Введение к работе
1.1 Актуальность темы
В структуре заболеваемости сельскохозяйственных животных наибольшее экономическое значение имеют респираторные, желудочно-кишечные болезни молодняка и патология органов воспроизводства маточного поголовья крупного рогатого скота (КРС), связанные с бесплодием, ранней эмбриональной смертностью и абортами, доминирующими возбудителями которых являются вирусы, относящиеся к различным таксономическим группам (Гаффаров Х.З. 1983; Иванов А.В., Гаффаров Х.З., 2008).
В настоящее время создано цельное представление о патогенных потенциях многочисленных вирусов, выделяемых от большинства животных. Среди них, наряду с герпесвирусом типа I, вирусом вирусной диареи - болезни слизистых, респираторно-синтициальным вирусом, аденовирусами I и II подгрупп, привлекает внимание исследователей малоизученные в Российской Федерации реовирусы, относящиеся к роду Orthoreovirus семейству Reoviridae, геном которых состоит из 10 сегментов двухнитиевой РНК. Реовирусы типов I, II и III выделили от человека, КРС, лошадей, свиней, собак, кошек и мышей. У взрослых животных чаще всего реовирусная инфекция носит латентный и инаппарантный характер и сопровождается длительным вирусоносительством и вирусовыделением(Langoni, 1985; Lai, 2011).
Реовирусная инфекция крупного рогатого скота (КРС) впервые была зарегистрирована в США, а затем в Бельгии, ФРГ, Австрии, Швеции, Франции, Голландии, Алжире, Японии и других странах, в которых выявлен высокий процент серопозитивных животных. При этом доминирующим серотипом был признан реовирус типа I (Brubaker M.M., 1964; Wizigmann G., Reinhard G., 1971; Moreno-Lopez I. 1979).
По данным Rosen L.(1962), Bckmann J.(1976) реовирусы способные обуславливать пневмоэнтериты у телят в первые 3 месяца жизни, проявляющиеся клинически диареей, ринитом, лихорадкой и пневмонией. Установлено также, что у взрослых животных реовирусная инфекция протекает латентно и сопровождается снижением удоев у молочных коров (Сюрин В.Н., Фомина Н.В., 1979).
Известно, что в естественных условиях у КРС реовирусная инфекция с яркими клиническими признаками проявляется не всегда и реовирусы, в основном, участвуют в формировании острых смешанных вирусных респираторно-кишечных инфекциях телят. По данным Wizigmann G. и Reinhardt G.(1971) в ФРГ доказано участие реовирусов в патологии плода и новорожденных.
Из литературных источников известно, что лабораторная диагностика реовирусной инфекции КРС осуществляется путем выделения вируса в культуре клеток и полученные результаты должны быть подтверждены обнаружением прироста гемагглютининов (ГА) в период реконвалесценции по сравнению с сыворотками крови, взятыми в острой стадии болезни.
По данным зарубежных исследователей ретроспективный диагноз на реовирусную инфекцию устанавливают путем исследований парных сывороток, взятых с интервалом 3-4 недели путем исследований их в РТГА с антигеном реовируса типов I, II и III. При латентной инфекции в стаде процент животных имеющих антитела, колебался от 40 до 80% (Brubacker M.M.,1964; Wizigmann G., Reinhardt G.,1978; Moreno-Lopez J., 1979).
Однако до настоящего времени в РФ какие-либо исследования по изучению реовирусов в патологии КРС не проводились; многие аспекты этой болезни, в частности, пути и источники передачи, вирусоносительство и вирусовыделение у естественно инфицированного КРС не изучены, неизвестны также широта и степень распространения реовирусной инфекции.
В этой связи решение таких вопросов, как особенности эпизоотологии болезни, постинфекционного иммунитета и задачи связанные с разработкой современных методов и средств лабораторной диагностики реовирусной инфекции КРС, как нам представляется, является актуальной проблемой ветеринарной науки и практики.
Совершенно очевидно, что современная диагностическая служба должна опираться на такие высокоспецифичные и чувствительные методы диагностики, которые позволяли бы получать воспроизводимые, достоверные и максимально качественные результаты в пределах метода, и должны быть признаны пригодными для проведения широкомасштабных исследований в условиях практических ветеринарных лабораторий. Этим требованиям в значительной степени отвечает твердофазный непрямой вариант иммуноферментного анализа.
В связи с вышеизложенным разработка иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовируса КРС является актуальной задачей.
1.2 Цель и задачи исследований
Целями данной работы явились разработка тест-системы ИФА, предназначенной для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета, а также ее апробация в сравнении с методами аналогичной направленности. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- провести серологический мониторинг в отношении реовирусной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах РТ и в ряде регионов Среднего Поволжья;
- изучить биологические, физико-химические свойства штамма «Reo I Lang» - возбудителя реовирусной инфекции крупного рогатого скота;
- разработать технологию изготовления компонентов тест-системы ИФА, предназначенной для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител, и стандартизировать условия ее проведения;
- провести оценку активности, специфичности и воспроизводимости реовирусной иммуноферментной тест-системы путем тестирования сывороток крови различных возрастных групп крупного рогатого скота и сравнительного изучения степени корреляции результатов, полученных методом аналогичной направленности (РТГА);
- определить диагностическую ценность иммуноферментной тест-системы, провести анализ и интерпретацию результатов испытания непрямого твердофазного ИФА.
1.3 Научная новизна работы
По результатам серо-иммунологического мониторинга впервые представлены данные о распространении реовирусной инфекции крупного рогатого скота в хозяйствах Республики Татарстан, других республик и областей РФ.
Определены иммунобиологические свойства штамма «Reo I Lang» реовируса типа I и на этой основе обоснован выбор в качестве производственного, установлены параметры его культивирования, очистки и концентрирования.
Впервые в РФ Разработана «Тест-система ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета» (Заявка на изобретение РФ № 2011140364/20 от 04.10.11.). Оптимизированы условия ее проведения при исследовании сывороток крови животных взятых в одном разведении. Сравнительными исследованиями подтверждена чувствительность, специфичность и воспроизводимость иммуноферментной тест-системы и выявлена положительная корреляции ее результатов с данными, полученными с методом аналогичной направленности (РТГА).
Положительные результаты испытания иммуноферментной тест-системы подтверждены в производственных условиях.
1.4 Практическая значимость работы
Внедрение разработанной тест-системы ИФА в практику ветеринарных лабораторий РФ позволит решить проблему серологической диагностики реовирусной инфекции КРС и оценивать напряженность поствакцинального иммунитета.
Проведены лабораторные, межведомственные комиссионные и производственные испытания разработанной тест-системы с положительным результатом.
Материалы исследований по разработке и применению тест-системы ИФА вошли в научно-нормативные документы.
1.5 Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на: международно-практической конференции посвященной 50-летию ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» «Биотехнология: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность» (Казань, 2010).
1.6 Публикации результатов исследований
По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в т.ч. 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
1.7 Объем и структура диссертации
