Достижения науки и техники АПК», «Аграрный вестник Урала», «Сельскохозяйственная биология»).
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 330 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов исследований, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 33 рисунками. Список литературы включает 486 источников, из них 135 отечественных и 351 зарубежных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Результаты разработки и изучения эффективности серологического и молекулярного методов диагностики РСИ КРС в экспериментальных и производственных условиях;
2. Эффективность усовершенствованных методов диагностики РСИ КРС при комплексной оценке особенностей проявления болезни в различных эпизоотических и хозяйственных условиях, в том числе в ассоциациях с другими вирусами и условно-патогенными бактериями в хозяйствах региона Сибири с интенсивным типом ведения молочного животноводства с наличием импортного скота и без него.
