Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы . 16
1.1 Краткая характеристика основных вирусных респираторно-кишечных инфекций молодняка и патологий репродуктивных органов крупного рогатого скота 16
1.2 Парвовирусная инфекция крупного рогатого скота . 24
1.2.1 Основные иммунобиологические свойства парвовирусов 24
1.2.2 Клинико-эпизоотологические особенности болезни 32
1.2.3 Лабораторная диагностика и специфическая профилактика 35
1.3 Реовирусная инфекция крупного рогатого скота 38
1.3.1 Основные иммунобиологические свойства реовирусов 38
1.3.2 Клинико-эпизоотологические особенности болезни 47
1.3.3 Лабораторная диагностика и специфическая профилактика 54
1.4 Герпесвирусная типа I инфекция крупного рогатого скота . 56
1.4.1 Основные иммунобиологические свойства герпесвирусов 58
1.4.2 Клинико-эпизоотологические особенности болезни 61
1.4.3 Лабораторная диагностика и специфическая профилактика 63
1.5 Вирусная диарея – болезнь слизистых оболочек крупного рогатого
скота 66
1.5.1 Основные иммунобиологические свойства возбудителя вирусной диареи крупного рогатого скота . 67
1.5.2 Клинико-эпизоотологические особенности болезни 68
1.5.3 Лабораторная диагностика и специфическая профилактика 70
1.6 Заключение по обзору литературы 72
ГЛАВА 2 Материалы и методы . 76
2.1 Материалы исследований 76
2.2 Методы исследований 79
ГЛАВА 3 Результаты собственных исследований 92
3.1 Этиологическая структура респираторно-кишечных вирусных инфекций молодняка и патологий репродуктивных органов маточного поголовья крупного рогатого скота на территории Приволжского федерального округа и прилегающих регионов 92
3.2 Изучение биологических и физико-химических свойств парвовируса и реовируса типа I 98
3.2.1 Гемагглютинирующая активность вирусов с эритроцитами разных видов животных и человека 98
3.2.2 Физико-химические свойства парвовируса и реовируса типа I .100
3.2.3 Изучение патогенных свойств парвовируса крупного рогатого скота типа I (штамм «Parvo 32459») 101
3.2.4 Изучение патогенных свойств реовируса типа I (штамм «Reo I Lang») 103
3.2.5 Изучение культуральных свойств парвовируса типа I (штамм «Parvo 32459») 106
3.2.6 Изучение культуральных свойств реовируса типа I (штамм «Reo I Lang») 109
3.3 Подбор инактиватора для получения диагностических и вакциннных антигенов 111
3.4 Конструирование иммуноферментных тест-систем для выявления антител к парвовирусу и реовирусу типа I крупного рогатого скота 113
3.4.1 Разработка технологии изготовления тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител 114
3.4.2 Подбор оптимальных условий проведения анализа тест-системой ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота 117
3.4.3 Разработка технологии изготовления иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета 125
3.4.4 Подбор оптимальных условий проведения анализа тест-системой ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота 129
3.5 Степень распространения парвовирусной и реовирусной инфекций среди поголовья крупного рогатого скота 137
3.6 Разработка технологии изготовления вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 142
3.6.1 Конструирование инактивированных моновалентных и ассоцииро-ванных вакцин против парвовирусной, реовирусной, герпесвирус-ной инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на основе различных адъювантов 142
3.6.2 Выбор формы инактивированной вакцины и изучение антигенной совместимости вирусных компонентов на лабораторных животных 145
3.6.3 Определение оптимальной прививочной дозы вакцины ассоциированной эмульсионной на кроликах 148
3.6.4 Выбор формы ассоциированной вакцины и определение оптимальной прививочной дозы на КРС различных возрастных групп 150
3.6.5 Контроль качества вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болоезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной 154
3.6.6 Производственные испытания вакцины ассоцииированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и
вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной 158
3.6.7 Изучение напряженности иммунитета у вакцинированного крупного рогатого скота в отдаленные сроки 170
ГЛАВА 4 Заключение 180
Список сокращенных терминов 211
Список использованной литературы
- Парвовирусная инфекция крупного рогатого скота .
- Изучение биологических и физико-химических свойств парвовируса и реовируса типа
- Разработка технологии изготовления тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител
- Определение оптимальной прививочной дозы вакцины ассоциированной эмульсионной на кроликах
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Современное животноводство характеризуется широким внедрением интенсивных форм производства. Специфика сложившейся технологии содержания и кормления животных существенно изменили их среду обитания. Большая концентрация животных на ограниченных площадях, поступающих из различных в эпизоотическом отношении регионов, широкий обмен животными внутри страны и завоз из-за рубежа высокопродуктивного племенного скота, трудности организации непрерывного производства, полноценного кормления и обеспечения оптимального микроклимата создают благоприятные условия для возникновения массовых инфекционных болезней [10, 5, 13].
Известно, что в структуре этих заболеваний основная этиологическая роль принадлежит герпесвирусу типа I, возбудителю вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС), вирусу парагриппа-3 (ПГ-3), респираторно-синцитиальному вирусу (РС), аденовирусам КРС I и II подгрупп. Значение их в инфекционной патологии связано с широким, а по мнению многих авторов, повсеместным распространением, многообразием клинических проявлений, способностью к латенции, тяжестью течения инфекций и экономическим ущербом [2, 8, 14]. При этом немаловажную роль играют также патогенные виды хламидий, микоплазм, бактерий и их ассоциации. В этой ситуации заболеваемость телят достигает 80-100 %, сопровождается частыми рецидивами и гибелью от 20-30 до 50 % больных животных [4, 12, 7].
Однако среди этой обширной группы возбудителей инфекционных заболеваний долгие годы малоизвестными и неизученными в нашей стране оставались парвовирусы и реовирусы крупного рогатого скота, обладающие, безусловно определенной патогенной потенцией. Инфекционный процесс усугубляется тем, что эти вирусы в комбинации друг с другом вызывают смешанную инфекцию, приводящей к более тяжелому заболеванию и чаще с летальным исходом [9, 16].
Степень разработанности проблемы. В зарубежной литературе достаточно полно раскрыта природа и степень распространенности парвовирусной и реовирусной инфекций, вызываемых вирусами первого серотипов среди различных возрастных групп КРС. Во многих странах Европы созданы средства иммунопрофилактики, обладающие широким спектром специфической защиты. Немецкая компания «Hoecht Veterinr GmbH» производит вакцины ассоциированные «Laсtovaс», «Bovigrip», «Bovigrip plus», содержащие инактивированные антигены парво-, реовирусов I серотипа, для активной иммунизации скота по различным программам в зависимости от эпизоотической ситуации [17].
Отечественными исследователями [15] разработаны иммуноферментные тест-системы, предназначенные для индикации антигена и выявления антител к парвовирусу крупного рогатого скота III-го серотипа, отличающегося в антигенном отношении от парвовируса I-го серотипа.
В РФ до настоящего времени изучению парвовирусной и реовирусной инфекций I-го серотипа не уделялось достаточного внимания как к потенциальным этиологическим агентам в патологии крупного рогатого скота, что сдерживало разработку средств лабораторной диагностики и специфической профилактики. Существующие моно-, би- и поливалентные вакцины против ИРТ, ПГ-3, ВД-БС и РС-инфекций не решают проблему сохранности молодняка, хотя при их использовании заболеваемость уменьшается, но все же решительного перелома не достигается, и пока нет таких вакцин, обеспечивающих полную защиту [1, 11].
Таким образом, решение таких вопросов, как изучение особенностей эпизоотологии болезней, постинфекционного иммунитета, разработка методов и средств лабораторной диагностики и специфической профилактики парвовирусной и реовирусной инфекций является актуальной задачей.
Цели и задачи. Целью исследований явилась разработка технологии изготовления иммуноферментных тест-систем, предназначенных для серологической диагностики парвовирусной и реовирусной инфекций крупного рогатого скота и ассоциированной вакцины для специфической профилактики парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота.
В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:
1. Изучить распространенность парвовирусной и реовирусной инфекций крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Приволжского федерального округа и ряда регионов РФ.
2. Изучить биологические, физико-химические свойства штамма «Parvo 32459» парвовируса типа I и штамма «Reo I Lang» реовируса типа I.
3. Разработать технологию изготовления компонентов тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител, и стандартизировать условия ее проведения.
4. Разработать технологию изготовления компонентов тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета, и стандартизировать условия ее проведения.
5. Разработать технологию изготовления и контроля ассоциированной вакцины против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной.
6. Изучить иммунобиологические свойства моно- и ассоциированных вакцин против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в лабораторных и производственных условиях.
7. Разработать нормативно-техническую документацию по изготовлению и контролю вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи – болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной.
Научная новизна исследований. На основе результатов серо-иммунологического мониторинга впервые представлены данные о степени распространения парвовирусной и реовирусной инфекций крупного рогатого скота в хозяйствах Приволжского федерального округа и ряда регионов РФ.
Изучением иммунобиологических свойств штаммов «Parvo 32459» парвовируса типа I, «Reo I Lang» реовируса типа I обоснован их выбор в качестве производственных, определены параметры культивирования, очистки и концентрирования.
Впервые в РФ разработана:
- технология изготовления «Тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител» (Патент РФ на изобретение №2461008 от 10.09.2012г.);
- технология изготовления «Иммуноферментной тест-системы для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета» (Патент РФ на изобретение №2488117 от 20.07.2013г.). Оптимизированы условия проведения ИФА при исследовании сывороток крови животных, взятых в одном и в четырех разведениях;
- технология изготовления «Вакцины ассоциированной против парво-вирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» (Патент РФ на изобретение №2452512 от 10.06.2012г.).
В результате проведенных исследований определены оптимальные соотношения антигенов и адъюванта, входящих в состав инактивированной ассоциированной вакцины против парвовирусной, реовирусной, герпес-вирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной, а также дозы и схемы введения биопрепарата. Доказана безвредность, ареактогенность и высокая иммуногенность ассоциированной инактивированной вакцины при применении на крупном рогатом скоте.
Теоретическая и практическая значимость исследований. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как дополняют научные знания относительно роли парвовируса и реовируса в патологии крупного рогатого скота и расширяют арсенал отечественных диагностических и профилактических биопрепаратов.
Разработана и внедрена в практику ветеринарных лабораторий РФ «Тест-система ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител», (Регистрирована Россельхознадзором № ПВР-1-6.0/02620 от 30.08.10 г., Сертификат соответствия №РОСС RU.ВП01.H00282).
Разработана и утверждена нормативная и технологическая документация производства биопрепаратов:
- «Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета» (утверждена директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 10.12.2013г.);
- «Вакцина ассоциированная против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» (утверждена заместителем руководителя Россельхознадзора РФ Рег. № ПВР-1-20.13/02940 от 21.08.13 г).
Методология и методы исследования. Для выполнения поставленных задач и достижения цели диссертационной работы применяли эпизоотоло-гические, клинические, патоморфологические, серологические, вирусологи-ческие, культуральные, молекулярно-биологические методы исследования и метод экспериментального заражения восприимчивых животных.
В экспериментах использовали прямые и косвенные методы лабораторной диагностики. Прямые методы: выделение и культивирование парвовируса, реовируса, герпесвируса типа I, вируса вирусной диареи на первичной и перевиваемых культурах клеток, обнаружение геномов парво-, реовируса методом ПЦР. Косвенные методы: серологические методы - РТГА, РН, ИФА для выявления антител к парво-, рео-, герпесвирусу и вирусу вирусной диареи крупного рогатого скота. Подробное описание методологии и методов проведенных исследований отражены в главе «Материалы и методы».
Положения, выносимые на защиту:
1. Серологический мониторинг крупного рогатого скота различных возрастных групп методом РТГА и ИФА в хозяйствах Приволжского федераль-ного округа и ряда регионов РФ позволил выявить распространенность парво-вирусной и реовирусной инфекций и их роль в этиопатогенезе респираторно-кишечных инфекций молодняка и нарушениях функций репродуктивных органов взрослого поголовья скота.
2. Биологические, физико-химические свойства парвовируса типа I (шт. «Parvo 32459») и реовируса типа I (шт. «Reo I Lang»), характеризующие их особенности.
3. Разработанные иммуноферментные тест-системы более эффективны по сравнению со стандартными методами (реакцией торможения гемагглютинации и реакцией вирусной нейтрализации) и позволяют диагностировать парвовирусную и реовирусную инфекции у крупного рогатого скота, а также контролировать напряженность поствакцинального иммунитета.
4. Разработана технология изготовления вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной, которая создает напряженный продолжительный иммунитет и предотвращает вирусемию.
5. На основе оптимизированного сочетания вирусных антигенных компонентов парвовируса типа I, реовируса типа I, герпесвируса типа I, вируса вирусной диареи крупного рогатого скота и масляного адъюванта созданы экспериментальные серии моно- и ассоциированных вакцин, стимулирующих специфическое антителообразование у лабораторных и естественно восприимчивых животных в 1,3 раза более высокого уровня чем гидроокисьалюминиевые.
6. Испытание вакцины ассоциированной против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной в производственных условиях подтвердило ее эффективность: вакцина индуцирует высокий уровень специфических антител, обеспечивает надежную защиту молодняка, стельных коров, нетелей и быков от указанных выше вирусных инфекций.
Степень достоверности и апробация результатов. Статистическую обработку цифрового материала, полученного в трех сериях опытов, проводили методом вариационной статистики с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel. Результаты считали достоверными при Р< 0,05 по критерию Стьюдента.
Основные результаты диссертации доложены на научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2006-2013гг., Всероссийских и Междуна-родных научных конференциях и симпозиумах (Казань, 2007, 2008, 2010, 2011, 2013; Покров, 2008; Харьков, 2013; Саратов, 2013; Москва, 2014; Прага, 2014).
Публикации. Основные результаты докторской диссертации опублико-ваны в 29 печатных работах, в т. ч. 16 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, 9 статей в материалах конференций; получено 3 патента РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах и включает введение, 4 главы, приложения и список литературы, состоящий из 484 источников, в том числе 300 иностранных. Диссертация содержит 47 таблиц и 17 рисунков.
Парвовирусная инфекция крупного рогатого скота .
Изолят «214/72», как прототип идентичный 27 изолятам, был подробно изучен: ЦПД проявлялось в виде гранулированных, круглых, овальных, дегенерированных клеток и полное отслоение разрушенных клеток от стекла через 72 – 96 часов после заражения. Культура клеток семенника теленка оказалась вполне пригодной в качестве субстрата для культивирования. При этом инфекционный титр составлял 6,5 – 8,0 log10 TЦД50/0,1мл, у референтного штамма «Haden» парвовируса типа I эти показатели были в пределах 7,0 – 8,5 log10 TЦД50/0,1мл. В препаратах, выращенных на специальных стеклянных пластинках и фиксированных жидкостью «Карнуа» и окрашенных гематоксилин-эозином, в клетках обнаруживались внутриядерные тельца включения [459]. Аналогичные тельца включения были обнаружены при окраске препаратов акридин-оранжем.
Биофизические, биохимические и биологические свойства полученного изолята полностью соответствовали установленным критериям для вирусов семейства Parvoviridae. В перекрестной РВН он оказался идентичным референтному штамму «Haden» парвовируса КРС типа I [459].
В нашей стране впервые был выделен штамм «B-2» парвовируса КРС в 1972 году из носовой слизи больного теленка с респираторным синдромом [66]. Он оказался устойчивым к воздействию эфира и хлороформа, после обработки ими инфекционный титр вируса не снижался. Был устойчив к прогреванию в течение 30-60 минут при температуре 56 и 60 0С. Проба с 5-йод-2-дезоксиуридином показала его принадлежность к ДНК-содержащим вирусам. Электронная микроскопия методом негативного контрастирования выявляла вирионы парвовируса размером 24±2 нм. Однако, результаты перекрестных реакций в РВН и РТГА показали, что штамм «В-2» не имеет антигенного родства с референтным штаммом «Haden» парвовируса КРС типа I и в отличие от всех, ранее выделенных штаммов, не обладает гемагглютинирующими свойствами в нативном состоянии и отнесен к новому третьему серотипу [88, 348].
Особенности внутриклеточной репродукции и культивирования парвовируса КРС типа I. Репликация ДНК и сборка парвовирусов происходит в клеточном ядре. Относительная простота генома парвовирусов позволяет предположить, что значительная часть функции, необходимого для репликации обеспечивает клетка-хозяин. В случаях автономных парвовирусов для синтеза их ДНК необходимо, чтобы зараженная клетка находилась в ранней S-фазе.
Что касается динамики репродукции парвовируса КРС, следует отметить, что в течение первых 3 часов после заражения монослойной культуры клеток адсорбируется 90 % вируса. Период эклипс фазы длится 16 часов, после чего появляется ЦПД, в том числе внутриядерные включения [324]. Новый вирус в культуральной жидкости обнаруживается через 24 часа после заражения. Максимальный титр в ТЦД50 равен 10-5,5/мл. Гемагглютинины выявляются параллельно инфекционному титру вируса [204]. Титр внеклеточного вируса в течение всего периода репродукции ниже титра внутриклеточного вируса [285, 186].
Вирусный антиген в цитоплазме можно обнаружить методом
флуоресцирующих антител через 6 часов после заражения, через 48 часов происходит поражение ядра и к 72 часу формируются внутриядерные включения типа А Каудри, которые в процессе развития из эозинофильных превращаются в базофильные через 18 – 24 часа после заражения. Большинство вирионов вируса освобождается из клеток к началу проявления ЦПД. В культуре тестикулярных клеток крупного рогатого скота вирус достигает титра 106,75- 108,0. Вновь выделяемые штаммы вызывают ЦПД после 2-5 пассажей [459].
Парвовирус КРС типа I хорошо размножается в первичной культуре клеток легких, селезенки, тестикул, надпочечников и почек эмбрионов коров, отличающиеся высокой восприимчивостью и активностью деления клеток [204, 251, 212].
Для оптимальной репликации парвовируса КРС типа I первичные клеточные культуры готовят из органов эмбриона коровы, используя 0,5 %-ный раствор трипсина для диспергирования эмбриональной ткани. Выращивают на среде Эрла со сбалансированным содержанием солевых растворов и 0,5 % лактоальбумина с добавлением эмбриональной сыворотки коров. После подсчета числа клеток в исходной суспензии, разводят их ростовой питательной средой до концентрации 150 000 – 250 000 клеток на см3 среды. Через 18 – 24 часа после посева и образования сплошного монослоя клеточную культуру промывают один раз фосфатным буфером Дульбекко с целью удаления составной части сыворотки, адсорбируют парвовирус КРС типа I в течение двух часов при 37 0С. После этого клетки промывают дважды и вносят поддерживающую среду.
В зависимости от инокулируемой дозы и митотического показателя заражаемой культуры клеток размножение парвовируса КРС типа I сопровождается развитием цитопатических изменений через 3-5 дней после инфицирования [412], характеризующихся появлением зернистости, округлением и разрушением зараженных клеток.
Изучение биологических и физико-химических свойств парвовируса и реовируса типа
По данным представленным в таблице 2 видно, что специфические антитела выявляются ко всем вирусам, как у коров, нетелей, так и у телят начиная с 10 сут возраста. Полученные результаты свидетельствуют о циркуляции вирусов парагриппа-3, герпесвируса типа I, вируса ВД-БС, парво-, рео- и аденовирусов среди поголовья у разновозрастных групп животных. Одновременное выявление в тестируемых образцах сероконверсии к антигенам нескольких вирусов предполагает об участии последних в формировании смешанных вирусных инфекций крупного рогатого скота.
В настоящее время роль герпесвируса типа I, ВД-БС, ПГ-3 в этиологии респираторно-кишечных инфекций молодняка и репродуктивной патологии маточного поголовья подтверждена многочисленными исследованиями отечественных и зарубежных ученых, однако причастность к этим заболеваниям малоизученных в РФ парвовируса и реовируса типа I в нашей стране не установлена. В связи с этим нами проводились исследования с целью определения степени распространенности парво-, реовирусной инфекций и выявления иммунного статуса больных и переболевших животных различного возраста. Результаты серологического мониторинга в отношении парвовирусной инфекции, проведенные с 2006 по 2013 годы, представлены в таблице 3. Таблица 3 - Серологическое обследование поголовья крупного рогатого скота к антигену парвовируса типа I Регион, область, количество хозяйств Кол-во сыв-ток Всего положительных в РТГА
Из представленных в таблице 3 данных видно, что специфические антитела к парвовирусу выявляли во всех хозяйствах из перечисленных регионов. При исследовании в РТГА 2634 сывороток крови крупного рогатого скота антитела обнаружили в 938 пробах (35,6 %). Распределение уровня специфических антител у глубокостельных коров, нетелей и у телят начиная с 10 сут возраста приведены в таблице 4.
Уровень антигемагглютининов к антигену парвовируса типа I в сыворотке крови крупного рогатого скота различного возраста
С целью установления уровня специфических антител к реовирусу I-го типа нами были изучены образцы сывороток крови от глубокостельных коров, телок случного возраста и от телят до трехмесячного возраста в период с 2009 по 2012 годы (табл. 5).
Из приведенных данных таблицы 5 следует, что процент положительных реакций в диагностических титрах у взрослого поголовья составил в среднем 32,4 % и у телят до трехмесячного возраста – 25,2 %. Причем наиболее высокие титры антител в пределах 1:160 - 1:320, обнаруживаются как у глубокостельных коров и телок случного возраста, так и у телят, что указывает на активность реовирусной инфекции среди поголовья скота.
Обобщение и анализ полученных результатов указывает на факты циркуляции парвовируса и реовируса типа I среди обследованного поголовья животных. Широкому распространению, по-видимому, способствует длительное бессимптомное носительство возбудителей и высокая устойчивость их во внешней среде.
При этом четко обозначилось, что значительный удельный вес среди этиологических агентов принадлежит вирусам ПГ-3, герпесвирусу, вирусу вирусной диареи. Одновременное выявление их в тестируемых образцах сывороток крови у больных и переболевших животных позволяет считать, что последние также участвуют в формировании смешанных вирусных инфекций телят и в нарушении функций репродуктивных органов взрослого поголовья крупного рогатого скота.
Результаты серо-иммунологического мониторинга, явились научной предпосылкой для разработки современных методов и средств лабораторной диагностики и специфической профилактики парвовирусной и реовирусной инфекций крупного рогатого скота.
Разработка технологии изготовления тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител
Таким образом, результаты проведенных экспериментов показали, что анализируемые сыворотки, имеющие Ксв менее 25, с большей вероятностью не содержат специфических антител. Значение ОП490 положительных сывороток в большинстве случаев (98 %) превышало аналогичный показатель отрицательного котроля в 2,1 раза, а Ксв был более 35. На этом основании величина ПНП для Ксв, являющаяся критерием дифференциации положительных и отрицательных проб, при котором минимальное количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов, находится в диапазоне Далее, все пробы, значение Ксв для которых было меньше 25 считали отрицательными, а пробы со значением Ксв равным или превышающим 35 – положительными.
Обнаружение положительных проб сывороток крови в одном разведении при эпизоотологическом обследовании животных, ранее не вакцинированных против парвовирусной инфекции КРС, свидетельствует о циркуляции в стаде возбудителя болезни. При количественном учете результатов исследований сывороток крови в четырех разведениях: 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400, производили расчет коэффициента специфичности. Реакцию считали положительной, если коэффициент специфичности не ниже 2,1 и отрицательной, если ниже 2,1. Выявление динамики роста специфических антител в парных пробах сывороток позволяет диагностировать парвовирусную инфекцию у исследованного поголовья.
Напряженность иммунитета определяли по результатам титрования сывороток в четырех разведениях через 2 – 3 недели после второй вакцинации путем деления количества проб с титром антител 1:400 и выше у вакцинированных телят 10-20 сут возраста, а у глубокостельных коров и телок случного возраста с титром антител 1:800 и выше, к общему количеству исследованных сывороток и выражали в процентах. Относительная чувствительность разработанной тест-системы по
отношению к РВН составляет 96,0 %, и специфичность – 93,82 %; совпадаемость результатов двух методов – 95,1 %. При исследовании сывороток крови в ИФА и РТГА, полученных от заведомо негативных (n=90) и заведомо позитивных животных (n=90), привитых ассоциированной вакциной против парвовирусной, реовирусной, герпесирусной типа I инфекций и вирусной диареи крупного рогатого скота, наблюдалась 100 %-я совпадаемость результатов.
Коэффициент вариации значений Ксв. при исследовании отрицательных проб (n=12) тест-системой ИФА разных серий не превышала 6,72 %, а при исследовании положительных (n=10) – 7,91 %, что соответствует рекомендуемым параметрам.
Для определения срока годности тест-системы из 3 серий опытной партии диагностикума было отобрано по три набора и помещено на хранение. Через 3, 6, 12 и 24 мес упаковку вскрывали и проводили анализ с положительными и отрицательными контрольными сыворотками. Исследования показали, что тест-система сохраняет активность в течение 24 мес, в связи с этим срок годности тест-системы установлен в 12 мес со дня изготовления. По результатам межлабораторной комиссионной апробации разработанной тест-системы ИФА для серологической диагностики парвовирусной инфекции крупного рогатого скота было сделано заключение, что набор препаратов для выявления антител к парвовирусу КРС методом ИФА по своим характеристикам соответствует своему назначению, сопоставим с методом аналогичной направленности может быть рекомендован для проведения широких производственных испытаний. Производственное испытание тест-системы ИФА проводилось путем исследования 493 проб сывороток крови крупного рогатого скота, полученных из хозяйств Республики Татарстан с различной эпизоотической ситуацией, используя испытуемую тест-систему ИФА в сравнении с методом аналогичной направленности РТГА (табл. 19).
Определение оптимальной прививочной дозы вакцины ассоциированной эмульсионной на кроликах
В последние годы стало очевидным, что респираторно-кишечные болезни молодняка и патология репродуктивных органов взрослого поголовья крупного рогатого скота остаются экономически значимой проблемой. В развитии этих форм патологий доминирующими признаны герпесвирус типа I, вирус вирусной диареи-болезни слизистых оболочек, вирус парагриппа-3, респираторно-синцитиальный вирус, аденовирусы I-ой и II-ой подгрупп, парвовирусы и реовирусы, проявляющиеся преимущественно в форме смешанных респираторно-кишечных инфекций и способные также инфицировать плод внутриутробно, индуцируя раннюю эмбриональную смертность и аборты [23, 69].
Учитывая сходные эпизоотологические данные, клинические признаки и патологоанатомические изменения, вызываемые данной группой возбудителей, особую роль в диагностике занимают лабораторные исследования, которые включают обнаружение антител в сыворотке крови больных и переболевших животных в РН, реакции торможения гемагглютинации (РТГА) и методом иммуноферментного анализа, а также выделение возбудителя из патологического материала в культурах клеток [28, 39, 16, 58].
Возбудителями этих инфекций в большинстве случаев являются герпесвирус типа I КРС, вирус диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, респираторно-синцитиальный вирус, парво- и реовирусы [121, 114, 82, 353].
В настоящее время парво- и реовирусная инфекции крупного рогатого скота являются мало изученными в РФ и проявляются в форме желудочно кишечной, респираторной болезни, а также вызывают патология репродуктивных органов. Большое значение в эпизоотическом процессе при реовирусной инфекции является латенция вируса, а при парвовирусной 181 способность возбудителя преодолевать плацентарный барьер и вызывать эмбриональную смертность.
Распространению их способствуют: большая концентрация животных, поступающих из различных в эпизоотическом отношении хозяйств, все более усиливающаяся индустриализация содержания и эксплуатации, широкий обмен животными внутри страны и завоз из-за рубежа ценных высокопродуктивных животных, трудности организации непрерывного производства полноценного кормления и создания оптимального микроклимата. Поэтому создаются благоприятные условия для циркуляции и усиления вирулентности перечисленных выше возбудителей, которые чаще всего в ассоциации, на фоне факторов стресса способны вызывать эпизоотический процесс.
В этой связи разработка современных методов серологической диагностики для изучения распространенности парво-, реовирусной инфекций и создание средств специфической профилактики на основе данных развития эпизоотического процесса является актуальной задачей [123].
По данным серомониторинга, проведенного нами в регионе Среднего Поволжья в 2007-2011 годах, серопозитивность крупного рогатого скота к парвовирусной инфекции составила 47 %, к реовирусной инфекции – 24 %. Полученные результаты указывают на факт циркуляции этих возбудителей среди различных возрастных групп крупного рогатого скота.
Наблюдаемая динамика сероконверсии к парвовирусу и реовирусу типа I легла в основу разработки тест-систем ИФА для серологической диагностики парвовирусной и реовирусной инфекций.
Одним из важных условий при разработке технологии изготовления эффективных диагностических тест-систем является использование штаммов вируса со стабильной иммунобиологической активностью [140]. В связи с этим первоначальным этапом работы явилось изучение иммунобиологических свойств парвовируса типа I (штамм «Parvo 32459») и реовируса типа I (штамм «Reo 1 Lang») прошедших больше 8 и 13 пассажей соответственно.
Несмотря на то, что парвовирус типа I и реовирус типа I относятся к разным семействам, объединяет их общее свойство – способность агглютинировать эритроциты.
Парвовирус крупного рогатого скота антигенно отличается от парвовирусов других видов животных и человека. Различие гемагглютинирующей активности штаммов парвовируса может служить генетическим признаком и учитываться при их идентификации [88]. Изучением гемагглютинирующих свойств штамма «Parvo 32459», нами установлено, что он агглютинирует эритроциты морской свинки, человека (группы 0), крысы, барана, собаки, петуха. Гемагглютинация наблюдалась в более высоких титрах при температуре 4 0С. Полученные результаты согласуются с данными Huck D.W., J.P. Woods (1975) [292].
Реовирусы так же способны связываться с рецепторами на поверхности эритроцитов, вызывая их агглютинацию. Эритроциты человека агглютинируют все три серотипа реовирусов, а эритроциты быка – только реовирус типа 3 [398, 392]. Типоспецифичность гемагглютанции определяется природой сегмента S1 и соответствено белком 1. Белок 1 играет главную роль в реакции подавления гемагглютинации и служит типоспецифическим антигеном для антител подавляющих гемагглютинацию [466].
В наших исследованиях штамм «Reo I Lang» реовируса типа I агглютинировал эритроциты человека 0-группы, свиньи в титре 1:32, эритроциты крысы, барана, собаки, петуха, кошки, белой мыши, коровы, козы, морской свинки в титре – 1:2 - 1:4 при комнатной температуре. При температуре 4 0С эти показатели снижались. Результаты проведенных нами исследований совпадают с данными А. Усманходжаева и Л.Я. Закстельской (1965) [162]. Ряд исследователей установили, что гемагглютинин у реовирусов стабилен в диапазоне от 4 до 37 0С и инактивируется при 56 0С. Колебание рН в зоне 6,0 - 8,0 на результаты реакции не оказывает существенного влияния [280]. Связь вируса с эритроцитами очень прочна, даже спустя 48 ч элюции не происходит [162].
