Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Особенности распространения и клинического проявления вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 10
1.1.1. Характеристика возбудителя 13
1.1.2. Пути и способы передачи вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 18
1.1.3. Основные клинические формы проявления вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 19
1.2. Современные методы диагностики вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 24
1.2.1. Особенности выделения вируса в различных культурах клеток 24
1.2.2. Серологические методы диагностики вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 25
1.2.3. Молекулярно-генетические методы диагностики вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 27
1.2.3.1. Разработка и использование метода молекулярных зондов 27
1.2.3.2. Метод полимеразной цепной реакции 27
1.2.3.3. Генотипирование и филогенетический анализ 28
1.3. Родственные связи вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота с представителями рода Pestivirus
1.4. Имуносупрессивное действие и особенности интерферон-индуцирующей активности цитопатогенных и нецитопатогенных изолятов вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 31
1.5. Заключение по обзору литературы 34
2. Собственные исследования 36
2.1. Материалы и методы 36
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Распространение вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на территории Сибири 41
2.2.2. Выделение и характеристика изолятов вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота от
больных животных 49
2.2.3. Типизация и филогенетический анализ выделенных изолятов вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 63
2.2.4. Изучение влияния антигенной вариабельности изолятов вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на результаты серологических исследований 3. Обсуждение полученных результатов 80
4. Выводы 95
5. Практические предложения 96
6. Литература
- Основные клинические формы проявления вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота
- Молекулярно-генетические методы диагностики вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота
- Распространение вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на территории Сибири
- Типизация и филогенетический анализ выделенных изолятов вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота
Введение к работе
Актуальность темы. Вирусная диарея – болезнь слизистых оболочек (ВД-БС) – контагиозное заболевание, вызываемое РНК-содержащим вирусом, распространенное во всем мире в популяции крупного рогатого скота (КРС).
Возбудитель болезни относится к роду Pestivirus семейства Flaviviridae и существует в виде двух биотипов: цитопатогенного и нецитопатогенного, а также – двух генотипов (C. Pellerin et al., 1994; J.F. Ridpath et al., 1994).
Штаммы первого генотипа, включающего 11 субгенотипов, распространены во всем мире (S. Vilcek et al., 2001). Второй генотип вируса ВД-БС КРС представлен двумя субгенотипами и выделяется от больных животных значительно реже (J.F. Ridpath et al., 2005). Кроме отличий на генетическом уровне у вируса выявлены некоторые антигенные различия, которые значительно выше в пределах одного генотипа, чем между генотипами (M. Nagai et al., 2001; L. Jones et al., 2001; R.W. et al., 2005).
Возбудитель может отрицательно воздействовать на все стадии производства животноводческой продукции (С.И. Жидков и соавт., 1994, 1995; К.П. Юров и соавт., 2003; М.И. Гулюкин и соавт., 2007), но наиболее характерными и экономически значимыми последствиями этой инфекции для индустрии скотоводства являются репродуктивные проблемы и болезни респираторного тракта.
С эпизоотологической точки зрения наиболее опасными являются острые (транзитные) формы инфекции, а также персистентная. Кроме того, вирус способен вызывать иммунотолерантные эмбриональные инфекции, что приводит к рождению персистентно инфицированных (ПИ) телят, служащих постоянным источником и резервуаром возбудителя инфекции в популяции КРС.
По данным зарубежных авторов наибольшее эпизоотологическое значение имеет нецитопатогенный биотип вируса, т.к. только он способен преодолевать трансплацентарный барьер и вызывать персистентную форму инфекции (J. Brownlie et al., 1989; S.R. Bolin, 1992; D.Deregt, K.G. Loewen, 1995; B. Charleston et al., 2001). Значение его раньше несколько недооценивалось.
Известно, что животные, переболевшие ВД-БС КРС в острой форме, приобретают пожизненный иммунитет к инфицирующему штамму вируса, однако полностью или частично восприимчивы к инфицированию штаммами других генетических групп (R.W. 2005). Поэтому большое значение в возникновении клинических признаков инфекции имеет факт смешивания животных из различных источников на конкретной территории.
В настоящее время в России возрастает удельный вес хозяйств по производству молока. В некоторые из них осуществляется завоз КРС из других стран или регионов России, часто сопровождающийся концентрацией животных на ограниченных территориях. Это приводит к обмену инфекционными агентами, имеющими различия на генетическом и антигенном уровне, к которым нет иммунитета у местных и импортных животных, а также – инфицирование вновь поступивших вирусом ВД-БС КРС других субгенотипов, стационарно персистирующим в хозяйстве. В результате возникают клинические проявления болезни.
Одной из главных проблем серологической диагностики является недостаточная стандартизация методик и антигенная вариабельность вируса (J.T. Saliki, E.J. Dubovi, 2004).
Учитывая особенности современного ведения животноводства, предполагающие повышение продуктивности, концентрации на ограниченных территориях, а также – импорт животных, важным является изучение особенностей распространения вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота в этих условиях, молекулярно-биологических свойств вируса.
Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить особенности распространения и клинического проявления вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, получить изоляты вируса и изучить их молекулярно-биологические свойства.
Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:
1. Изучить особенности распространения вирусной диареи-болезни слизистых оболочек на территории Сибири среди импортного и местного крупного рогатого скота, а также одомашненных оленей и маралов.
2. Выявить генетическую вариабельность изолятов вируса, относящихся к различным биотипам, выделенных от импортного и местного скота, а также – установить их связь с клиническими формами проявления болезни.
3. Определить влияние антигенной вариабельности вируса на результаты серологических исследований.
Научная новизна работы.
1. Подтверждено распространение вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота среди популяций животных на территории Сибири.
2. Проведено выделение и генетическое типирование полевых цитопатогенных и нецитопатогенных изолятов вируса, определен спектр их субгенотипов и роль в возникновении респираторных болезней телят и гинекологической патологии коров. Впервые на территории России от местного крупного рогатого скота выделен нецитопатогенный изолят вируса второго генотипа.
3. Изучено влияние антигенной вариабельности вируса ВД-БС КРС на уровне субгенотипов на результаты серологических исследований.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как дают возможность расширения научных знаний относительно роли нецитопатогенного биотипа вируса ВД-БС КРС 1-го и 2-го генотипов в возникновении респираторных болезней телят и гинекологической патологии коров.
Данные по генетической и антигенной гетерогенности его популяции необходимо учитывать при разработке диагностических тест-систем и при проведении диагностических исследований. Они могут быть использованы при дальнейшем изучении молекулярной эпизоотологии ВД-БС КРС с целью совершенствования специальных профилактических мероприятий.
Разработаны рекомендации «Диагностика вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота», рассмотренные и утвержденные подсекцией «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 30.10.07).
Апробация полученных результатов. Материалы исследований доложены на: международной конференции «Состояние и перспективы диагностики инфекционных болезней животных», Астана, 2008; международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Х. Саркисова «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел», Москва, 2009; II Сибирском ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины», Новосибирск, 2010; международной научно-практической конференции «Инновационные подходы в ветеринарии, биологии и экологии», Троицк, 2010; VI международной конференции молодых ученых, посвященной 40-летию СО Россельхозакадемии «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых», Краснообск, 2010.
Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ («Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Ветеринария» и «Ветеринарная патология»).
Внедрение результатов исследования. Результаты научных исследований использованы при составлении рекомендаций «Диагностика вирусной
диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота», рассмотренных и утвержденных подсекцией «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» секции инфекционной патологии отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 29.09.08).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, приложений, иллюстрирована 5 рисунками и 16 таблицами. Список литературы представлен 225 источниками, в том числе 145 зарубежными.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Результаты изучения распространения ВД-БС КРС на территории Сибири среди импортированного и местного крупного рогатого скота, одомашненных северных оленей и маралов.
2. Данные по изучению биологических свойств и генетической вариабельности изолятов вируса, выделенных от животных с разными клиническими формами болезни, а также влияния антигенной вариабельности вируса на результаты серологических исследований.
Основные клинические формы проявления вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота
Вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС) — широко распространенное во всем мире, инфекционное контагиозное заболевание, характеризующееся эрозийно-язвенным воспалением слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, ринитом, увеличением лимфатических узлов, высокой лихорадкой, общим угнетением, лейкопенией, постоянной или перемежающейся диареей, эрозийным и язвенным стоматитами с обильным слюноотделением, слизисто-гнойными выделениями из носа. Болеют преимущественно молодые животные. У коров возможны аборты, а также внутриутробное инфицирование и гибель плодов.
Как самостоятельное заболевание ВД-БС КРС зарегистрировано в США P. Olafson et al. в 1946 г. Они сообщали о совершенно новой в то время болезни у крупного рогатого скота, характеризовавшейся острым гастроэнтеритом и эрозиями в пищеварительном тракте.
Долгое время ВД и БС считались разными заболеваниями, поскольку имелись различия в клиническом проявлении. ВД рассматривалась как энзоотическая болезнь со спорадическими вспышками с высокой заболеваемостью, но низкой смертностью. А БС, наоборот, вызывала низкую заболеваемость, но смертность молодых телят до 100%.
Решающим в установлении антигенного родства двух вирусов было открытие того, что сыворотка КРС с типичными признаками БС или ВД могла нейтрализовать цитопатогеное действие (ЦПД) вируса в культуре клеток (K.V.P. Jubb et al, 1963).
К концу 60-х гг. для характеристики заболевания был принят термин вирусная диарея - болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота (ВД-БС КРС).
В 1984 г. J. Brownlie et al. удалось воспроизвести классическую болезнь слизистых при помощи штамма вируса ВД и доказать, что она проявляется только у персистентно инфицированных нецитопатогенным штаммом вируса ВД-БС КРС животных после их суперинфекции антигенно родственным цитопатогенным штаммом вируса.
По данным целого ряда исследователей ВД-БС КРС широко распространена во многих странах мира и наносит значительный экономический ущерб животноводству (D.J. Paton, 1992; С. Pellerin et al., 1994; J.C. Baker, 1995; D. Deregt et al., 1995; D. Sockett et al, 1996; P.D. Kirkland, et al. 1997; S. Vilcek et al., 2000; M. Nagai et al., 2001; E. Peterhans et al., 2003; A. Lindberg, 2003; A.F. Viet, С Fourichon, 2004; R.W. Fulton et al., 2005; С Bachofen et al., 2005; J.F. Ridpath, 2005; L. Rong et al., 2007; С Bachofen et al., 2008; F. Minami et al., 2009).
В России заболевание впервые было зарегистрировано и описано в 1967 г. К.Н. Бучневым, а затем В.Г. Макаревичем и В.П. Назаровым (1967).
В настоящее время болезнь регистрируется практически во всех регионах Российской федерации и странах СНГ (Г.А. Халенев, 1983; Т.Г. Ким и соавт., 1987; П.А. Красочко, 1991; С.А. Жидков и соавт., 1995; Е.С. Воронин и соавт., 1999; И.П. Иванова и соавт., 2000; А.И. Высокопо-ясный, 2000; А.Г. Шипицин и соавт., 2001; П.Н. Сисягин и соавт., 2002; Н.Ю. Басова, 2002; О.Г. Петрова и соавт., 2002; Э.А. Шегидевич и соавт. 2003; К.П. Юров и соавт., 2003; М.И. Шульпин и соавт., 2003; В.А. Гоппе, 2005; А.Г. Глотов и соавт., 2006; Т.И. Глотова, 2006; М.И. Гуі люкин и соавт., 2007; В.А. Мищенко и соавт., 2008). При этом следует от--метить, что с момента описания в нашей стране случая вирусной диареи КРС в 1967г. по данным, предоставляемым в МЭБ, заболевание в СССР регистрировалось в единичных случаях на ограниченных территориях, либо вовсе отсутствовало. С 1995 года в бюллетене МЭБ перестали публиковать данные по заболеваниям животных списка С. Сомнительно, что широкое распространение вируса произошло в наше время. По-видимому, это противоречие связано с развитием лабораторных методов выявления возбудителя данного заболевания (М.И. Шульпин, 2004).
ВД-БС КРС носит энзоотичный характер, что затрудняет проведение мероприятий по ее искоренению. Серопозитивность скота в странах с развитым животноводством составляет 60-85% (P.D. Kirkland et al., 1993; L. Clayton, D. Kelling et al., 2000; A.L.E. Lindberg, 2002; A.F. Viet, C. Fourichon et al., 2004). На территории России болезнь встречается во многих регионах в виде энзоотических вспышек. Серопозитивность животных колеблется в пределах 70-100% (П.Н. Сисягин и соавт., 2002; Э.А. Шегидевич и соавт., 2003; А.Г. Глотов и соавт., 2005; М.И. Гулюкин и соавт., 2007; А.С. Макаримов и соавт., 2008; Ю.А. Шпякин, Н.И. Закут-ский, 2009). Сероконверсию к вирусу ВД-БС КРС в период острых вспышек удается выявить в 20-30% случаев (Т.И. Глотова, 2006).
В Сибири по данным А.Г. Глотова и соавт., наибольшее распространение ВД-БС КРС получила в хозяйствах Кемеровской области (85,6%), Республики Бурятия (78,6%) и Тюменской области (75,0%). В Красноярском крае выявили 73,7% положительно реагирующих животных, в Новосибирской области 66,4%, а в Курганской - 64,8% (А.Г. Глотов и соавт., 2006). Наибольшее распространение ВД-БС КРС получает в хозяйствах с интенсивным ведением животноводства (Т.И. Глотова, 2006).
Молекулярно-генетические методы диагностики вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота
Установлено, что вирус ВД-БС КРС оказывает иммуносупрессивное действие, связанное с подавлением защитной функции и разрушением инфицированных лимфоцитов и лейкоцитов, понижением миграционной способности нейтрофилов (СМ. Усов, 1998; В.А. Мищенко и соавт., 2006; J.A. Roth et al., 1986). При ВД-БС отмечали двукратное уменьшение числа Т-супрессоров с сохранением количества Т-хелперов, снижение количества иммуноглобулинов (С.С. Muscoplat et al., 1973), экспрессию комплемента и Fc-рецепторов, а также выработку хемокина (M.D. Welsh et al., 1995), снижение хемотаксиса (А.Т. Ketelsen et al., 1979), подавление формирования лейкотриена (D. Atluru et al., 1992), увеличение выработки про-стагландина Е2 (M.D. Welsh, В.М. Adair, 1995; К. Van Reeth, 1997).
У экспериментально инфицированных животных выявляли снижение количества В-лимфоцитов и моноцитов, которое бывает переходящим и нормализуется к 30-му дню после заражения, лимфоцитопению и лейкопению, повреждение В-клеток и Т-клеточных субпопуляций (S.R.Bolin, R.C.Cutlip, 1985). Иммуносупрессивное действие вируса ВД-БС КРС также может быть обусловлено ингибированием интерлекина -1 (J. Jensen, 1991).
Возникновение той или иной формы ВД-БС у восприимчивых животных может зависеть от наличия и активности интерферона (ИФН) 1 типа (М.Г. Романцов и соавт., 1998; Ю.Н Федоров, 2000; 2005; 2006; В. Charleston et al., 2001; Е. Peterhans et al., 2003). Среди сигналов, связывающих врожденную и адаптивную иммунные системы, ИФН является ключевым, его противовирусная активность реализуется через подавление проникновения вирусной частицы в клетку, ингибицию трансляции вирусного белка, а также через блокирование процессов сборки вирусной части цы и ее выхода из инфицированной клетки (В.П. Кузнецов 1987; Ф.И. Ершов, 1980; Ю.Н Федоров, 2006; CJ. Howard, 1990; М. Larsson et al., 2001). Существует мнение, что формирование персистентной формы ВД-БС происходит, главным образом, за счет угнетения выработки этого цитокина, являющегося ключевым регулятором функций иммунной системы (C.R. Rinaldo, 1976; SJ. Skidmore, 1987; Е. Peterhans et al., 2003).
Получены результаты исследований по определению индукции ИФН типа 1 макрофагами после воздействия на них НЦП и ЦП изолятов вируса ВД-БС КРС, свидетельствующие о различиях в их интерферон-индуцирующей активности (В. Adler et al., 1997; L. Perler et al., 2000).
Установленная у НЦП изолятов недостаточная выработка ИФН, может быть преимуществом вируса и обусловлена неспособностью к индукции апоптоза. ЦП изоляты, напротив способны индуцировать выработку ИФН в организме зараженных животных, что является косвенным свидетельством их вирулентности (М. Schweizer, 1999; Е. Peterhans et al., 2003).
По данным М. Schweizer et al. инфекция НЦП вирусом существенно ингибировала индукцию апоптоза и экспрессию ИФН типа 1(М. Schweizer et al., 2001). Е. Peterhans et aL высказали гипотезу, что НЦП вирусы могут специфически ингибировать защитные механизмы врожденнойиммунной системы (Е. Peterhans et al., 2003).
Интерфероновый ответ реализован фактически во всех клетках многоклеточных животных и может быть активирован уже с самого раннего времени оплодотворения (I. Splichal et al., 1994). Установлено, что телята могут устанавливать адаптивные иммунные ответы только после созревания иммунной системы, в возрасте 4 месяцев (CD. Gibson et al., 1973).
В свете роли интерферонового ответа в запуске адаптивного иммунного ответа можно предположить, что недостаток выработки ИФН может быть критическим для установления иммунологической толерантности и, следовательно, персистенции НЦП вируса в развивающемся плоде (В. Adler et ah, 1997). Маловероятно, что агент, запускающий ИФН ответ и непосредственно чувствительный к его действию, мог быть способным к установлению иммунологической толерантности. Это понятие является истинным для ЦП вируса. Доказано, что НЦП вирус устанавливает имму-нотолерантность и персистентную форму инфекции в определенный отрезок времени внутриутробного развития плода от 40 до 120 дней стельности (S.R. Boiin, 1995). Используя экспериментальное заражение эмбрионов КРС, B.Charleston и соавт. ранее демонстрировали, что плоды не отвечают на НЦП вирус выработкой ИФН во время этого периода, тогда, как животные, инфицированные постнатально, вырабатывают его, если инфицированы ЦП вирусом (В. Charleston et al, 2001). Кроме того, эти авторы показали, что плоды, у которых отмечался сбой в выработке ИФН при ответе на НЦП вирус, вырабатывают ИФН в ответ на этот вирус при постнаталь-ном инфицировании.
Макрофаги, созревшие in vitro из клеток костного мозга плода, также как и макрофаги из моноцитов крови взрослых животных не могут вырабатывать ИФН в ответ на НЦП вирус. Возможно, что выработка ИФН на НЦП биотип вируса ВД-БС КРС обусловлена другой клеткой, еще не присутствующей у плода во время критического периода внутриматочного развития. Напротив, неудача НЦП вируса в установлении персистентной инфекции у плода в период до 40 дня эмбрионального развития может быть вызвана интерфероном, вырабатываемым в очень высоких концентрациях трофобластами КРС во время самой ранней стадии стельности. Его основная функция состоит в поддержании стельности путем предотвращения лютеолиза в яичниках коровы (G.E. Mann et al., 1999). ИФН-т также обладает противовирусной активностью и может предотвращать инфекцию эмбриона (А.Р. Alexenko et al., 1999).
Распространение вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота на территории Сибири
Сведения о выделении и характеристиках изолятов вируса ВД-БС КРС в России фрагментарны. Выделенные ранее на территории Российской Федерации и охарактеризованные изоляты вируса относились, в основном, к цитопатогенному биотипу первого генотипа (С .А. Жидков и со-авт., 1994, 1995; Т.И. Глотова и соавт., 2005).
Методом ПЦР исследовали 1275 проб биоматериала от телят до 6-ти месячного возраста, нетелей, коров и быков-производителей, полученных из хозяйств с различной степенью инфицированности вирусом ВД-БС КРС. Вирус удалось выделить в культуре клеток из 38,12% проб биоматериала от телят, в то время как методом ПЦР его РНК выявляли в 52,31% (табл. 7). Результаты выявления положительных проб на ВД-БС КРС методом ПЦР и выделение вируса в культуре клеток Область, край,республика, количество хозяйств Количество исследованных проб Количество положительных проб/% Количество проб, из которыхвыделили вирус в культуре клеток/%
Для проведения процедуры изоляции вируса ВД-БС КРС из проб биоматериала (влагалищные истечения, кусочки легкого) готовили 10% -ную суспензию на стерильном фосфатно-буферном растворе, рН 7,4-7,6. Ткань растирали в стерильной ступке с битым стеклом до полной гомогенизации. К взятой навеске материала добавляли 9 частей буферного раствора, чтобы получить 10%-ную концентрацию исходного материала. После добавления антибиотиков (100 ед./мл канамицина и 500 ед./мл гента-мицина) суспензию выдерживали при 4С в течение 2-3 часов. Центрифугировали 30 минут при 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливали в стерильные флаконы и использовали для вирусовыделения. Для этого про бирки с монослоем клеток КСТ отмывали поддерживающей средой Игла MEM и заражали по 0,2-0,3 мл каждым испытуемым материалом. Для адсорбции вируса пробирки с клетками выдерживали в термостате при 37С в течение 60 минут, затем из них удаляли испытуемый материал и добавляли 1 мл поддерживающей питательной среды. Одной пробой биоматериала заражали 4 пробирки. Для контроля оставляли пять пробирок с культурой клеток, в которых заменяли ростовую среду поддерживающей. Зараженные и контрольные культуры клеток инкубировали при 37С до 7 суток, ежедневно просматривая их с целью выявления ЦПД.
Выделение вируса из спермы проводили в соответствии со стандартом МЭБ (2000). Для этого 200 мкл свежего не разведенного семени смешивали с 2 мл фетальной сыворотки с антибиотиками, тщательно перемешивали и выдерживали в течение 30 минут при комнатной температуре. Вирусовыделение проводили в монослое культуры клеток КСТ с использованием 24-луночных культуральных планшетов. Для заражения на каждую лунку использовали 0,5 мл смеси сыворотки со спермой. После 1 часовой адсорбции вируса удаляли смесь, отмывали монослой дважды и вносили 1 мл поддерживающей среды.
Адсорбцию вируса на клетках проводили при 37С в течение 60 мин, затем из лунок удаляли испытуемый материал и добавляли 1 мл поддерживающей питательной среды. На одну пробу использовали не менее 4 лунок с монослоем культуры клеток 24-луночного планшета. Контролем служили 4 лунки с неинфицированной культурой клеток, в которых заменяли ростовую среду поддерживающей. Зараженные и контрольные культуры клеток инкубировали при 37С и 5% СОг до 7 суток, ежедневно просматривая их с целью выявления ЦПД.
Идентификацию выделенных ЦП-агентов проводили в реакции нейтрализации при помощи моноспецифической сыворотки, полученной к референтному штамму ВК-1. Параллельно вирус титровали с нормальной сывороткой. Индекс нейтрализации, равный 2 1ТЦД5о/Смз и выше свидетельствовал о принадлежности изолята к вирусу ВД-БС КРС.
Определение антигенного родства изолятов проводили в перекрестной реакции нейтрализации с сыворотками, полученными на выделенные ЦП-агенты и референтный штамм вируса ВК-1. Степень антигенного родства рассчитывали по формуле R%=10(Wri г2, где: индекс нейтрализации сыворотки 1 к вирусу 2 индекс нейтрализации сыворотки 1 к вирусу 1 1 2 = индекс нейтрализации сыворотки 2 к вирусу 1 индекс нейтрализации сыворотки 2 к вирусу 2
Учитывая то, что около 90% изолятов вируса ВД-БС КРС представляют нецитопатогенный биотип, после завершения процедуры выделения вируса в культуре клеток ее проверяли на его присутствие при помощи разработанной в лаборатории биотехнологии-диагностическом центре ГНУ ИЭВС и ДВ Россельхозакадемии диагностической тест-системы, позволяющей выявлять РНК вируса ВД-БС КРС в различных пробах биоматериала методом ПНР.
В культуре клеток КСТ на 3-5 сутки инкубирования при 37С к 3-5 пассажам цитопатогенные изоляты вируса ВД-БС КРС вызывали ЦПД и накапливались в титрах от 4,75 до 6,5 lg ТЦД5о/Смз Цитопатический эффект вируса ВД-БС КРС выражался в появлении мелкоочаговой, мелкозернистой дегенерации и округлении клеток, истончении и разрыве клеточного монослоя и отслоении клеток. В некоторых случаях наблюдали вакуолизацию цитоплазмы пораженных клеток. Конечная картина ЦПД выражалась в гибели клеток, отслоении в культу-ральную жидкость и наличии на поверхности их роста отдельных тяжей и фрагментов.
Изоляты вируса ВД-БС КРС культивировали на трех видах чувствительных к нему линий культур клеток - перевиваемые культуры клеток ко ронарных сосудов теленка (КСТ) и почки теленка (MDBK), и первично трипсинизированная культура клеток тестикул бычка (ТБ).
В культуре клеток КСТ на 3 - 5 сутки инкубации при 37С к 3 — 5 пассажу цитопатогенные и нецитопатогенные агенты накапливались в титрах от 4,5 до 6,5 lg ТЦД5о/смз- К 10 пассажу цитопатогенные изоляты вызвали ЦПД на 1 — 2 сутки культивирования в дозе заражения 1 ТЦД50/смз на клетку.
В культуре клеток MDBK на 4 - 5 сутки инкубации при 37С к 3 — 5 пассажу цитопатогенные и нецитопатогенные агенты накапливались в титрах от 3,25 до 4,5 lg ТЦЦ50/смз.
В культуре клеток ТБ на 3 - 5 сутки инкубации при 37С к 3 - 5 пассажу цитопатогенные и нецитопатогенные агенты накапливались в титрах от 5,25 до 6,75 lg ТЦД50/см3.
В результате проведенных исследований 91,56% выделенных изоля-тов вируса ВД-БС КРС были отнесены к нецитопатогенному биотипу, соответственно 8,44% — цитопатогенному.
Размножение нецитопатогенных изолятов вируса ВД-БС КРС не сопровождалось видимыми морфологическими изменениями клеток и не вызывало деструкцию монослоя культуры клеток (рис. 1 - 3).
Типизация и филогенетический анализ выделенных изолятов вируса вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота
Известно, что первый генотип вируса ВД-БС КРС распространен повсеместно во всем мире. Штаммы вируса ВД-БС КРС второго генотипа циркулируют преимущественно в США и Канаде, а в Европе, Азии и Южной Америке регистрируют лишь спорадические случаи вызванной им инфекции у восприимчивых животных.
Хотя оба генотипа вируса способны вызывать болезнь, но установлено, что клинически тяжелая, сверхострая инфекция ВД-БС КРС вызывается только нецитопатогенным вирусом типа 2 (С. Pellerin et al., 1994; J.F. Ridpath et al., 2005). В некоторых источниках литературы обсуждается вопрос о выделении третьего (лимфотропного) биотипа вируса ВД-БС КРС.
Ряд исследователей приводит доказательства связи между генотипом вируса и клиническими симптомами, которые он вызывает у восприимчивых животных. Описаны случаи выделения от телят с респираторными и желудочно-кишечными болезнями чаще нецитопатогенных изолятов вируса ВД-БС КРС первого генотипа.
Установлено, что изоляты вируса ВД-БС КРС второго генотипа выделяются от животных с признаками сильной тромбоцитопении и геморрагического синдрома, однако не все из них способны вызывать данную патологию.
В некоторых литературных источниках высказывается предположение о том, что в природе существуют и авирулентные изоляты вируса ВД-БС КРС второго генотипа, количество которых преобладает над вирулентными (С. Hamers et al., 2000; J.T. Saliki, E.J. Dubovi, 2004).
В своих исследованиях мы проводили генотипирование изолятов вируса ВД-БС КРС, выделенных от крупного рогатого скота, методом ПЦР при помощи тест-системы, разработанной в лаборатории биотехнологии-диагностическом центре ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии.
Тест-система предназначена для выявления РНК вируса ВД-БС КРС методом полимеразной цепной реакции в биологическом материале от животных и в инфицированных культурах клеток. В случае положительной реакции возможно последующее типирование на 1 и 2 генотипы методом ПЦР, а также - субгенотипы вируса 1а и lb.
В основе метода ПЦР лежит амплификация специфического участка кДНК вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота за счет многократного повторения циклов денатурации кДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (прай-меров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы. Данная ПЦР позволяет выявлять субгенотипы 1а и lb генотипа 1 вируса ВД-БС КРС. В результате проведенных исследований провели генотипирование 16 изолятов вируса ВД-БС КРС.
Результаты исследований представлены в таблице 12. Из данных таблицы 12 видно, что к первому генотипу вируса ВД-БС КРС, субгенотипу 1а принадлежат 6 изолятов вируса ВД-БС КРС (Т-1, СВ-4, Маяк, С-1, Ембаевский, Т-2), а к субгенотипу lb — 8 изолятов вируса (И-4, Солгон, РА, Кремлевский, Ирмень 01/06, Бор, Бон, 1140). При помощи данной тест-системы не удалось определить принадлежность к субгенотипам 1а и lb изолята Бизон.
В следующих исследованиях провели генотипирование трех нецитопа-тогенных изолятов вируса ВД-БС КРС (Бизон, Бор и Благодатский). Данная работа выполнена совместно с м.н.с. А.Г. Южаковым во Всероссийском НИИ Экспериментальной Ветеринарии им. Я.Р. Коваленко Россельхозакадемии при помощи лабораторных тест-систем на основе ОТ-ПЦР. Таблица 12 - Генотипирование изолятов вируса ВД-БС КРС, выделенных от животных при вспышках респираторных болезней и гинекологической патологии коров методом ОТ-ПЦР
Секвенирование и компьютерный анализ последовательности участка 5 -нетранслируемой области показало, что согласно классификации Vil-cek S. et al., предполагающей наличие у вируса первого генотипа 11 субгенотипов, наши изоляты относятся: Бизон - к генотипу 1, субгенотипу Id, Бор - к генотипу 1, субгенотипу lb, а изолят Благодатский - ко второму генотипу вируса. Анализ участков генов Npro и Е2 подтвердил полученные данные.
Был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 5 UTR (5 - нетранслируемой области), генов Npro и Е2 вируса ВД-БС КРС между собой и с последовательностями, опубликованными в EMBL. Полученные данные представлены на рис. 4-5 в виде дендрограмм.
Большая часть исследованных нами изолятов ВД-БС КРС сходна с представителями группы lb, к которым относятся референтные штаммы Osloss, Н, ILLC, СР-7. Процент идентичности изолята Бор, представителя субгенотипа lb, с референтным штаммом Osloss составляет 93,9%; ILLC -94,3%; СР-7 -93,0%.
Количество полученных изолятов вируса ВД-БС КРС субгенотипа 1а незначительно уступает имеющемуся количеству изолятов субгенотипа lb. Все они сходны с референтными штаммами NADL, CD-I, Oregon C24V.KS86-1.
Полученный нами изолят Бизон относится к субгенотипу Id. Данная группа включает референтные штаммы F, 16-11 1, SH9. Изолят Бизон имеет 97,5% сходства с последовательностью 5 UTR штамма F и 97,1% с последовательностью 5 UTR штамма 16-11 1.
Изолят Благодатский был отнесен ко второму генотипу вируса ВД-БС КРС. В данную группу входят референтные штаммы 890 и Newy ORK 93. Процент идентичности изолята Благодатский со штаммом Newy ORK 93 составил 90,2%, со штаммом 890 - 96,3%. Следовательно, уровень отличий изолята Благодатский от референтных штаммов второго генотипа составил 3,7—9,8 %.
Результаты сравнительного анализа показали, что большинство выделенных нами изолятов вируса ВД-БС КРС относятся к первому генотипу и имеют примерно от 4,0 - 7,0% отличий от референтных штаммов. Уро вень отличий штаммов и изолята второго генотипа вируса ВД-БС КРС 3,7-9,8%. Уровень отличий между генотипами составил примерно 21,0-27,0%.
За время исследований в основном мы получали изоляты вируса ВД-БС КРС субгенотипов 1а и lb первого генотипа с одинаковой частотой. Полученные данные свидетельствуют о том, что на территории Сибири преобладает циркуляция этих двух генетических групп. Остальные представители встречались реже. Впервые на территории России был изолирован вирус ВД-БС КРС второго генотипа в перевиваемой культуре клеток. Филогенетические дендрограммы исследованных изолятов и референтных штаммов из базы данных GenBank приведены на рисунках 4 и 5.
Все полученные нами изоляты вируса субгенотипов 1а и lb сходны с референтными штаммамиNADL, CD-I, Oregon, C24V, KS, 86-1.
Изолят Бизон субгенотипа Id принадлежит к группе, включающей референтные штаммы F, 16-11, SH9. Наибольшее сходство он имеет с последовательностью 5 -й не транслируемой области штамма F.
Изолят Благодатский был отнесен к группе референтных штаммов 890 и Newy ORK 93. Процент идентичности его со штаммом 890 составил 96,3%. Уровень отличий штаммов и изолята второго генотипа вируса ВД-БС КРС от 3,7 до 9,8%). Уровень отличий между штаммами и изолятами двух генотипов примерно от 21 до 27% (табл.13).
Изолят Бизон был выделен нами из легких теленка с признаками острого респираторного заболевания из хозяйства, куда не вводились новые животные, включая поступающих по импорту. Изолят Бор был выделен от персистентно инфицированной нетели, поступившей по импорту, у которой не регистрировали клинических признаков болезни. У этих двух изолятов установлена принадлежность к первому генотипу вируса ВД-БС КРС.
Похожие диссертации на Особенности распространения вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, молекулярно-биологические свойства изолятов вируса
