Введение к работе
Актуальность темы исследования. Болезнь, вызываемая метапневмовирусом птиц, зарегистрирована во многих регионах мира, как у индеек, так и у кур всех возрастов [1,3,9]. Первичная вирусная инфекция часто осложняется вторичной, бактериальной инфекцией, и заболевание протекает со сложной симптоматикой. Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц причиняет серьезный экономический ущерб из-за общего ослабления организма, спровоцированного поражением верхнего отдела респираторного тракта, и приводит к гибели, снижению мясной и яичной продуктивности взрослой птицы [6,7]. Впрочем, этот вирус может быть вовлечен в мультифакторную болезнь, как, например, синдром большой головы, что крайне осложняет диагностику заболевания.
Многообразие подтипов А, В, С, D возбудителя и вирулентных свойств метапневмовируса, также затрудняет правильную своевременную постановку диагноза и не позволяет дать оценку этиологической роли вируса в патогенезе и течении болезни [6].
Основными трудностями при выделении возбудителя является достаточно короткий период персистенции и ограниченный тропизм вируса в организме птицы [5,8].
Поскольку клинические признаки болезни и патологоанатомические изменения при МПВИ птиц непатогномоничны, основная роль в постановке диагноза принадлежит лабораторным методам.
Степень разработанности темы. Большинство методов, позволяющих выявить вирус в организме птицы, основано на иммуноферментном анализе [2,10].
Среди большого числа модификаций ИФА наибольшее распространение получил «сэндвич» вариант ИФА и ОТ-ПЦР для экспресс диагностики МПВИ [2]. Учитывая широкое распространение в Российской Федерации метапневмовируса птиц подтипов А и В и масштабное производство биологических препаратов из данных подтипов, необходимо разработать чувствительный и специфический метод индикации антигена метапневмовируса в патологическом материале и исходном сырье при изготовлении и контроле вакцин и диагностикума.
Цель и задачи. Целью настоящей работы явилась разработка антигена метапневмовируса птиц в биологических материалах на основе «сэндвич» варианта ИФА.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
получить иммуноспецифические компоненты тест-системы для выявления антигена метапневмовируса птиц в биологических материалах;
определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции;
дать оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы;
с помощью разработанного «сэндвич» варианта ИФА провести исследования содержания антигена метапневмовируса птиц в патологическом материале и в вируссодержащем сырье для изготовления вакцины;
разработать методические положения по определению содержания антигена МПВ птиц в биологических материалах с помощью тест-системы на основе «сэндвич» варианта ИФА.
Научная новизна. Впервые в качестве экспресс диагностики МПВИ птиц разработан «сэндвич» вариант ИФА с использованием отечественных препаратов и реактивов. Выделены антиметапневмовирусные IgG (Н+L) из гипериммунной сыворотки крови цыплят, получен конъюгат [анти-МПВ IgG(Н+L), меченые пероксидазой хрена]. Определены оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции. Дана сравнительная оценка «сэндвич» варианта ИФА с методом титрации в клетках Vero. Изучены сроки выявления антигена метапневмовируса в клетках Vero, а также в органах и тканях у экспериментально зараженных цыплят. Показано, что данные ИФА имели высокий коэффициент корреляции (r= 1,0) с результатами титрации вируса в клетках Vero.
С помощью тест-системы проведено исследование патологического материала из 2 птицеводческих хозяйств и выявлен антиген метапневмовируса птиц. Установлена высокая чувствительность и специфичность разработанного «сэндвич» варианта ИФА при выявлении антигена метапневмовируса в биологическом сырье, предназначенном для изготовления вакцины.
Теоретическая и практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработан высокоэффективный экспресс-метод выявления и количественного определения антигена МПВ птиц в патологическом материале и сырье, предназначенном для производства вакцины на основе «сэндвич» варианта ИФА.
Разработаны ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии и утверждены академиком-секретарем А.М.Смирновым Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии «Методические положения по выявлению антигена метапневмовируса птиц в биологических материалах «сэндвич» вариантом иммуноферментного анализа» от 10. 06. 2013 г.
Методология и методы исследования
Вирус: производственный вакцинный штамм VC-03 подтипа B метапневмовируса птиц , Nemovak Rhone Merilux (Франция).
Вирус поддерживали в клетках Vero и хранили при температуре минус 200С
Инкубационные яйца, эмбрионы и цыплята: яйца СПФ кур, фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия) , 200 штук; СПФ цыплята, инкубированные в ГНУ ВНИВИП, 50 голов.
Культуры клеток: перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки, клетки Vero ( институт гриппа АМН, Санкт-Петербург).
Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы: питательная среда Игла МЕМ или ДМЕМ, жидкая, с L-глутамином; питательная среда № 199, жидкая, с L-глутамином; сыворотка крови плодов коровы; трипсина раствор, 0,25% фирмы «US BIO»; версена раствор, 0,02%; Хенкса раствор. Питательные среды и растворы из полнокомпонентной смеси фирмы «Hyclone»; альбумин бычий сывороточный, чистота > 95; 0,05М карбонат-бикарбонатный буфер; 0,01М фосфатно-солевой буфер; 0,05 М фосфатно-цитратный буфер; натрия хлорид (NаСI), х.ч.; перекись водорода, ОАО «Татхимфармпрепараты»; ортофенилендиамин (ОФД), фирмы Sigma; твин 20 (Р7949), фирмы Sigma.
Титрование вируса по цитопатогенному действию (ЦПД) проводили на клетках Vero методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями. Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench H. и выражали в lg ТЦД50 в 1.0 см3 [4].
Реакция нейтрализации (РН). В основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в руководстве по вирусологии [4].
Очистку вируссодержащего материала проводили методом гельхроматографии на макропористом стекле (МПС), обработанном поливинилпирролидоном (ПВП).
Выделение иммуноглобулинов G (IgG). Исходным сырьем для получения специфических IgG служила иммунная сыворотка крови цыплят. Осаждение сывороточных иммуноглобулинов проводили 30% раствором сернокислого аммония, с последующей очисткой на колонке с Sephadex G-200.
Иммуноферментные конъюгаты получали модифицированным методом периодатного окисления [11]. Очистку конъюгатов проводили методом гельфильтрационной хроматографии на колонке с Sephadex G-200, уравновешенной 0,01 М фосфатно-солевым буфером рН 7,2 (+ 0,02 М NaCl). Использовали фракции со значениями RZ = 0,4—0,6. Активность конъюгата проверяли в прямом «сэндвич» варианте ИФА со специфическим иммуноглобулином.
«Сэндвич» вариант иммуноферментного анализа. Для сенсибилизации поверхности лунок планшет для ИФА использовали очищенные антиметапневмовирусные иммуноглобулины G в оптимальной концентрации, разведенные в 0,05М карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,5-9,7. Иммобилизацию специфических IgG на поверхности лунок полистироловых планшет осуществляли в течение 16-18 часов при температуре 4-8С. Несвязавшиеся с поверхностью полистирола специфические IgG отмывали трехкратно в объеме 0,2 см 0,01М калий-фосфатным буфером, содержащим 0,5М раствор хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией твина-20 (ФБРТ), рН 7,0-7,4. Все реакции на планшетах проводили в объеме 0,1 см. Антигенсодержащий материал и конъюгат инкубировали в ФСБ рН 7,2+ 0,15 M NaCl + 0,1% твин-20 + 0,2% бычий сывороточный альбумин в течение 2 часов при 37C. Для отмывки планшет применяли буфер ФБРТ в объеме 0,2 см. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин + 0,01% Н2О2 в 0,05 М фосфатно-цитратном буфере рН 4,9-5,0. Реакцию останавливали 0,05 см 10% раствора H2SO4 через 15-20 мин после внесения субстрата и оптическую плотность измеряли на иммуноферментном анализаторе «Униплан» при длине волны 492 нм.
Статистическая обработка данных. Все полученные результаты обработаны статистически. Использовали общепринятые методы вариационной статистики, применяя компьютерную программу Microsoft Excel.
Положения, выносимые на защиту:
тест-система, разработанная на основе «сэндвич» варианта ИФА для выявления и количественного определения антигена метапневмовируса птиц в биологических материалах, включающая обоснования оптимальных концентраций и условий взаимодействия компонентов и способ выражения концентрации антигена;
результаты сравнительной оценки выявления антигена метапневмовируса птиц в клетках Vero в «сэндвич» варианте ИФА и методом титрации;
результаты выявления антигена метапневмовируса в клетках Vero и в органах и тканях у экспериментально зараженных цыплят;
данные эпизоотологического обследования птицехозяйств РФ.
Степень достоверности и апробация результатов.
Научные положения, выводы и практические рекомендации, сформулированные в диссертационной работе научно-обоснованы, достоверны и вытекают из результатов собственных исследований. Исследования проведены на большом фактическом материале с использованием современных вирусологических, биохимических и серологических методов исследований.
По результатам научных исследований опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, и 5 статей опубликованы в сборниках материалов конференций и конгрессов. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2011-2013гг.), на международных агропромышленных конгрессах (Санкт-Петербург, 2011,2013г.); XVII международной конференции ВНАП (Сергиев Посад, 2012 г.); XVIII Congress World Veterinary Poultry Associatio French branch (GF-AMVA) 19-23 august 2013, Nantes France.
Диссертация изложена на 115 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение, основная часть, заключение, список сокращений, список литературы и приложения.
Диссертация иллюстрирована 5 таблицами, 11 рисунками и 6 формулами. Список литературы включает 238 источников, из которых 181 зарубежных.
