Непрямой метод иммуноферментного анализа в диагностике метапневмовирусной инфекции птиц Дмитриев, Денис Валерьевич

Содержание к диссертации

Введение

1. Обзор литературы 12

1.1. Метапневмовирусная инфекция птиц: распространение и экономический ущерб, вызываемый этой болезнью 12

1.2. Характеристика рода М арпеитоукш семейства Рагатухоутске 14

1.3. Эпизоотологические особенности метапневмовирусной инфекции птиц 20

1.4. Иммунопатогенез болезни 23

1.5. Клинические признаки и патологоанатомические изменения у птиц при метапневмовирусной инфекции 25

1.6. Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц 26

1.7. Профилактика и меры борьбы с метапневмовирусной инфекцией птиц 33

1.8. Заключение 35

2. Собственные исследования 36

2.1 Материалы и методы 37

2.1.1. Материалы исследований 37

2.1.2. Методы исследований 39

2.2. Результаты собственных исследований 44

2.2.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа 44

2.2.1.1. Получение очищенного метапневмовируса птиц 44

2.2.1.2 Получение положительной сыворотки крови кур 46

2.2.1.3 Получение отрицательной сыворотки крови кур 48

2.2.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления специфических антител к метапневмовирусу птиц 49

2.2.2.1 .Определение оптимальных концентраций и условий взаимодействия компонентов 49

2.2.2.2. Определение диагностического титра сыворотки в ИФА 50

2.2.2.3. Способ опосредованного расчета титра антител 52

2.2.2.3.1. Определение коэффициентов линейной регрессии и допустимых значений оптической плотности контрольных сывороток 52

2.2.2.3.2.Определение пороговых показателей реакции, разграничивающих специфическое и неспецифическое взаимодействие 56

2.2.2.4. Оценка чувствительности и специфичности разработанной тест-системы 56

2.2.3. Практическое применение разработанной иммуноферментной тест- системы 59

2.2.3.1. Данные эпизоотологического обследования птицеводческих хозяйств 59

2.2.3.2. Серологический мониторинг на метапневмовирусную инфекцию, птиц в птицехозяйствах различных регионов РФ 66

3. Обсуждение результатов исследований 68

4. Выводы 78

5. Практические предложения 79

6. Список литературы 80

7. Приложение 103

• Характеристика рода М арпеитоукш семейства Рагатухоутске
• Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц
• Оценка чувствительности и специфичности разработанной тест-системы
• Серологический мониторинг на метапневмовирусную инфекцию, птиц в птицехозяйствах различных регионов РФ

Введение к работе

: . Актуальность, проблемы. Болезнь, вызываемая; метапневмовирусом птиц, зарегистрирована во многих регионах мира, как у бройлеров, так и* у несушек (В.Н.Ирза с соавт., i.,2003, 2005; И.А.Борисова,. A.B. Бориов, 2009; Naylor et ah, 1997; Cavanagh,.1999; Jones, 2004). Первичная вирусная инфекция часто осложняется вторичной, бактериальной инфекцией, и заболевание протекает со сложной симптоматикой. Метапневмовирусная инфекция (МПВИ) птиц причиняет серьезные экономические потери из-за общего ослабления организма, спровоцированного поражением верхнего отдела респираторного тракта, и ведет к снижению мясной и яичной продуктивности ; ! j i взрослой птицы (Naylor & Jones, 1993; Cook, 2000; Cook & Cavanagh; 2002). Впрочем, этот вирус может быть вовлечен в мультифакторную болезнь, как, . например, синдром большой головы, что крайне осложняет диагностику заболевания. :.

Многообразие подтипов А, В, С, D возбудителя и вирулентных свойств мётапневмовируса создают значительные сложности как в разработке, так и в эффективном использовании вакцин, . а также затрудняет правильную своевременную постановку fj диагноза и не позволяет .дать оценку этиологической роли вируса в|патогенезе и течении болезни. _: . В.системе мер, направленных на успешную борьбу с МПВИ, создание- высокочувствительных и специфичных методов серологической диагностики . имеет большое научное и практическое значение. ;". Разработаны различные аналитические методики для обнаружения антител к метапневмовирусу птиц с применением иммунофлуоресценции (Jones, et al., 1986; Jones et al., 1986, 1987; Majo et al., 1995), реакции, нейтрализации (В axter-Jones {et al., 1987; Gough, Collins, 1989; Seal, 2000), ELISA (ИФА) (M. А. ВолкЬва с соавт., 2003; Grant et al., 1987; Chettle, Wyeth,.. 1988). Однако, ;' из всех перечисленных методик, иммуноферментный анализ (ИФА) является наиболее подходящим для тестирования сывороток от различных видов птиц (Cook, Cavanagh, 2002).

Учитывая очевидную перспективность ИФА, разработка отечественной иммуноферментной тест-системы для выявления антител к вирусу МПВИ птиц в сыворотках крови кур является, безусловно, актуальной. Быстрота получения, воспроизводимость и автоматизированный учет результатов реакции, возможность стандартизации условий постановки анализа делают ИФА наиболее эффективным, удобным, экономичным и выгодным методом для мониторинговых исследований при изучении эпизоотологической ситуации по этой болезни в птицехозяйствах.

Цель и задачи работы. Целью исследований было разработать тест- систему на основе непрямого метода иммуноферментного анализа для выявления антител к метапневмовирусу в сыворотках крови кур и провести эпизоотологическое обследование некоторых птицеводческих хозяйств на метапневмовирусную инфекцию.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи: получить высокоочищенный антиген метапневмовируса птиц для ИФА и специфическую гипериммунную сыворотку кур; определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия компонентов реакции; установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции и разработать способ опосредованного расчета титров антител при тестировании проб в одном разведении; дать оценку чувствительности и специфичности разработанной тест- системы; провести эпизоотологическое обследование в птицехозяйствах яичного и мясного направления; провести серологический мониторинг на метапневмовирусную инфекцию птиц с применением разработанной тест-системы; разработать Методические указания по лабораторной диагностике МПВИ птиц.

Научная новизна. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления количественной оценки специфических антител к метапневмовирусу подтипа В при тестировании сывороток крови кур в одном разведении. Отработан метод получения высокоочищенного антигена метапневмовируса птиц, определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия, а также установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, разработан способ опосредованного расчета титра антител при тестировании проб в одном разведении. Дана сравнительная оценка непрямого метода ИФА с реакцией нейтрализации при МПВИ птиц. Установлена высокая чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест- системы для выявления антител в сыворотках крови кур к метапневмовирусу птиц.

Проведено эпизоотологическое обследование 6 птицеводческих хозяйств. Установлено ассоциированное течение МПВИ птиц с бактериальными и вирусными болезнями и показан синергизм во взаимодействии между возбудителями.

Практическая значимость работы. Полученные результаты научных исследований использованы при разработке нормативных документов: стандарта (СТО), инструкции по применению набора.

Практическая ценность разработанного диагностического набора для выявления антител к метапневмовирусу кур подтверждается положительными результатами широких производственных испытаний при проведении серологического контроля за распространением метапневмовирусной инфекции птиц, оценки эффективности иммунизации поголовья против данной болезни; ретроспективной диагностики МПВИ птиц по приросту уровня специфических антител.

Утверждены Россельхозакадемией Методические указания по лабораторной диагностике метапневмовирусной инфекции птиц.

Основные положения, выносимые на защиту: тест-система, разработанная на основе непрямого метода ИФА для выявления и оценки титров антител к метапневмовирусу птиц в сыворотках крови кур при тестировании проб в одном разведении, включающая обоснования оптимальных концентраций и условий взаимодействия компонентов, пороговых показателей реакции и способ опосредованного расчета титра антител; результаты сравнения разработанной тест-системы и реакции нейтрализации; данные эпизоотологического обследования птицехозяйств РФ; результаты серологического мониторинга на метапневмовирусную инфекцию птиц с применением разработанной тест-системы.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2007-2009гг.), на научно-практическом конгрессе «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (24-25 августа, Санкт-Петербург, 2007г.); на второй всероссийской научно-практической конференции «Ветеринарная медицина - теория, практика и обучение» (1-2 ноября, Санкт-Петербург, 2007); на научно- практической конференции «Новое в диагностике и профилактике болезней птиц» (3-4 июня, Санкт-Петербург, г. Ломоносов, 2008 г.).

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы выполнены совместно с ведущим научным сотрудником Никитиной Н. В., за что автор выражает ей сердечную благодарность.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано пять научных работ.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение.

Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 6 рисунками. Список литературы включает 167 источников, из которых 144 зарубежных.

1. Обзор литературы

1.1. Метапневмовирусная инфекция птиц: распространение и экономический ущерб, вызываемый этой болезнью

Метапневмовирусная инфекция - респираторная болезнь, характеризующаяся воспалительными процессами верхних дыхательных путей (носовых ходов, трахеи), инфраорбитальных синусов, сопровождается затрудненным дыханием, хрипами, чиханием, выделениями из носа (Jones, 1996). Болезнь у разных видов птиц проявляется в виде двух респираторных синдромов: у индеек - ринотрахеит (turkey rhinotracheitis - TRT); у цыплят и кур - синдром опухшей (большой) головы (swollen head syndrome - SHS) (Cook, Cavanagh, 2002).

Ринотрахеит индеек впервые был отмечен в конце 1970-х гг. в Южной Африке (Buys & Du Preez, 1980) и впоследствии также и у кур (Buys et al., 1989 a, b). Несколько лет спустя о болезни с похожими клиническими признаками сообщили во Франции (Giraud et al., 1986; Picault et al., 1986; 1987 a, b), a затем в Великобритании, где был выделен возбудитель (McDougall & Cook, 1986; Wilding et al., 1986; Wyeth et al., 1986; 1987) и охарактеризован как пневмовирус (Cavanagh & Barrett, 1988).

Болезнь регистрируется во многих европейских странах с развитым птицеводством (Jirjis et al., 2002): в Италии, Испании, Израиле, Венгрии (Lister, Alexander, 1986); в Германии (Hafez, Lohren, 1990; Hafez et al., 1990; Naylor, Jones, 1993); в Нидерландах (Cook et al., 1993), в Японии (Tanaka et al., 1995, 1996), на Американском континенте (Jones, 1996; Alexander, 1997; Senne et al., 1997; Cook et al., 1999; 2000; Seal, 2000); в Азии (Lu et al., 1994).

Первичная вирусная инфекция часто осложняется вторичной бактериальной инфекцией, ведущей в результате к высокой заболеваемости и смертности. Смертность обычно не превышает 1-2%, а заболеваемость 10%. У индеек-несушек или производителей вирус может вызывать существенное падение яичной продуктивности (Naylor & Jones, 1993; Jones, 1996; Cook et al., 2000; Cook, Cavanagh, 2002). Morley & Thompson (1984); Droual &. Woolcock (1994) сообщили о ассоциированном течении SHS с инфекционным бронхитом кур и ньюкаслской болезнью.

В Израиле в 1978 г. клиническое заболевание, сходное с пневмовирусной инфекцией, ассоциированной с МПВ птиц, регистрировали как в переболевших, так и вакцинированных стадах. Обсуждаются вопросы возможности циркуляции различных подтипов возбудителя (Byon-Auboyer et al. 1999; Banet-Noach et al., 2003, 2005)

В 1985 г. в Англии (Уэллсе) наблюдали острое течение болезни у индеек с поражением верхних дыхательных путей, причиной которой оказался пневмовирус (Anon, 1985; Stuart et al., 1989; Naylor, Jones, 1993). В это же время была зарегистрирована болезнь у бройлеров с синдромом опухшей головы. Во всех случаях был изолирован пневмотропный парамиксовирус (Pedersen et al., 2000).

В 1990-1992 гг. болезнь была обнаружена в родительских стадах и у товарных-кур-несушек в ряде стран Азиатско-Тихоокеанского региона (Bell, Alexander, 1990; Hafer et al., 2000). В США в 1996 г. сообщалось о заболевании TRT индеек в штате Миннесота (Jirjis tal., 2000), а в 1997 г. - в штате Колорадо (Collins, Gough, 1988). Колорадский изолят МПВ антигенно (Senne et al., 1998) и генетически (Seal, 1998, 2000; Seal et al., 2000) отличается от европейских изолятов, которые вызывают SHS у кур и TRT у индеек. Заболеваемость у индеек в коммерческих стадах ежегодно колеблется от 36,3 до 54,8%, а потери составляют около 15 млн. долларов в год (Goyal et al., 1999; Shin et al., 2000; Gulati et al., 2001 a, b). В 2004 году серьезные вспышки болезни были зарегистрированы в штатах Висконсин, Айова, Северная Дакота и Огайо (Bennett et al., 2004).

В России МПВИ регистрировали на протяжении последних десятилетий в различных регионах, чаще всего болезнь встречается в бройлерных хозяйствах, преимущественно у кур родительских стад. Отмечается тенденция к увеличению случаев обнаружения антител к метапневмовирусу (МПВ) у птиц яичных пород (А.Б. Сарбасов с соавт., 2003; В.Н. Ирза с соавт., 2003; В.Н. Ирза с соавт., 2005; Б.Б. Трефилов с соавт., 2007).

Из сказанного следует, что МПВИ птиц была и остается актуальной в большинстве стран мира, в том числе и в России.

1.2. Характеристика рода Metapneumovirus семейства Paramyxoviridae

Пневмовирусы птиц являются РНК-содержащими, с несегментированным одноцепочечным негативным геномом, относящимся к семейству Paramyxoviridae подсемейству Pneumovirinae роду Metapneumovirus (Pringle, 1998; Lamb et al., 2000). Геном РНК состоит из восьми генов с их продуктами организованными в следующем порядке: 3 '-N-P-M-F-M2-SH-G-L- 5', с общей длиной от 13134 (AMPV подтип С) до 13378 (HMPV) нуклеотидов (Ishiguro et al., 2004; Lwamba et al., 2005).

Вирус имеет комплексную структуру и покрыт липопротеидной оболочкой, образующейся при выходе вириона. Главным образом образует сферические частицы, симметричные по спиральному типу, которые имеют размеры 80-200 нм. Также могут встречаться плеоморфные вирионы в диаметре 150-200нм и длиной 1000-10000 нм. Спиральный нуклеотид имеет длину 14 нм.

Оболочка напоминает бахрому с поверхностными выступами длиной 13-15 нм, представляющие собой типы шириной 2-3 нм у основания, максимальная 3-5 нм, расстояние между шипами 2-3 нм; включающие гемагглютинин и нейраминидазу (HN) или гемагглютинин (Н), или повехностный гликопротеин (G) и слияния (F-гликопротеин), равномерно ее покрывающие. Отсутствует гемагглютинирующая активность по отношению к эритроцитам цыплят, уток, свиней, крупного рогатого скота и морских CBHHOK(Giraud et al., 1986; Baxter-Jones et al., 1987; Collins a.Gough, 1988; Buys et al., 1989; O'Loan et al, 1992).

Молекулярная масса генома составляет 0,5% от веса вириона и варьирует у рода Pneumovirus в пределах 17-20 кв. Геном обычно мономерный или иногда мультиплоидный, несегментирован и содержит единичную линейную молекулу одноцепочечной РНК, отрицательной полярности, внутренняя последовательность GAA следует за трансляцией стартового сигнала в начале следующего гена. Вирионы могут также содержагь положительную полярную одноцепочечную копию генома. Полная последовательность РНК генома составляет 15200-15900 нуклеотидов.

Пневмовирусы птиц не содержат неструктурных NS генов, что укорачивает его геном на 13,3 кв, а его восемь генов идут в порядке З'-N-P-M- F-M2-SH-G-L-5' - характерные признаки метапневмовируса птиц и человека (Ling, Easton, Pringle, 1992; Yu et al.,1992; Lamb et al.2000). Все гены содержат одну открытую рамку считывания, за исключением М2, котрый имеет две перекрывающихся рамки считывания, кодирующих 2 протеина: М2-1 (184-186 аминокислоты) и М2-2 (71-73 аминокислоты) (Yu et al.,1992).

Вследствие различной генной организации и низкого уровня (40%) идентичности последовательностей по сравнению с пневмовирусом млекопитающих APV был отнесен к новому роду Metapneumovirus в подсемействе Pneumovirinae (Pringle, 1999).

Протеины составляют около 75-80 % от веса частицы. Вирусный геном кодирует структурные и неструктурные образования. Вирионы содержат 7 структурных протеинов, находящихся в нуклеокапсиде, оболочке, мембране и матриксе. Вирусная оболочка включает два встроенных протеина мембраны. Внутренняя структура пневмовируса представлена на рис. 1.

Р протеин

Рис.1. Внутренняя структура пневмовируса птиц (цит. по О.А.Борисова, И.А.Борисова, 2007)

Поверхностный протеин F выполняет функции прикрепления - это протеин объединения. В течение посттрансляционного процесса он синтезируется внутри инфицированной клетки путем разрезания протеина - предшественника для создания вирионных дисульфидносвязанных субъединиц F1 и F2 (aMHH0-Fl-S-S-F2-Kap60Kcmi). Отвечает за объединение с клеткой и гемолитическую функцию (Kapczynski, Sellers,2003), хотя пневмовирусы, в отличии их от других парамиксовирусов, не обладают гемагглютинирующей и нейраминидазной активностью (Collins et al, 1996).

Расщепление F-белка на крупный белок F1 и мелкий F2 опосредует слияние клеток и необходимо для распространения вируса (Collins et al., 1996). Предполагается, что аминотерминальная часть F1 вовлекается в мембранное слияние и является высококонсервативной среди трех типов А, В и С пневмовируса птиц (Naylor et al., 1998; Seal,2000; Seal et al.,2000).

Структура организации генома гусиного пневмовируса (гусиный изолят15а/01) сходна с таковой у штаммов AMPV/C от индеек. Однако вирус имел большой G ген, самый крупный как среди пневмовирусов, так и метапневмовирусов (Bennett et al.2004). Размер G-белка 15а/01 (585 аминокислот) был более чем, в два раза больше, чем размер G-белка других вирусов подтипа С и метапневмовируса человека, и более чем на 170 аминокислот больше, чем размер G-белков других подтипов AMPV.

Подтипы А, В, D AMPV, циркулирующие в Европе имеют сопоставимые размеры G-белков (319, 414 и 389 аминокислот соответственно) и вызывают сопоставимые по степени тяжести болезни; включая патологические изменения в ресничках слизистой носовых раковин и развитие синдрома опухшей головы у кур (Pattison, Chettle, 1989; Gough, 1994; Maharaj, 1994; Shin et al., 2000). Это родство было подтверждено анализом последовательности гена F-белка (Naylor et al., 1998) и более консервативного М-гена (Randhawa et al., 1996). Хотя различные изоляты APV были антигенно схожими, но серологически могли разделяться, на две отдельные группы (Cook et al, 1993; Collins et al., 1993). Эта разница в вирусных белках объясняется различиями, обнаруживаемыми при использовании для серологических исследований разных антигенов (Senne et al., 1997).

Пространственная структура пневмовируса представлена на рис.2.

Протеин прикрепления

Липидная мембрана

Протеин слияния

Матриксный протеин комплекс

Рис. 2. Пространственная структура вируса с основными комплексными соединениями (цит. по О.А.Борисова, И.А.Борисова, 2007)

Оболочечный малый гидрофобный протеин SH или А - небольшой протеин, встроен в мембрану.

Нуклеокапсидный протеин N или NP имеет молекулярную массу около 5000 Да, защищает геном и обладает РНК-связывающей активностью.

Нуклеокапсидный фосфопротеин Р находится в вирионе десятикратном количестве, чем протеин L, имеет молекулярную массу 4-10⁴ - 6-10⁴ Да, полимеразно связан, и возможно имеет шаблонную функцию; модификации в течение посттрансляционного процесса включает фосфорилирование (Dar et al., 2001).

Нуклеокапсидный протеин L большой и является РНК-зависимой РНК- полимеразой, которая обладает каталитической активностью в соединении с протеином Р.

Матриксный протеин М является внутренним негликолизированным протеином мембраны и облицовывает внутреннюю поверхность оболочки (Seal, 1998). Ген белка М является высоконсервативным среди парамиксовирусов (Rima, 1989) и может надежно использоваться для молекулярно- эпизоотологических исследований (Seal et al., 2000). Прогнозируемые М-белки подтипов А и В обладают 89% идентичностью в отношении аминокислотной последовательности. Однако М-белок APV/CO имеет идентичность в отношении белковых последовательностей подтипов А и В только 78 и 77% соответственно (Seal, 1998).

Пневмовирусы состоят из семи структурных и трех неструктурных вирусспецифических белков, два из которых гликолизированы (Pringle, 1985). При исследовании синтеза полипептидов in vitro и in vivo описаны сходные структурные полипептиды и, по крайней мере, два неструктурных белка (Ling, Pringle, 1988).

Неструктурные протеины идентифицируются анализом последовательности и найдено, по крайней мере, б протеинов (С, NS1, NS2, V, SH и М2). Их роль заключается в каталитическом и ферментативном сопровождении процессов транскрипции и трансляции. В добавление к полимеразе вирус кодирует такие ферменты, как РНК-зависимая РНК- транскриптаза, аденил трансфераза, мРНК-гуанилтрансфераза, метилтрансфераза, протеиназа и нейраминидаза. Неструктурные протеины связаны с мембранами (Ahmadian et al., 1999).

Вирионы метапневмовируса состоят из липидов на 20-25% по весу.

Карбогидраты в вирионах представлены как гликопротеины и ~ составляют 6% по весу; это N-основанные гликаны, или О-основанные гликозидные боковые цепочки и содержащие полилактозамин (SH - протеин респираторно-синцитиального вируса).

1.3. Эпизоотологические особенности метапневмовирусной инфекции птиц

На основе изучения заразных болезней возможно своевременное и правильное осуществление профилактических мероприятий и мер борьбы с распространением заразной болезни, что представляет главную практическую задачу эпизоотологии (М. С. Ганнушкин, 1952)

Массовые вспышки метапневмовирусной инфекции (МПВИ) птиц регистрировали преимущественно в весенний и осенний периоды. Вспышки МПВИ у индеек в США показали сезонный характер, около 80% распространения инфекции наблюдалось весной (март - май) и осенью (октябрь — ноябрь), что совпадает с миграцией диких птиц (И. А. Борисова, С. К. Старов, 2006; Jones, 1996; Graham et al., 1999; Shin et al., 2002 a, b, c; Bennett et al., 2004). В соответствии с этой гипотезой РНК МПВ была выделена из носовых ходов воробьев, гусей, ласточек и скворцов, отловленных в Северной части центрального района США (Shin et al., 2000).

В 1992 - 1994гг. в Италии у свободно живущих фазанов были получены положительные результаты на МПВ птиц методом ИФА (Catelli et al., 2001),другие авторы не установили источником распространения МПВ дикими птицами (Jones, 2004).

Впоследствии патогенный МПВ птиц был выделен от диких канадских гусей и контрольных уток, обитающих в пруду в непосредственной близости к ферме с индейками (Shin et al., 2002). По данным Jones (2004) роль диких птиц в распространении возбудителя болезни не установлена.

МПВИ птиц широко распространена и регистрируется у индеек и кур во Франции (Weisman et al., 1988), Великобритании (Anon, 1985; McDougall, Cook, 1986; Williams et al 1991), Италии, Испании, Венгрии (Lister, Alexander, 1986), Германии (Naylor, Jones, 1993), Нидерландах (Cook et al., 1993), Бразилии (Arns, Hafez, 1992), Марокко (Houadfi et al., 1991), Тайване, Израиле (Toquin et al., 1994, Lister, Alexander, 1986), Южной Америке (Jones, 1996),

России (М. А. Волкова с соавт., 2003; В. Н. Ирза с соавт., 2003; И. А. Борисова, С. К. Старов, 2006; Б. Б. Трефилов с соавт., 2007; 2009; И. А. Борисова 2008; И. А. Борисова, А. В. Борисов, 2009).

В природе носителями МПВ птиц являются индейки и куры независимо от возраста (В. А. Капустин, В. Г. Лысый, 2005; Picault et al., 1987). Показана восприимчивость к болезни с проявлением клинических признаков индеек, кур, фазанов (Gough et al, 1988; Catelli et al., 2001; Welchman et al., 2002), цесарок (Peret et al., 2002), страусов (Cadman et al., 1994), уток (Toquin et al., 1999). Голуби и гуси не восприимчивы к МПВ птиц (Collins et al., 1988).

Пневмовирус был выделен у канадских казарок (Branta canadensis) и синекрылых чирков (Anas discons) (Bennett et al., 2002).

Установлена зависимость заболевания от возраста птиц. Наиболее тяжелое течение болезни наблюдали у птиц в возрасте от 1 сут. до 6 недель. У бройлеров клиническая форма болезни обычно наступает в возрасте 4-6 нед., у мясных кур - в возрасте 25-35 нед. (Picault et al., 1987). С увеличением возраста птицы восприимчивость к болезни уменьшается. Не отмечены различия в восприимчвости у разных пород индеек.

Ряд авторов (Lister, Alexander, 1986, Cook et al., 1991; Alexander, 1997) отмечает контагиозность болезни, что подтверждено ими в опытах по контактному заражению птицы. Так, инфекционная природа МПВИ была установлена путем контакта от инфицированных птиц к восприимчивым индюшатам, от дикой птицы к индейке.

Основными источниками возбудителя болезни явились больная, павшая и переболевшая птица, корм, вода и воздух, инфицированные выделениями больной птицы. В стадах птиц болезнь распространяется быстро, и за 2-3 сут. птичник оказывается полностью инфицированным. Механическими переносчиками вируса могут быть обслуживающий персонал, инвентарь, транспорт, оборотная тара, помет, грызуны и кровососущие насекомые. Не исключается вертикальный путь передачи возбудителя через инкубационное яйцо (Alexander, 1997).

Передача вируса при МПВИ птиц осуществляется воздушно-капельным, окулярным и интраназальным путями (Pattison, Chettle, 1989, Rima, 1989, Hafez, 1992, 1993; Majo et al., 1995), при внутривенном инфицировании (через поврежденную кожу) (Rima, 1989, Nakamura et.al., 1998). У кур-несушек проявлялись клинические признаки (нервные явления, синдром SHS), похожие на некоторые из описанных у племенных кур в условиях полевой инфекции.

В условиях эксперимента, инфицированные индейки выделяли вирус в относительно короткие периоды времени, обычно с 3-4 до 9-10 сут. после инфекции, т.е. по большей части 6-7 сут. Кроме того, вирус является оболочечным РНК-содержащим и слабо устойчив вне хозяина. В виду этих фактов, столь быстрое его распространение по всей Англии и Уэльсу (бмес) в 1985 году Stuart et al. (1989) предположил, что этот вирус мог быть занесен мигрирующими птицами и в процесс могут быть вовлечены грузовые автомобили, развозящие корма.

Относительно влияния сопутствующих респираторных патогенов на течение МПВИ птиц, таких как, Bordetella avium, Pasteurella - подобные организмы (Cook et al 1991), Mycoplasma gallisepticum (Naylor et al., 1992) и E.coli (Nakamura et al., 1998), показано, что они удлиняли и осложняли клиническое проявления болезни у индеек.

Предрасполагающими факторами для распространения матапневмовирусной инфекции птиц в хозяйствах являются неудовлетворительное кормление, особенно недостаток в кормах витаминов А и группы В, скученное содержание и недостаточная вентиляция помещений, а также несоблюдение необходимого санитарно-гигиенического режима кормления и содержания (Steven Clark, 1998).

1.4. Иммунопатогенез болезни

У- индеек и кур матапневмовирус вызывает инфекцию? верхних дыхательных; путей и редко обнаруживается в легких.. Его., персистенция в этом; месте обычно¹: продолжается? не более: чем- 10 суток. После инфицирования,; время; когда⁵: его можно; выявить, с применением традиционного метода обнаружения, т.е. выделением в трахеальных органных культурах. Присутствие бактерий может способствовать тому, что вирус будет персистировать дольше и проникать глубже в ткани? (Cook et al., 1991). Однако, при использовании полимеразной цепной реакции (1ЩР). он продемонстрировал? наличие вирусной РНК в сухих:трахеальных тампонах на протяжении 17-19 сут. после инфекциш у индюшат, и особенно: 2 нед. после регистрации; пиковых титров;. Эти данные имеют огромное значение для> диагностики, но их ценность для понимания: того; каким образом: происходит распространение МЛВИ птиц, остается неясной;, поскольку обнаруженная, таким_; способом, вирусная; РНК не: инфекционна. Не было показано долговременной: персистенции: инфекционного¹ вируса, хотя, высокие уровни антител обнаруживали много недель спустя после экспериментальной инфекции взрослых индеек (Jones, 1996; Jones et al., 1988).

Другим' важным: местом? репликации вируса у индеек является; эпителий зрелого яйцевода,(Jones et al., 1988), где это,.вероятно; приводит, к нарушению функционирования яйцевода: и яичников? таким же: способом; как это происходит при: инфекционном бронхите. , Исследования, показали, что пневмовирус может реплицироваться, в яйцеводе кур-несушек. Однако точное влияние пневмовирусов птиц на яйцевод кур не было-определено.. Несмотря на репликацию пневмовируса в яйцеводе, не было документированного подтверждениятрансвариальной передачи вируса ни у индеек, ни у кур.

Иммунные ответные реакции'к пневмовирусу обоих видов птиц пока не выяснены полностью. Вслед за. инфицированием в сыворотке появляются антитела, которые могут быть обнаружены непрямой иммуно флуорисценцией, вирусной нейтрализацией и ELISA (Baxter-Jones et al., 1986; 1989). Впрочем, корреляция между наличием антител и защитой респираторного тракта кажется весьма слабой, поскольку вакцинированные бурсоэктомированные химическим методом индюшата, которые были неспособны к сероконверсии, по-прежнему, были защищены от заражения вирулентным вирусом (Jones et al., 1992). Сообщения при полевых вспышках иногда указывают на плохой серологический ответ после применения вакцины. При длительном исследовании индейки-несушки, получавшие живую TRT вакцину в 12- суточном возрасте, были защищены от заражения в 22 недели, хотя они и не имели значительных титров антител в ELISA на момент заражения (Williams et al., 1991). Это наводит на мысль, что клеточно-опосредованный иммунитет является более важным при респираторной инфекции и эта область заслуживает дальнейшего изучения. Вероятно у кур-несушек антитела играют важную роль в защитном процессе репродуктивного тракта от вируса, находящегося в крови , который может нарушать яичную продуктивность.

Неопубликованные полевые наблюдения наводят на мысль, что после первоначальной инфекции, птицы могут быть заражены повторно, но для подтверждения этого не было выполнено ни одной экспериментальной работы.

Влиянию других респираторных патогенов на пневмовирусную инфекцию было уделено относительно мало внимания. Было показано, что Bordetella avium, Pasteurella подобные организмы (Cook et al., 1991)и Mycoplazma gallisepticum (Naylor et al., 1992) пролонгируют и осложняют клиническое проявление болезни у индеек. В полевых условиях, пневмовирусная инфекция кур иногда существует совместно с другими респираторными вирусами, такими как вирусом инфекционного бронхита и ларинготрахеита или Ньюкаслской болезни (Б. Б. Трефилов с соавт., 2009). Влияние этих вирусов, микоплазм и других иммуносупрессивных патогенов заслуживает детального исследования.

1.5. Клинические признаки и патологоанатомические изменения у птиц при метапневмовирусной инфекции

Основные клинические симптомы у птиц, больных МПВИ, описаны многими исследователями как респираторные, которые включают: хрипы, чихание, носовые выделения, коньюктивиты, опухание инфраорбитарных синусов и подчелюстного пространства (Naylor, Jones, 1993; Jones, 1996).

У цыплят бройлеров болезнь чаще проявляется в 1-недельном возрасте, птица угнетенная, плохая поедаемость корма. Болезнь клинически проявляется в опухании инфраорбитальных и периорбитальных синусов, искривлении шеи, дезориентации и депрессии. При затяжном течении отмечают гнойные выделения из ушных проходов, а также истощение, задержку роста и анемию (Hafez, 1993; Pages-Mante, 1994; Alkhalaf et al., 2002; Ganapathy, 2007). В стаде y половины кур-несушек через 4-11 суток после заражения наблюдали диарею зеленовато-коричневого цвета. Кроме того, у больной птицы отмечали нервные явления в виде шаткой походки (Jirjis et al., 2002; Ganapathy, 2007).

У бройлеров МПВИ протекала в тяжелой форме с синдромом опухшей головы (SHS), чем у взрослой птицы (Morley, Thompson, 1984; O'Brien, 1985). Поражения воздухоносных мешков наблюдали через 7-14 суток после инфицирования и, вероятно, обусловлены секундарной инфекцией.

У молодняка индеек МПВИ характеризуется поражением верхних дыхательных путей, хотя на степень проявления клинических признаков, главным образом, влияет присутствие вторичных патогенов. При назальной инокуляции индеек МПВ птиц, спустя 96 часов, наступал полный цилиостаз эпителия трахеи (Jones et al., 1986; Giraud et al., 1986). Болезнь протекала с признаками кашля, чихания, выделения из носа и опухания синусов в области головы (Jones et al., 1986, 1988).У племенных индеек наблюдали снижение яичной продуктивности и плохое качество яиц. Антиген вируса обнаруживался в эпителии яйцевода вплоть до 9 суток после инфицирования (Jones et aL, 1986).

У больной птицы появляется, светобоязнь, она прячет голову под крыло, пытается почесать глаза лапами и когтями, вследствие чего воспалительный процесс усиливается до гнойного коньюктивита и птица слепнет, при затяжном течении, появляется синдром «узкоглазой птицы» (В.О.Виноходов, 2003). При патологоанатомическом вскрытии отмечали отечность соединительной ткани в области головы, слизисто-гнойные воспаления носовых ходов и синусов, энтериты, аэросаккулиты, перитониты и овариты.

В клетках реснитчатого эпителия носовой и фарингиальной полостей и трахеи были отмечены цитоплазматические эозинофильные включения (Giraud et al., 1986). Поражения наблюдали через 7 суток после инфицирования как у индеек, так и у кур (Picault et al., 1987a,b).

У птиц более старшего возраста на 1-9 сут. после заражения появлялись прозрачный водянистый, переходящий в слизисто-гнойный, экссудат, обильное слезотечение, чихание, потряхивание головой, кашель, депрессия, отеки вокруг глаз, воспаления век (Gough et al., 1988).

Степень распространения МПВИ птиц внутри стада или между стадами может варьировать. Факторы менеджмента такие, как плотность посадки и вентиляция⁽ оказывают влияние на тяжесть течения болезни. Другие сопутствующие инфекции, такие, как Е. coli, Bordetella avium, Pasteurella, вирус болезни Ньюкасла и Ornithobacterium rhinotracheale, также осложняют проявление болезни и существенно увеличивают экономические потери.

1.6. Диагностика метапиевмовирусной инфекции птиц

Диагноз на МПВИ птиц устанавливают на основании лабораторных исследований с учетом эпизоотологических данных, клинических признаков и патолого-анатомических изменений.

Клинические признаки МПВИ у индеек и цыплят не являются патогномоничными и поэтому необходимо использовать методы ранней и ретроспективной диагностики (И.А.Борисова, 2008). Подтверждение заболевания зависит от доказательства присутствия вируса в клиническом материале, вирусспецефических антител в сыворотке крови больной и переболевшей птицы. Как правило, выделение вируса было гораздо более затруднительным от цыплят, чем от индеек и причина этого непонятна (Weisman et al., 1988; Jones, 1996; Catelli et al., 1998). Хотя имеется сообщение из Тайваня (Lu et al., 1994) о выделении вируса от цыплят с синдромом опухшей головы.

Для первичного выделения вируса из полевого материала как от индеек, так и от кур использовали развивающиеся- эмбрионы, инокулируемые в желточный мешок (Giraud et al., 1988; Buys et al., 1989a; Panigrahy et al., 2000), или же трахеальные органные культуры (ТОК) из эмбрионов кур и индеек (McDougall & Cook, 1986; Wilding et al., 1986; Wyeth et al., 1986; Giraud et al., 1988). После 2 или 3 пассажей авторы отмечали поражения эмбрионов. Эмбриональную жидкость инокулировали на клеточные культуры: клетки Vero (Buys et al., 1989a; Williams et al., 1991) или фибробласты куриных эмбрионов (Panigrahy et al., 2000). Исследователи (Goyal et al., 2000) выделили МПВ подтип С первоначально в культуре ФЭК с последующей адаптацией вирусного изолята в клетках Vero.

Системой, выбранной для выделения МПВ, является трахеальная органная культура (McDougall & Cook, 1986), которую обычно готовят из куриных СПФ эмбрионов, хотя эмбрионы индеек также пригодны и обладаю г равной чувствительностью (Naylor & Jones, 1994). Метод может занимать много времени. Свежие пробы (ткани или тампоны (смывы)) из верхних дыхательных путей пассажируют до трех раз, при обследовании каждого пассажа на цилиостаз вплоть до 11 дней. Возможны затруднения при выделении вируса через 6-7 дней после инфицирования, так как вируссодержащий материал может быть контаминирован, и возбудитель может быть окончательно идентифицирован некоторыми другими методами, такими как вирусная нейтрализация или иммунофлуоресцентное окрашивание.

При использовании ТОК материал подвергали 4 «слепым» пассажам с 3-4-суточным интервалом, обследуя их на предмет цилиарной активности в течение 10 суток (Cook et al., 2001).

При экспериментальной инфекции может быть использовано прямое или непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание на срезах трахеи или носовых ходов, но эта методика не подходит для полевого материала. Williams et al. (1991) обнаружили хорошую корреляцию с выделением вируса и гистопатологией и хотя иммунофлуоресценция (ИФ) быстрее, чем выделение, ее ценность при полевых инфекциях еще не была оценена, а также, возможно, что ее применение ограничено периодом менее чем в неделю после инфицирования. Jones et al. (1988) обнаружили, что ИФ является более чувствительным методом, чем выделение вируса от индеек и обеспечивает более быстрое получение результатов (Majo et al., 1995; Jones, 1996). Catelli et al., 1998 сравнили выделение вируса с иммунопероксидазным (ИП) окрашиванием для обнаружения МПВ у зараженных СПФ цыплят и установили его превосходство. O'Loan & Allan (1990) предположили, что иммунопероксидазный анализ имеет множество преимуществ перед ИФ. Авторы утверждают, что оптимальные условия для выявления вирусного антигена и выполнения детальных патологических исследований достигается только при комбинированном использовании формалиновой фиксации и белой световой микроскопии. Однако, для простого обнаружения антигена МПВ в полевом материале, ИФ была показана как высокоценная методика. Прямой метод ИФ успешно использовался как на ацетон-фиксированных криостатных срезах (Baxter-Jones et al., 1986), так и на Bouins-фиксированных залитых в парафин тканях (Jones et al., 1986). Было показано, что специфическое окрашивание тесно связано с поверхностными ворсинчатыми эпителиальными клетками как у экспериментально инфицированных индеек (Jones et al., 1987), так и у цыплят (Majo et al., 1995). О подобных находках сообщалось также при использовании ИП окрашивания для изучения инфекций респираторного тракта индеек (Majo et al., 1995) и цыплят (Majo et al., 1995; Catelli et al., 1998). Иммунохимические методы (ИФ и ИП) были применимы для демонстрации наличия МПВ-специфического антигена в репродуктивном тракте после экспериментальной инокуляции индеек-несушек (Jones et al., 1988) и кур- несушек (Cook et al., 2000).

Сывороточные антитела к Ml IB птиц могут быть обнаружены непрямой иммунофлуоресценцией, вирусной нейтрализацией и ELISA (Baxter-Jones et al., 1986; 1989). Была использована непрямая иммунофлуоресценция с сывороткой от реконвалесцентов перед тем, как вирус мог быть изолирован на ТОК. Эта методика была весьма полезна в качестве первоначального скринингового теста (Baxter-Jones et al., 1986). Вирусная нейтрализация является трудоемким и требующим времени тестом. Ее использовали для сравнения штаммов в перекрестной реакции нейтрализации (Baxter-Jones et al., 1987) или для исследования сывороток различных видов птиц, к которым не имелось антиглобулинов. В рутинной серологии проведение таких тестов было вытеснено методикой ELISA (Grant et al.,1987; Chettle & Wyeth, 1988;Gerrard et al., 1990).

Реакция нейтрализации используется для диагностики МПВИ птиц, но гораздо реже, чем ELISA, хотя было показано, что эти два метода обладают одинаковой чувствительностью (Baxter-Jones et al., 1989). Как правило, реакция серонейтрализации не применяется для мониторинга ответной реакции на вакцинацию. Реакцию нейтрализации выполняли во множестве систем, включающих ТОК (Cook et al., 1993b), тканевую культуру ФЭК, клетки Vero (Giraud et al., 1986; Redmann et al, 1991; Williams et al., 1991) и клетки MA-104 (Toquin et al., 2000). Eterradossi et al. (1995) обратили внимание на важность выбора антигена для ELISAs. Неудовлетворительный антиген может способствовать получению ложно отрицательного диагноза или кажущейся неиммуногенности вакцины. Необходимо проведение большого объема работы по определению того, какие антитела обнаруживаются различными ELISA и можно ли разработать наборы способные обнаруживать антитела ко всем штаммам, или в качестве альтернативы, к различным подтипам. Необходимо помнить, что, несмотря на все удобства определения антител в ELISA, полученные результаты могут быть недостоверными показателями иммунитета. Но до тех пор, пока мы не будем иметь методик определения клеточно-опосредованного иммунитета, которые будут в равной степени просты для исполнения, мы будем доверять традиционным ELISA.

В настоящее время доступно, по крайней мере, два различных типа коммерческих ELISA наборов. Первый тип использует планшеты с сорбированным неочищенным или очищенным вирусом. Тестируемую сыворотку вносят на планшет и позволяют реагентам взаимодействовать. Затем добавляют антиглобулин, специфичный для вида птицы и помеченный ферментом, и далее добавляют хромоген. Если в тестируемой сыворотке имеются специфические антитела, энзим-меченый антиглобулин будет фиксирован и его присутствие будет выявлено изменением окраски. Вторым типом является «блокирующий» вариант ELISA, посредством которого тестируемая сыворотка конкурирует с моноклональными антителами, полученными на мышах, за эпитоп вируса, сорбированного на планшете. Поэтому тестируемая сыворотка вносится на планшет, сорбированный вирусом, и ей дают время взаимодействовать. После промывания, таким же образом применяют Mab с последующим наслаиванием антимышиного глобулина, помеченного ферментом, а в конце добавляют хромоген. В этом случае, изменение окраски происходит, если тестируемая сыворотка не блокировала Mab, (то есть чтение реакции противоположно- первому варианту), и является негативной (без специфических антител). Теоретически, непрямой метод является более чувствительным, в то время как блокирующий вариант ELISA должен показывать более высокую специфичность, поскольку он не зависит от специфического конъюгата к какому-либо- из видов птиц. Возможно, поэтому именно этот вариант является более подходящим для тестирования сывороток от различных видов птиц (McFarlane-Toms & Jackson, 1998). ELISA антигены могут быть приготовлены на различных системах, включающих ТОК (Cook et al., 1988), 0>3K(Grant et al., 1987; Chettle & Wyeth, 1988) или клетки Vero (Giraud et al., 1986).

Исследование, проведенное Hafer (1991)-показало, что использованные три штаммов в качестве антигена в ELISA тесте имели одностороннее родство между изолятами, поскольку не все антигены выявляли антитела во всех сыворотках. Эти данные были подтверждены в реакциях нейтрализации (Hafer, 1992). Eterradossi et al.(1992) обнаружили, что каждый антиген был более эффективен для выявления антител в сыворотках, полученных из той же самой страны, что и антиген, используемый в ELISA, и что эти ELISA наборы реагировали по-разному с одними и теми же полевыми сыворотками. Исследователи говорили о важности использования антигенов, полученных из вирусных штаммов, происходящих из различных географических областей, и предположили, что несоответствующий выбор антигена для ELISA может препятствовать ранней диагностике МПВИ птиц (Eterradossi et al., 1995). Аналогичную ситуацию установили авторы при определении уровня антител в ELISA у вакцинированной птицы, если в качестве антигена использовали гетерологичный штамм по отношению вакцинному (В.Н.Ирза с соавт., 2003; Toquin et al., 1992; 1996; Eterradossi et al., 1995). Mc Farlane-Toms & Jackson (1998), Mekkes & De Wit (1999) обнаружили значительные различия по чувствительности трех коммерческих наборов ELISA, хотя они показали 100% специфичность.

Таким образом, при интерпретации результатов ELISA возникают разногласия, так как использование различных антигенов в коммерческих наборах обуславливает значимую разницу в интенсивности взаимодействия гомологичных и гетерологичных антигенов и антител.

В последнее время в вирусологии широко используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в различных ее модификациях, которая основана на обнаружении генома вируса с последующим ретрикционным анализом или секвенированием, а также дифференциацией с помощью типоспецифических праймеров (В.Н.Ирза с сооавт., 2005; И.А.Борисова, С.К.Старов, 2006; Pattison, Chettle, 1989; Seal, 1998; Cook et al., 1999; D'Arce et al., 2005). Cook et al. (2001) сравнили эффективность вирусовыделения и гнездовую реверсивную транскриптазно-полимеразную цепную реакцию (РТ- ПЦР) для выявления МПВ в респираторном тракте у цыплят. Исследователи обнаружили, что степень успеха для двух методик одинакова. Однако ПЦР обеспечивает более быстрое получение результата в течение 1 суток, а вирусовыделение — в течение 3 недель.

Вирусную геномную РНК обнаружили в мазках из эпителия трахеи в течение 19-суточного периода после инфицирования индеек (Jing et al., 1993). ПЦР с использованием праймеров из гена нуклеотидного белка МПВ применяли для детекции различных подтипов вирусов (Byon-Auboyer et al., 1999). Pedersen et al. (2000) проводили оценку чувствительности и специфичности традиционной гнездовой ПЦР и ревертазной ПЦР (Tag-Man- вариант) при выявлении и идентификации подтипов МПВ птиц в сравнении с методами его изоляции и установили их высокую эффективность.

1.7. Профилактика и меры борьбы с метапневмовирусной инфекцией птиц

Поскольку пневмовирусная инфекция птиц не может быть взята под контроль с помощью медикаментозных средств (Hafez et al., 1990), основным подходом к контролированию заболевания является использование аттенуированных вакцин в молодом стаде, как индеек, так и цыплят, и инактивированных вакцин у несушек и родительского поголовья перед началом яйцекладки. Было разработано некоторое количество атенуированных вакцин, которые с различной степенью успеха проявили себя в полевых условиях. Все вакцины были получены методом повторных пассажей вирулентного вируса в лабораторной культуральной системе до достижения различных степеней аттенуации. (Cook et al., 1989a,b; Buys et al., 1989; Cook et al., 1990; Gulati et al., 2001; Williams et al., 1991).

Демонстрация того, что имеются два типа пневмовирусов птиц; вызвала пересмотр процесса вакцинации. Cook et al. (1995, 1996) показали, что вакцина полученная от первичного английского штамма Ml 1В, обеспечивающая защиту как кур, так и индеек от экспериментального заражения штаммами, принадлежащими к двум различным Mab группам. Это означает, что вакцины типа А защищали от заражения как типом А, так и типом В. Сообщений о том, защищают вакцины типа В от заражения вирусами типа А не было опубликовано. Кажется, было бы благоразумно использовать вакцины в областях, где присутствуют оба типа, если только один тип демонстрирует, что он достаточно эффективен против обоих.

Однако поскольку пневмовирусы являются РНК-вирусами и генетически нестабильны, живые вакцины подвержены некоторой реверсии к вирулентному состоянию, и поэтому может быть так, что хорошие традиционные живые так не будут получены.

Что касается болезни у индеек, вакцины были должным образом оценены, поскольку обычно клинические признаки легче вызвать вирулентным вирусом. Однако оценку вакцин у кур выполнить намного труднее, поскольку признаки менее выражены. Не было получено ни одной модели SHS для использования в тестировании вакцин.

Кажется возможным, что традиционные вакцины против пневмовируса птиц будут работать в обозримом будущем, полностью контролируя болезни. В будущем также могут быть успешны рекомбинантные вакцины. Quingzong et al. (1994) с применением рекомбинантного вируса оспы птиц экспрессировали фузионный (F) протеин TRT вируса, частично добиваясь защитного иммунного ответа у индюшат при заражении вирулентньш вирусом 3 недели спустя. Однако были проведены две раздельные вакцинации, через две недели. Необходимость этого не была объяснена. Протеины F и G являются двумя важнейшими иммуногенами вируса, но огромное изменение последовательностей в двух типах пневмовируса до настоящего времени было продемонстрировано только в гене G-протеина (Juhasz & Easton, 1994). Если в этом гене также существуют различия, то возможно рекомбинантные вакцины должны будут экспрессировать гены обоих типов для достижения максимальной эффективности вакцин. Такие вакцины, имеющие преимущество в том, что не вызывают болезни, прежде чем они займут свое положение на рынке, должны доказать, что они также эффективны, как традиционные вакцины.

Сильные экономические потери в США, вызываемые МПВИ у индеек, контролируют вакцинацией (Соок, 2000). С этой целью были признаны безопасными и эффективными две живые аттенуированные вакцины, изготовленные из МПВ подтипа С (Patnayak et al., 2002, 2003), полученные одна в результате серийной репродукции вирулентного МПВ в клеточных культурах и обозначена как P63-APV (Patnayak et al., 2002), а другая методом холодной адаптации и названа как ca-APV(Patnayak et al., 2003). Накопление вируссодержащего материала вакцинных штаммов Р-63 и ca-APV проводили на клетках Vero (Patnayak et al., 2005). Jirjis et al. (2001) сообщили о результатах применения культуральной вакцины против МПВИ на 4-недельных индюшатах окулярным методом, v Однако коммерческие вакцины, применяемые в Европе и США индуцируют низкий гуморальный иммунитет, а вакцинированная птица защищена от заражения полевым вирусом. В связи с этим обсуждается роль клеточно- опосредованного иммунитета при МПВИ птиц (Bennett et al., 2005).

А. Б. Сарбасов с соавт. (2003); И. А. Борисова (2006, 2008); И. А. Борисова, А. В. Борисов (2009) вакцинировали цыплят инактивированной вакциной против МПВИ птиц, независимо от иммунного фона, и установили уровень специфических антител в сыворотке крови в высоких титрах. В ФГУ «ВНИИЗЖ» разработана и внедрена в промышленное производство инактивированная вакцина против МПВИ и болезни Ньюкасла, позволяющая получать иммунный ответ одновременно к обеим болезням на весь период эксплуатации птицы.

1.8. Заключение

Было весьма интересно наблюдать эволюцию малоизученной болезни индеек и кур, и изучить вклад различных ученых в эту проблему.

К несчастью неизбежным последствием интенсивного коммерческого приложения большинства исследовательских работ по МПВИ птиц является то, что значительная часть свободного обмена информацией, так необходимого науке убавилась. А также, в гонке по разработке коммерческих вакцин, многие важные аспекты инфекции не были изучены во всей глубине.

Важной особенностью метапневмовирусной инфекции у цыплят является плохое понимание болезни, которое заключает в себе роль вируса в развитии СОГ, его влияние на яичную продуктивность и качество, и его взаимодействие с другими респираторными и иммуносупрессивными вирусами. Необходимо больше узнать о иммунном ответе к метапневмовирусу у кур и индеек, включая вопрос о том, является ли вирус сам по себе иммуносупрессивным и какие из компонентов вируса наиболее значимы для разработки вакцины и ИФА технологии. Для быстрого обнаружения вируса необходимы улучшенные диагностические методики: кажется весьма вероятным, что они будут развиваться, главным образом, от ПНР методологии, сделанные более легкими в использовании и выполненные непосредственно для идентификации подтипов вируса. Типоспецифические МаЬэ также могли быть использованы для непрямой иммунофлуоресценции в трахеальных или назальных соскобах или срезах. Заслуживают внимания исследования по ЕЬ^Аэ (ИФА), поскольку эта методика способна выявлять антитела к одному или обоим полевым типам или к отдельным вакцинам и применяется для массовых серологических мониторинговых исследований.

Изучение роли свободноживущих птиц в переносе инфекции помогло бы нам понять географическое распространение болезни.

Поскольку метапневмовирус широко распространен в природе, контроль над заболеванием будет основан, главным образом, на вакцинации. По- прежнему будут использоваться традиционные живые аттенуированные или инактивированные вакцины, до тех пор, пока не будут разработаны их рекомбинантные аналоги.

2.Собственные исследования

Работа выполнена в 2006-2009 гг. в отделе вирусологии Государственного научного учреждения «Всероссийский научно — исследовательский ветеринарный институт птицеводства» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИВИП» Россельхозакадемии) в соответствии с научно-технической программой НИР 08.07.05.

Л ; 2.1 Материалы и методы г 2.1.1. Материалы исследований

Патологические материалы для выделения вирусного изолята метапневмовируса птиц (МПВП) брали от цыплят 10-30-суточного возраста мясного и яичного направления из ЗАО «Птицефабрика Невская» и «Тульский бройлер».:

Свежие трупы, головы и трахеи с легкими от клинически больных или павших цыплят хранили при; минус 10-20С до проведения вирусологических исследований. . .:

Тампоны с| патологическим материалом (эксудативные выделения из верхних дыхательных путей, инфраорбитальных синусов) помещали в раствор Хенкса с антибио тиками. Ц

Суспензию из патологического материала готовили по общепринятым методикам (В.Н.Сюрин с соавт., 1991). . Выделение! вируса проводили путем перемежающихся пассажей на развивающихся СПФ куриных эмбрионах 6-7 - суточного возраста и ,культурах клеток или последовательных пассажей на клетках Vero.

Вирус. В работе использовали вакцинный штамм VC-03 (Picault Y:P., 1987) подтипа В, реизолированный из; лиофилизированной вакцины einovak производства фирмы Rhone Merilux. . ."':- Вирус поддерживали : 'в перевиваемой линии клеток почки зеленой мартышю! (клетки Vero) и хранили при температуре минус 20 С. . i: Сыворотки, тестируемые в непрямом варианте ИФА. Исследовали образцы сывороток крови кур не содержащие макроскопических признаков бактериальной и грибковой контаминации.

Диагностику мы: '.i- _ ¹ - набор для обнаружения антител к возбудителю метапневмовирусной инфекции птиц BioCekf.- производства фирмы "Avian Rhinotracheitis Antibody Test Kit" (Holland); набор для определения' антител к пневмовирусу иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ»; набор для определения; антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ»; набор для выявления антител к возбудителю реовирусной инфекции птиц иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ»; набор для выявления антител к инфекционному энцефаломиелиту кур, иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ».

Инкубационные яйца и цыплята: яйца СПФ-кур, полученные из фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия), 200 штук; условиях ГНУ цыплята, инкубированные из СПФ-яиц фирмы «Lohmann Tierzucht» в

ВНИВИП, 50 голов.

Культуры клеток: первично-трипсинизированная культура клеток СПФ куриных эмбрионов (ККЭ); перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки, клетки Vero (НИИ гриппа'АМН, Санкт-Петербург).

Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы: питательная среда Игла MEM или ДМЕМ, жидкая, с L-глутамином; питательная среда № 199, жидкая, с L-глутамином; питательная!среда ДМЕМ/П2 с Hepes, жидкая; сыворотка крови крупного рогатого скота, неконсервированная для культур клеток; сыворотка крови плодов коровы; трипсина раствор, 0,25% фирмы «US ВЮ»; версена раствор, 0,02%;¹

Хенкса раствор фирмы «Hyclone»; питательные среды и растворы из полнокомпонентной смеси фирмы «Hyclone», производства ООО «Биолот»; калий фосфорнокислый однозамещенный, ч., ГОСТ 4198, ОАО «Реактив»; калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, ч.д.а., ГОСТ 2493,ОАО «Реактив»; натрий хлористый (NaCI), х.ч., ГОСТ 4233, ОАО «Реактив»; фосфатно-цитратный буфер производства ООО «Биолот»; перекись водорода производства ОАО «Татхимфармпрепараты»; ортофенилендиамин (ОФД) производства фирмы Sigma; твин 20 (Р7949) производства фирмы Sigma; анти видовой иммунопероксидазный коньюгат против IgG курицы производства ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Москва); микробиологические среды: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо- пептонный агар (МПА), мясо-пептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом (среда Китт-Тароцци), агар Сабуро, производства ГНУ ВНИВИП.

2.1.2. Методы исследований

Культура клеток. Первично-трипсинизированную культуру клеток готовили из кожно-мышечной ткани 10-суточных СПФ куриных эмбрионов по методике Dulbecco R. & Vogt М. (1954) в модификации Younger J.S. (1954).

В качестве ростовой питательной среды использовали среду Игла МЕМ/ДМЕМ и среду 199 в соотношении 2:1 с добавлением 10% нормальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков: бензинпенициллина 100

ЕД/см и стрептомицина сульфата - 100мкг/см

Раствор для диспергирования ткани состоял из 0,25% раствора трипсина, 0,02% раствора версена и раствора Хенкса в соотношении 1:2:2.

Трипсинизацию проводили на магнитной мешалке при темперагуре 36-37 в течение 10-15 мин до полного расщепления» фрагментов ткани на отдельные клетки. По истечении указанного времени клеточную взвесь (надосадочную жидкость) сливали во флаконы с охлажденной смесыо сыворотки крови крупного рогатого скота до 10% и среды Игла (соотношение 1:1) с целью нейтрализации действия трипсина.

Суспензию клеток центрифугировали при 900-1000» об/мин в течение 15-20 минут. Из осадка клеточной массы готовили суспензию клеток в ростовой питательной среде Игла с содержанием 650-750 тыс. кл./см .

Клеточную суспензию разливали в пробирки и матрасы по 2 и 220 см³ соответственно и инкубировали в стационарных условиях при температуре (37,0±0,5)С. В течение 48 час на поверхности стекла формировался клеточный монослой.

Клетки Vero пересевали с интервалом 5-6 сут. бесцентрифужным методом. Для снятия монослоя клеток со стекла использовали растворы трипсина 0,25% и версена 0,02% в соотношении 1:9. Монослой клеток дважды отмывали раствором Хенкса, затем в матрас добавляли смесь растворов трипсина и версена, прогретую до 37 С и инкубировали в термостате в течение 5-10 мин до начала отделения клеток от стекла.

Раствор версена с трипсином сливали, а клетки ресуспендировали в определенном объеме питательной среды. Клетки подсчитывали в камере Горяева, затем разводили ростовой питательной средой (среда ДМЕМ/Р12 с Hepes, до 10% фетальной сыворотки и антибиотиков) до необходимой концентрации (200-250 тыс.кл./см³). Разливали в пробирки по 1см³ и пластиковые матрасы, культивировали в стационарных условиях при температуре (37,0±0,5) С.

Титрование вируса на культуре клеток по цитопатогенному действию (ЦПД) проводили в чувствительной клеточной культуре (ККЭ, клетки Vero) методом десятикратных разведений и с соответствующими контролями. Из культуральной вируссодоржащей жидкости готовили 10-кратные разведения 1 8

10" -10" на поддерживающей среде без добавления сыворотки.

Каждым разведением вируса заражали 4 пробирки с культурой клеток. Время контакта вируса, с клеточным монослоем составляло 30 минут при комнатной температуре. Затем во все пробирки добавляли по 1,8 см³ поддерживающей среды Игла MEM. Зараженные и контрольные культуры инкубировали при температуре 38С. Ежедневно в течение 5-7 суток проводили учет ЦПД, выражая его по 4-крестовой системе.

Величину титра вычисляли по методу Reed L.J. & Muench Н. (1938) и выражали в lg ТЦД₅₀ в 1,0 см (тканевая цитопатогенная доза).

Реакция нейтрализации (РН). В основу РН брали стандартный, классический метод, описанный в руководстве по вирусологии (Н.И. Троценко с соавт., 2000).

РН ставили в культуре клеток со специфическими сыворотками, полученными от иммунизированной птицы. Вариантами реакции были:

Прямая РН с постоянной дозой гомологичной, сыворотки и десятикратным разведением вируса (а-вариант);

Прямая РН с постоянной дозой вируса 100 или 1000 ТЦД₅о с двукратными разведениями гомологичной сыворотки ((3-вариант).

Техника постановки РН. Сыворотки перед началом исследований освобождали от термолабильных неспецифических ингибиторов подогреванием в водяной бане при температуре 5бС в течение 30 минут. Смеси равных объемов вируса и сыворотки в* соответствующих разведениях выдерживали при комнатной температуре в течение 60 минут, а затем в объеме 0,2 см³ вводили в 4 пробирочные культуры с 1,8 см³ поддерживающей среды.

Титр вируса и конечную точку нейтрализации вычисляли по Reed L.J. & Muench Н. (1938) на основании ЦПД в культуре клеток через 5-6 суток инкубации после инокуляции вируса.

Вируснейтрализующую активность сыворотки выражали в индексе нейтрализации, который представляет собой разность показателей логарифмов титра вируса в присутствии специфической и нормальной сывороток.

За титр антител принимали то наибольшее разведение сыворотки, которое было способно ингибировать активность вируса, внесенного в указанной дозе, в 50% зараженной культуры.

Очистку вируссодержащего материала проводили методом гельхроматографии на макропористом стекле (МПС), обработанном поливинилпирролидоном (ПВП) (В.Д. Сергеев, И.К. Рождественский, 1988). Макропористое стекло размером¹ пор 1000А⁰ активировали концентрированной соляной кислотой (НС1) в соотношении 1:2 и выдерживали при температуре 20-22С 1-2 суток, периодически встряхивая. После этого кислоту сливали и МПС однократно промывали дистиллированной водой, затем его заливали равным* объемом смеси Комаровского (6% раствор Н₂0₂ в 6М растворе НС1 в соотношении 1:1). Смесь с МПС нагревали на водяной бане при 56С в течение 2 ч в вытяжном шкафу. Обработанное МПС промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции и под вакуумом удаляли воздух из пор. Затем заливали двумя объемами 4% раствора ПВП в дистиллированной воде и перемешивали на качалке в течение 4-5 ч. Раствор сливали, а МПС отмывали от несвязанного ПВП дистиллированной водой до исчезновения желтой окраски. Колонку размером 80><2см заполняли модифицированным МПС и уравновешивали 0,01М фосфатно-солевым буферным раствором (ФБР), рЫ 7,3-7,5. После стабилизации колонки над поверхностью МПС оставляли слой буфера в 1 мм. После этого на МПС наслаивали вируссодержащую жидкость. Элюцию вируса осуществляли ФБР; рН 7,3-7,5 с использованием перистальтического насоса, прибора РЭППС-1М (регистратор измерений электропроводимости и процента поглощения света элюатом при жидкостной хроматографии» при длине волны 280 нм) со скоростью 0,7-1,0 см³/мин и собирали его отдельной фракцией. Выход очищенного вируса регистрировался на ленте самописца в своеобразном пике, затем большим пиком выделялись примесные белки.

Иммуноанализ антител. Для сенсибилизации поверхности лунок полистироловых планшет для ИФА (Чехия) использовали очищенный антиген метапневмовируса птиц в оптимальной концентрации, разведенный 0,01М ФБР, рН 7,3-7,5. Иммобилизацию антигена на поверхности лунок полистироловых планшет осуществляли в течение 18-20 часов при температуре 4-8С. Несвязавшийся с поверхностью полистирола антиген отмывали трехкратно в объеме 0,2 см³ 0,0калий-фосфатным буфером, содержащим 0,5М раствор хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией твина-20 (ФБРТ), рН 7,0-7,4. Планшеты для ИФА с иммобилизированным антигеном метапневмовируса были пригодны для постановки реакции при хранении их при температуре 4-8С в течение 12 мес.

В лунки с адсорбированным антигеном вносили по 0,1 см³ контрольные (положительную и отрицательную) и исследуемые сыворотки' крови кур в разведении 1:400. Планшет помещали в термостат при 37С на 30 минут, содержимое лунок планшета удаляли, и планшет трехкратно отмывали в объеме 0,2 см³ от несвязавшихся антител.

В отмытые лунки планшета вносили по 0,1 см³ антивидового иммунопероксидазного конъюгата, специфичного к' ^О кур в рабочем разведении, термостатировали 30 минут при 37С и отмывали лунки планшета трехкратно в объеме 0,2 см³ ФБРТ. Затем добавляли по 0,1 см³ субстратно- индикаторной смеси (0,04 % ортофенилендиамина и 0,4 % раствор перекиси водорода). Планшет помещали в темное место при комнатной температуре на 3-5 минут. Реакцию останавливали 0,05 см³ 10 % Н₂80₄ и считывали поглощение (оптическую плотность) на иммуноферментном анализаторе «Пикон» при длине волны 492 нм.

Статистическая обработка данных. Использовали общепринятые методы оценки дисперсии, стандартного отклонения и доверительного интервала варьирующих переменных, устанавливали количественные показатели связи зависимых переменных в виде коэффициентов корреляции или коэффициентов регрессионных уравнений. Для соответствующих вычислений применяли компьютерную программу Microsoft Excel.

2.2. Результаты собственных исследований

Характеристика рода М арпеитоукш семейства Рагатухоутске

Пневмовирусы птиц являются РНК-содержащими, с несегментированным одноцепочечным негативным геномом, относящимся к семейству Paramyxoviridae подсемейству Pneumovirinae роду Metapneumovirus (Pringle, 1998; Lamb et al., 2000). Геном РНК состоит из восьми генов с их продуктами организованными в следующем порядке: 3 -N-P-M-F-M2-SH-G-L- 5 , с общей длиной от 13134 (AMPV подтип С) до 13378 (HMPV) нуклеотидов (Ishiguro et al., 2004; Lwamba et al., 2005).

Вирус имеет комплексную структуру и покрыт липопротеидной оболочкой, образующейся при выходе вириона. Главным образом образует сферические частицы, симметричные по спиральному типу, которые имеют размеры 80-200 нм. Также могут встречаться плеоморфные вирионы в диаметре 150-200нм и длиной 1000-10000 нм. Спиральный нуклеотид имеет длину 14 нм.

Оболочка напоминает бахрому с поверхностными выступами длиной 13-15 нм, представляющие собой типы шириной 2-3 нм у основания, максимальная 3-5 нм, расстояние между шипами 2-3 нм; включающие гемагглютинин и нейраминидазу (HN) или гемагглютинин (Н), или повехностный гликопротеин (G) и слияния (F-гликопротеин), равномерно ее покрывающие. Отсутствует гемагглютинирующая активность по отношению к эритроцитам цыплят, уток, свиней, крупного рогатого скота и морских CBHHOK(Giraud et al., 1986; Baxter-Jones et al., 1987; Collins a.Gough, 1988; Buys et al., 1989; O Loan et al, 1992).

Молекулярная масса генома составляет 0,5% от веса вириона и варьирует у рода Pneumovirus в пределах 17-20 кв. Геном обычно мономерный или иногда мультиплоидный, несегментирован и содержит единичную линейную молекулу одноцепочечной РНК, отрицательной полярности, внутренняя последовательность GAA следует за трансляцией стартового сигнала в начале следующего гена. Вирионы могут также содержагь положительную полярную одноцепочечную копию генома. Полная последовательность РНК генома составляет 15200-15900 нуклеотидов.

Пневмовирусы птиц не содержат неструктурных NS генов, что укорачивает его геном на 13,3 кв, а его восемь генов идут в порядке З -N-P-M- F-M2-SH-G-L-5 - характерные признаки метапневмовируса птиц и человека (Ling, Easton, Pringle, 1992; Yu et al.,1992; Lamb et al.2000). Все гены содержат одну открытую рамку считывания, за исключением М2, котрый имеет две перекрывающихся рамки считывания, кодирующих 2 протеина: М2-1 (184-186 аминокислоты) и М2-2 (71-73 аминокислоты) (Yu et al.,1992).

Вследствие различной генной организации и низкого уровня (40%) идентичности последовательностей по сравнению с пневмовирусом млекопитающих APV был отнесен к новому роду Metapneumovirus в подсемействе Pneumovirinae (Pringle, 1999).

Протеины составляют около 75-80 % от веса частицы. Вирусный геном кодирует структурные и неструктурные образования. Вирионы содержат 7 структурных протеинов, находящихся в нуклеокапсиде, оболочке, мембране и матриксе. Вирусная оболочка включает два встроенных протеина мембраны. Внутренняя структура пневмовируса представлена на рис. 1.

Поверхностный протеин F выполняет функции прикрепления - это протеин объединения. В течение посттрансляционного процесса он синтезируется внутри инфицированной клетки путем разрезания протеина - предшественника для создания вирионных дисульфидносвязанных субъединиц F1 и F2 (aMHH0-Fl-S-S-F2-Kap60Kcmi). Отвечает за объединение с клеткой и гемолитическую функцию (Kapczynski, Sellers,2003), хотя пневмовирусы, в отличии их от других парамиксовирусов, не обладают гемагглютинирующей и нейраминидазной активностью (Collins et al, 1996).

Расщепление F-белка на крупный белок F1 и мелкий F2 опосредует слияние клеток и необходимо для распространения вируса (Collins et al., 1996). Предполагается, что аминотерминальная часть F1 вовлекается в мембранное слияние и является высококонсервативной среди трех типов А, В и С пневмовируса птиц (Naylor et al., 1998; Seal,2000; Seal et al.,2000).

Структура организации генома гусиного пневмовируса (гусиный изолят15а/01) сходна с таковой у штаммов AMPV/C от индеек. Однако вирус имел большой G ген, самый крупный как среди пневмовирусов, так и метапневмовирусов (Bennett et al.2004). Размер G-белка 15а/01 (585 аминокислот) был более чем, в два раза больше, чем размер G-белка других вирусов подтипа С и метапневмовируса человека, и более чем на 170 аминокислот больше, чем размер G-белков других подтипов AMPV.

Подтипы А, В, D AMPV, циркулирующие в Европе имеют сопоставимые размеры G-белков (319, 414 и 389 аминокислот соответственно) и вызывают сопоставимые по степени тяжести болезни; включая патологические изменения в ресничках слизистой носовых раковин и развитие синдрома опухшей головы у кур (Pattison, Chettle, 1989; Gough, 1994; Maharaj, 1994; Shin et al., 2000). Это родство было подтверждено анализом последовательности гена F-белка (Naylor et al., 1998) и более консервативного М-гена (Randhawa et al., 1996). Хотя различные изоляты APV были антигенно схожими, но серологически могли разделяться, на две отдельные группы (Cook et al, 1993; Collins et al., 1993). Эта разница в вирусных белках объясняется различиями, обнаруживаемыми при использовании для серологических исследований разных антигенов (Senne et al., 1997).

Диагностика метапневмовирусной инфекции птиц

Диагноз на МПВИ птиц устанавливают на основании лабораторных исследований с учетом эпизоотологических данных, клинических признаков и патолого-анатомических изменений.

Клинические признаки МПВИ у индеек и цыплят не являются патогномоничными и поэтому необходимо использовать методы ранней и ретроспективной диагностики (И.А.Борисова, 2008). Подтверждение заболевания зависит от доказательства присутствия вируса в клиническом материале, вирусспецефических антител в сыворотке крови больной и переболевшей птицы. Как правило, выделение вируса было гораздо более затруднительным от цыплят, чем от индеек и причина этого непонятна (Weisman et al., 1988; Jones, 1996; Catelli et al., 1998). Хотя имеется сообщение из Тайваня (Lu et al., 1994) о выделении вируса от цыплят с синдромом опухшей головы.

Для первичного выделения вируса из полевого материала как от индеек, так и от кур использовали развивающиеся- эмбрионы, инокулируемые в желточный мешок (Giraud et al., 1988; Buys et al., 1989a; Panigrahy et al., 2000), или же трахеальные органные культуры (ТОК) из эмбрионов кур и индеек (McDougall & Cook, 1986; Wilding et al., 1986; Wyeth et al., 1986; Giraud et al., 1988). После 2 или 3 пассажей авторы отмечали поражения эмбрионов. Эмбриональную жидкость инокулировали на клеточные культуры: клетки Vero (Buys et al., 1989a; Williams et al., 1991) или фибробласты куриных эмбрионов (Panigrahy et al., 2000). Исследователи (Goyal et al., 2000) выделили МПВ подтип С первоначально в культуре ФЭК с последующей адаптацией вирусного изолята в клетках Vero.

Системой, выбранной для выделения МПВ, является трахеальная органная культура (McDougall & Cook, 1986), которую обычно готовят из куриных СПФ эмбрионов, хотя эмбрионы индеек также пригодны и обладаю г равной чувствительностью (Naylor & Jones, 1994). Метод может занимать много времени. Свежие пробы (ткани или тампоны (смывы)) из верхних дыхательных путей пассажируют до трех раз, при обследовании каждого пассажа на цилиостаз вплоть до 11 дней. Возможны затруднения при выделении вируса через 6-7 дней после инфицирования, так как вируссодержащий материал может быть контаминирован, и возбудитель может быть окончательно идентифицирован некоторыми другими методами, такими как вирусная нейтрализация или иммунофлуоресцентное окрашивание.

При использовании ТОК материал подвергали 4 «слепым» пассажам с 3-4-суточным интервалом, обследуя их на предмет цилиарной активности в течение 10 суток (Cook et al., 2001).

При экспериментальной инфекции может быть использовано прямое или непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание на срезах трахеи или носовых ходов, но эта методика не подходит для полевого материала. Williams et al. (1991) обнаружили хорошую корреляцию с выделением вируса и гистопатологией и хотя иммунофлуоресценция (ИФ) быстрее, чем выделение, ее ценность при полевых инфекциях еще не была оценена, а также, возможно, что ее применение ограничено периодом менее чем в неделю после инфицирования.

Jones et al. (1988) обнаружили, что ИФ является более чувствительным методом, чем выделение вируса от индеек и обеспечивает более быстрое получение результатов (Majo et al., 1995; Jones, 1996). Catelli et al., 1998 сравнили выделение вируса с иммунопероксидазным (ИП) окрашиванием для обнаружения МПВ у зараженных СПФ цыплят и установили его превосходство.

O Loan & Allan (1990) предположили, что иммунопероксидазный анализ имеет множество преимуществ перед ИФ. Авторы утверждают, что оптимальные условия для выявления вирусного антигена и выполнения детальных патологических исследований достигается только при комбинированном использовании формалиновой фиксации и белой световой микроскопии. Однако, для простого обнаружения антигена МПВ в полевом материале, ИФ была показана как высокоценная методика. Прямой метод ИФ успешно использовался как на ацетон-фиксированных криостатных срезах (Baxter-Jones et al., 1986), так и на Bouins-фиксированных залитых в парафин тканях (Jones et al., 1986). Было показано, что специфическое окрашивание тесно связано с поверхностными ворсинчатыми эпителиальными клетками как у экспериментально инфицированных индеек (Jones et al., 1987), так и у цыплят (Majo et al., 1995). О подобных находках сообщалось также при использовании ИП окрашивания для изучения инфекций респираторного тракта индеек (Majo et al., 1995) и цыплят (Majo et al., 1995; Catelli et al., 1998). Иммунохимические методы (ИФ и ИП) были применимы для демонстрации наличия МПВ-специфического антигена в репродуктивном тракте после экспериментальной инокуляции индеек-несушек (Jones et al., 1988) и кур- несушек (Cook et al., 2000).

Сывороточные антитела к Ml IB птиц могут быть обнаружены непрямой иммунофлуоресценцией, вирусной нейтрализацией и ELISA (Baxter-Jones et al., 1986; 1989). Была использована непрямая иммунофлуоресценция с сывороткой от реконвалесцентов перед тем, как вирус мог быть изолирован на ТОК. Эта методика была весьма полезна в качестве первоначального скринингового теста (Baxter-Jones et al., 1986). Вирусная нейтрализация является трудоемким и требующим времени тестом. Ее использовали для сравнения штаммов в перекрестной реакции нейтрализации (Baxter-Jones et al., 1987) или для исследования сывороток различных видов птиц, к которым не имелось антиглобулинов. В рутинной серологии проведение таких тестов было вытеснено методикой ELISA (Grant et al.,1987; Chettle & Wyeth, 1988;Gerrard et al., 1990).

Оценка чувствительности и специфичности разработанной тест-системы

В последнее десятилетие в Российской Федерации возросло количество случаев проявления метапневмовирусной инфекции птиц.

Такому широкому распространении МПВИ птиц способствуют биологические особенности возбудителя (способность к персистенции и циркуляции среди синантропной и перелетной птиц), наличие 4 подтипов вируса (А, В, С, D), использование племенного материала без учета эпизоотической ситуации в данном хозяйстве (комплектование стада), высокая концентрация птицы (часто разновозрастная птица на одной площадке), несовершенная и/или несоблюдение технологии выращивания (депопуляция, микроклимат, дезинфекция, вентиляция, плотность посадки, кормление). Течение инфекционного процесса, вызванной МПВ птиц, осложняется присутствием в хозяйствах различных патогенов вирусной и бактериальной природы. В связи с этим МПВИ птиц в птицехозяйствах протекает как моно - (субклиническая), так и ассоциированная (осложненная) инфекция.

При апробации разработанной тест-системы (регистрация виру со специфических антител в сыворотке крови птиц) мы также изучали эпизоотическую ситуацию на птицефабриках различного направления (11113, промышленные), используя вирусологические (выделение и идентификация вируса) и бактериологические методы исследования.

В каждом хозяйстве анализировали эпизоотическую обстановку, выяснили условия, способствующие распространению и репродукции возбудителя, определяли источники инфекции, оценивали условия содержания, кормления птиц и комплектования стада.

Родительское стадо обследованных хозяйств комплектуется суточным молодняком и/или племенным инкубационным яйцом, где ранее была зарегистрирована метапневмовирусная инфекция и в настоящее время проводится профилактическая вакцинация птицы живыми и инактивированными вакцинами разных фирм (производителей).

ЗАО «Птицефабрика Невская» яичного направления (промышленная), комплектуется суточным молодняком из Финляндии. На основании клинического осмотра взрослого поголовья установили удовлетворительное состояние кур-несушек, перьевой покров гладкий, блестящий, гребешки и сережки ярко-красные, птица активна, яйценоскость 90-95%. У отдельных особей наблюдали нарушения дыхания (вдох с открытым клювом и вытянутой шеей, хрипы), опухание инфраорбитальных синусов и подчелюстного пространства.

На вскрытии павшей птицы различных возрастов регистрировали следующие патологоанатомические изменения: - у цыплят до 10-15-суточного возраста - нерассосавшийся желток, пневмонии, энтериты; - у павших кур-несушек 122-372-суточного возраста - инфраорбитальиый синусит, ринит, геморрагический трахеит, фибринозный перикардит, энтериты.

Среди цыплят в возрасте 1-15 суток в цехе выращивания отмечается повышенный отход с респираторными симптомами.

При бактериологическом исследовании из пораженных органов были выделены культуры Escherichia coli (инфраорбитальные синусы, легкие) с выраженными адгезивными свойствами и Salmonella spp. (сердце, печень), что свидетельствовало о высокой инфицированности птиц патогенной кишечной палочкой и Salmonella spp. и неудовлетворительном санитарном состоянии.

При вирусологическом исследовании из патматериала (пораженные головы, трахеи и легкие) павшей птицы в клетках Vero и фибробластах куриных эмбрионов был выделен метапневмовирус птиц.

Пробы сывороток крови разновозрастной птицы (150-446 сут.) были исследованы на наличие специфических антител к метапневмовирусу методом ИФА с использованием разработанной диагностической тест-системы. Результаты исследований представлены на рис. 5. Результаты серологических исследований проб сывороток крови кур промышленного стада п/ф «Невская» Ленинградской области показали высокие титры антител к МПВ птиц, и в возрасте от 150 до 446 сут. они равнялись от 5699±822 до 11259±948 при 100% выявлении, что свидетельствует о циркуляции вируса в стаде.

Птицефабрика «Тульский бройлер» мясного направления комплектуется импортным племенным материалом. Клинический осмотр цыплят-бройлеров, ремонтного молодняка и родителей показал удовлетворительное состояние. Однако у отдельных особей птиц разного овозраста (1,5-2%) были отмечены инфраорбитальные синуситы, отек межчелюстного пространства (опухшая1 голова). Патологоанатомическое вскрытие показало наличие синуситов, конъюнктивитов, трахеитов и пневмоний; .

Для лабораторных исследований были доставлены пораженные головы, и трупы разновозрастной птицы.

При бактериологическом исследовании из опухших; голов, легких цыплят й кур были изолированы, 12 культур Escherichia coli, 5 культур Staphylococcus aureus и epidermidis и 2 культуры Proteus vulgaris.

При микоплазматологическом исследовании соскобов . со слизистой небаи трахеи была:выделена культура M..gallisepticum; а серологически были выявлены антитела к возбудителю в положительных титрах от 20 до 60% от исследованных проб; Н

Для проведения вирусологических, исследований брали смывы и цоскобы со слизистых инфраорбитальных синусов; неба и трахещ далее готовили суспензии на растворе Хенкса с антибиотиками. Полученным, материалом инфицировали перевиваемую линию клеток Vero и культуру клеток; куриного, эмбриона. По мере последовательных пассажей был отмечен усиливающийся цитопатический эффект в монослое культуры, который выражался округлением кйеток в ограниченных участках монослоя, .появлением в них цитоплазматической зернистости; на- 3-4 сутки после заражения. Дегенерация клеток на 70-80% была отмечена на 6-7 сутки, затемв. отдельных участках наблюдали образование синцития, как характерный признак ЦПД для метапневмовируса птиц.

Серологический мониторинг на метапневмовирусную инфекцию, птиц в птицехозяйствах различных регионов РФ

Анализ литературных данных по оптимизации условий получения активного твердофазного иммуносорбента для ИФА показал значимость природы полимера, используемого в качестве твердой фазы (Д.В.Маслов, 2006). Известно, что полистирол характеризуется большей сорбционной емкостью по сравнению с другими носителями (Herrman, Collins, 1976). Однако выпускаемые в настоящее время зарубежные и отечественные полистироловые планшеты существенно отличаются друг от друга по своим сорбционным характеристикам. Данные литературы (Г.В. Резапкин и др., 1986) и результаты собственных исследований показали, что отечественные планшеты (Ленмедполимер, г. Санкт-Петербург) обладают низкой сорбционной активностью по сравнению с зарубежными. Поэтому для получения активного твердофазного иммуносорбента в нашей работе использовали планшеты зарубежных фирм.

Рабочее разведение антигена было определено методом «шахматного» титрования на поверхности лунок полистироловых планшет в фосфатно-солевом буферном растворе, рН=7,3-7,5, в течение 16-18 часов при температуре 4С с разведением контрольных сывороток 1:400. Оптимальной сенсибилизирующей дозой метапневмовирусного антигена явилась концентрация 6-8 мкг на лунку. Оптимальное рабочее разведение лиофилизированного коммерческого конъюгата подбирали экспериментально. В наших экспериментах рабочее разведение коньюгата составило 1:300-1:400. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин («Sigma») в концентрации 5 мг на 12 см фосфатно- цитратного буфера, рН=4,9-5,0.

В процессе постановки реакции исследуемые и контрольные сыворотки, конъюгат инкубировали в термостате при 37С в течение 30 минут, так как по данным литературы известно, что установление константы равновесия между иммобилизированным на поверхности полистирола антигеном и антителами и на последующем этапе между образовавшимся иммунным комплексом (антиген-антитело) и конъюгатом наступает практически через 30 минут при температуре 37С (E.H. Горбачев с соавт., 1988; Д.В.Маслов, 2006).

Для устранения неспецифического взаимодействия в ходе ИФА используют промывочные буферные системы, включающие неионный детергент (твин-20) и иммунологически инертный белок до 1-2% или наряду с детергентом вводят в промывочный раствор высокую концентрацию хаотропных ионов типа С1 (В.Н. Вербов, 1988; E.H. Горбачев с соавт., 1988; Д.В.Маслов, 2006). Нами был использован 0,01М калий-фосфатный буфер рН=7,2-7,4, содержащий 0,5М NaCl с 0,1% конечной концентрацией детергента твин-20, который обеспечивал специфичность иммуноферментного анализа. Таким образом, проведенные исследования позволили оптимизировать условия постановки реакции при обнаружении специфических антител к метапневмовирусу птиц.

Диагностический титр в ИФА устанавливали методом «шахматного титрования» различных сывороток, начиная с разведения 1:100, при стандартной концентрации (6 мкг на лунку) сорбированного антигена. Анализ полученных результатов показал, что разведение сывороток 1:400 дает возможность не пропустить слабоположительные сыворотки. При этом 20 сывороток крови из благополучных по метапневмовирусной инфекции птиц хозяйств были отрицательными в ИФА, что подтверждает специфичность разработанной диагностической тест-системы. В связи с этим при обследовании птицеводческих хозяйств на метапневмовирусную инфекцию считаем, что целесообразно начинать постановку ИФА с разведения сыворотки 1:100 и считать разведение сыворотки 1:400 диагностическим титром на метапневмовирусную инфекцию птиц.

Для количественного определения антител к метапневмовирусу птиц при исследовании сывороток крови предлагаем метод последовательных разведений и метод одного разведения.

Для определения конечного титра тестируемых сывороток по одному разведению использовали метод регрессионного анализа в компьютерной программе Microsoft Excel. Математические расчеты проводили для разведений сывороток 1:200, 1:400 и 1:800. Были найдены коэффициенты линейной регрессии для величин lg S/P и lg Т (табл. 3 и рис. 4). Установлено, что наиболее высокое значение коэффициента корреляции определено для разведения сыворотки 1:400, которое и было принято за рабочее.

Уравнение линейной регрессии (lg Т = 1,38 lg (S/P) + 3,54) для разведения сыворотки 1:400 было использовано для расчета числового значения титра. Следует отметить, что полученное уравнение линейной регрессии будет достоверно для определенных значений оптической плотности отрицательной и положительной контрольных сывороток. Было установлено, что диапазон оптических показателей (ОП) отрицательного контроля составил от 0,088 до 0,160. Допустимые значения ОП-показателей положительного контроля были от 0,504 до 0,751.

Для разграничения неспецифической, сомнительной и специфической реакций определяли пороговые значения S/P-отношения. В качестве пороговой величины для отрицательной реакции приняли S/P- показатель, который соответствовал нижней границе 95% доверительного интервала исследованной выборки значений ОП. S/P-показатель для отрицательной реакции составил 0,2. Пороговой величиной, соответствующей минимальной ожидаемой положительной реакции считали значение S/P, установленное для верхней границы 95% доверительного интервала. Величина S/P для положительной реакции составила 0,24. Промежуточные величины 0,21-0,23 соответствовали зоне «сомнительных» результатов.

Похожие диссертации на Непрямой метод иммуноферментного анализа в диагностике метапневмовирусной инфекции птиц

Экспресс-метод диагностики метапневмовирусной инфекции птиц на основе иммуноферментного анализаЛисенкова, Анастасия Сергеевна

Серологическая диагностика аденовирусного гепатита с тельцами - включениями гидроперикардита методом непрямого иммуноферментного анализаБорисова, Мария Сергеевна

Особенности эпизоотологии и усовершенствование системы контроля Salmonella enteritidis инфекции птицДобрина, Марина Николаевна

Методы повышения продуктивности птицы, качества пищевых яиц и яичных продуктов при использовании высокопродуктивных кроссов курВеличко, Оксана Александровна

Особенности гриппа у разных видов птиц в экспериментальных условиях и эффективность методов выявления возбудителяАбрамова, Людмила Юрьевна

Эффективные методы повышения продуктивности и естественной резистентности мясной птицыХаустов Владимир Николаевич

Научные и практические методы повышения эффективности использования кормов при производстве яиц и мяса птицыЛенкова Татьяна Николаевна

Разработка тест-системы для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа : ИКК-СеротестСаттарова, Наталья Валерьевна

Биологические свойства реовируса типа I и разработка тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скотаМосквичев, Олег Валентинович

Усовершенствование лабораторной диагностики хламидийных инфекций свинейСапегин, Виктор Михайлович