Содержание к диссертации
Стр.
Список используемых сокращений _ . __ 3
ВВЕДЕНИЕ" '_"!" "_"_"_" " "_"_'_ I ~_~~~ " 4
ГЛАВА 1.ОБЗОР "ЛИТЕРАТУРЫ " " " "_ZI"". "И1"Т_"_ п
1. Вирус гриппа А ...12
1Л Общее_строение вириона _ 12
1.2 Геном вируса гриппа А и вирусные белки 13
2. Экология вируса гриппа А. Естественный резервуар в природе 16
2.1 Дикие птицы как природный резервуар LPAI-вирусов 16
Вирус гриппа у уток __ „ _ .19
Вирус гриппа у чаек _ 22
2.1.3 Вирус гриппа у других птиц 27
2.L4 _ Генетическоеразнообразие вируса гриппа у диких птиц 28
3. Высокопатогенные варианты вируса гриппа A (HPAI) 31
Азиатский вариант вируса гриппа H5N1 -субтипа 34
Механизмы распространения HPAI 38
4. Заключение по обзору литературы 43
ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 46
2.1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 46
" 2.2""" РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ" ".__"_ .61
2.2.1 Анализ эпизоотической ситуации по гриппу птиц H5N1-субтипа в
России (2005-2009 гг.). Результаты вирусологического
исследования биоматериала от диких, домашних и синантропных
птиц _ _ _ _ _ _ 61
2.2.2 Биологические свойства штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа,
выделенных от диких и домашних птиц в России (2005-2009 гг.) 74
Культивирование в системе развивающихся куриных эмбрионов 74
Патогенность для кур 77
Патогенность для белых мышей 80
Молекулярно-биологический и филогенетический анализ генов
НА и NA штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных в
России от диких и домашних птиц (2005-2009 гг.) 84
Создание коллекции штаммов вируса гриппа H5N1 -субтипа _ __ 91
Изучение штамма A/common gull/Chany/P/2006 с позиции возможности создания на его основе диагностических препаратов 94
2.2.4.1 Молекулярно-биологический и филогенетический анализ штамма
A/common gull/Chany#V2006. 94
2.2.4.2 Изучение антигенных и репродуктивных свойств штамма
A/common gull/Chany/2006, и возможности создания на его
основе диагностических препаратов 97
ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 103
ВЫВОДЫ ""'" " """ 120
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 121
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ' " " 122
ПРИЛОЖЕНИЕ 141
Список использованных сокращений
ВГА - вирус гриппа А
РНК - рибонуклеиновая кислота
ДНК- дезоксирибонуклеиновая кислота
РВ1 - полимеразный белок 1
РВ2 - полимеразный белок 2
РА - полимеразный белок
НА - гемагглютинин
NA - нейраминидаза
NP - нуклеопротеин
М - матричный белок
NS - неструктурный белок
LPAI-вирусы (low pathogenic avian influenza) - низкопатогенный вирус
гриппа А
HPAI-вирусы (highly pathogenic avian influenza) - высокопатогенный вирус
гриппа А
EID5o - 50% эмбриональная инфицирующая доза
LD50 - 50% летальная доза
ОТ - обратная транскрипция
ПЦР - полимеразная цепная реакция
РГА - реакция гемагглютинации
РТГА - реакция торможения гемагглютинации
РКЭ - развивающиеся куриные эмбрионы
ФСБ - фосфатно-солевой буфер
ГАЕ - гемагглютинирующая единица
УФ - ультрафиолетовое излучение
IVPI (Intra venous pathogenity index) - индекс патогенности при внутривенном
введении
Введение к работе
Грипп - заболевание, привлекающее огромный интерес большого числа специалистов не только в области современной медицины и вирусологии, но и достаточно широкого круга сфер деятельности человека (экономики, здравоохранения, сельского хозяйства, охраны окружающей среды и т.д.). Эта инфекция, известная уже около 400 лет, вызывается вирусом, обладающим достаточно высоким потенциалом антигенной изменчивости. В последние годы стало очевидным, что степень вариабельности вируса гриппа типа А так велика, что он с легкостью преодолевает иммунный барьер против ранее циркулировавших штаммов. За последние годы были получены важные результаты в области понимания структуры, репликации и иммунологии вируса гриппа А (ВГА) с помощью постоянно совершенствующихся методов, а также внедрения новых подходов. Результатом явился значительный прогресс в улучшении эпидемиологического и эпизоотического надзора, разработка новых средств профилактики и методов защиты от инфекции.
Длительное существование вируса гриппа А в ареале обитания его естественных хозяев (в основном, птиц) привело к устойчивости системы вирус-хозяин в биосфере (Д.К.Львов с соавт., 2004; R.G.Webster et al., 1992). Между тем, в процессе эволюции периодически возникают новые высокопатогенные для человека и животных варианты. Это, в свою очередь, ставит мировое сообщество перед угрозой новой пандемии, приносит серьезный экономический урон в сельском хозяйстве, создает проблемы в области охраны биологических ресурсов планеты. Подтверждением этому служат документированные случаи инфицирования человека и домашних животных высокопатогенными вирусами гриппа H9N2, H7N7, H5N1-субтипов (Т. Horimoto, Y. Kawaoka, 2005).
Среди данных субтипов H5N1 считается наиболее вероятным прародителем новой пандемии гриппа из-за высокой летальности,
вирулентности и широкого круга чувствительных видов хозяев. Действительно, на протяжении продолжительного периода изучения ВГА считалось, что отдельные штаммы и субтипы вируса существуют обособленно в популяциях диких животных и людей. При этом преодоление межвидового барьера является процессом маловероятным и требует длительного времени для эволюционного изменения вируса. Между тем, впервые зарегистрированный у птиц в 1996 г. в Юго-Восточной Азии вариант H5N1 к настоящему времени распространился на обширную территорию, вызвав беспрецедентную панзоотию среди домашних и диких птиц, а также гибель людей. Помимо многомиллионного ущерба, причиненного широким распространением вируса гриппа птиц H5N1 в мировом сельском хозяйстве, на 30 декабря 2009 г. было документировано 467 случаев инфицирования людей, из которых 282 окончились летальным исходом (WHO, 2009). В связи с этим, были пересмотрены некоторые из общепринятых положений, касающихся инфекционного потенциала ВГА. Так, в настоящее время процесс преодоления межвидового барьера (например, от птиц к человеку) считается спорадическим и, вероятно, происходившим при пандемиях гриппа в прошлом (в частности, испанского гриппа 1918 г.) (D.M.Morens et al., 2009).
Кроме того, идентификация в текущем году среди людей пандемичного вируса гриппа А, филогенетически происходящего от вариантов вируса гриппа свиней и птиц, существенно повышает угрозу пандемии гриппа (N.Ding et al., 2009; A.Flahault et al., 2009). По данным WHO, к настоящему моменту (20 декабря 2009) этот вирус был диагностирован в 208 странах мира и вызвал гибель 11516 человек (WHO, 2009).
Помимо угрозы пандемии, эпизоотии гриппа H5N1-субтипа среди восприимчивых видов хозяев существенно нарушают равновесное состояние экосистем и биоресурсов. Так, по оценкам специалистов, в ходе эпизоотии
H5N1 в 2005 г. в Китае погибло до 10% мировой популяции горного гуся {Anser indicus) (H.Chen et al., 2005).
В 2005 г. в Китае началась масштабная волна эпизоотии H5N1 среди диких и домашних птиц. Летом 2005 года этот вирус был зарегистрирован впервые в России, на территории Новосибирской области, где он вызвал гибель домашних птиц. В кратчайшие сроки вирус гриппа А распространился по всей территории Западной Сибири, а впоследствии - на центральные и южные регионы России. В результате распространения вируса погибли и были забиты десятки миллионов голов домашней птицы (D.J.Alexander, I.H.Brown, 2009). Начиная с этого времени, на протяжении 4 лет на территории России регулярно отмечаются вспышки гриппа среди диких и домашних птиц. Между тем, до сих пор остается открытым вопрос о путях распространения вируса H5N1 и, главным образом, роль диких птиц в этом процессе. В связи с этим, актуальным остается анализ эпизоотологической ситуации в России и мире, создание коллекции вирусов этого субтипа, выделенных в России от диких и домашних птиц, а также получение данных об их биологических свойствах с целью изучения механизмов и путей распространения вируса гриппа H5N1. Полученные в ходе работы данные можно использовать для прогнозирования эпизоотической ситуации, принятия адекватных мер по предотвращению вспышек и устранению их возможных последствий. При этом особое внимание следует уделять вирусам H5N1, выделенным от диких птиц в их природных биоценозах. Результаты проведенного в данной работе изучения биологических свойств вновь выделенных штаммов субтипа H5N1 могут быть использованы при разработке диагностических тест-систем, вакцин и лекарственных препаратов. Данная работа посвящена изучению перечисленных аспектов биологии вируса гриппа А.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось изучение биологических свойств штаммов вируса гриппа H5N1 -субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
Осуществить анализ эпизоотической ситуации гриппа птиц H5N1-субтипа в различных регионах России за 2005-2009 гг.
Провести вирусологические исследования биоматериала от диких и домашних птиц из различных территорий России; изучить репродуктивные свойства в системе РКЭ и патогенность выделенных штаммов вируса гриппа Н5Ш-субтипа для кур и белых мышей.
Провести молекулярно-генетический и филогенетический анализ генов НА и NA штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных в России от диких и домашних птиц в 2005-2009 гг., в сравнении с ранее изученными вариантами.
Изучить возможность использования выделенных штаммов вируса гриппа Н5Ш-субтипа в качестве основы для получения диагностического препарата.
Научная новизна
Получены современные данные, свидетельствующие о различном патогенном потенциале и генетической гетерогенности штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, выделенных от диких и домашних птиц в различных регионах России.
Не установлено существенной роли синантропных птиц в развитии эпизоотии гриппа H5N1-субтипа на юге Западной Сибири.
Впервые в мире доказано носительство вируса гриппа H5N1 -субтипа у - сизой чайки {Larus canus) и колпицы (Platalea leucorodid).
Получены данные об уникальных биологических свойствах ряда впервые выделенных штаммов вируса гриппа H5N1-субтипа, которые
целесообразно использовать в создании диагностических и вакцинных препаратов (патент №2366709 «Штамм вируса гриппа птиц A/Goose/Krasnoozerskoye/627/05 H5N1 субтипа для изучения биологии вируса гриппа, лечебной и профилактической эффективности противовирусных препаратов»; заявка на патент «Штамм вируса гриппа птиц A/common gull/Chany/P/2006 H5N1 субтипа для приготовления антигенсодержащего диагностического или вакцинного препарата» с приоритетом изобретения №2009100655 от 11.01.2009).
Теоретическая и практическая значимость
Получены современные данные о различных биологических свойствах вируса гриппа Н5Ш-субтипа вызвавшего эпизоотии в России в 2005-2009 гг., которые могут быть использованы как научная основа при эпизоотическом прогнозировании и принятии адекватных мер по предотвращению вспышек и устранению их возможных последствий.
Ряд штаммов из созданной коллекции обладает перспективой использования при разработке диагностических тест-систем, вакцин, проверки лекарственных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
Биологические свойства 16 штаммов вируса гриппа H5N1 -субтипа, выделенных на территории России в 2005-2009 гг.
Принадлежность вируса гриппа Н5Ш-субтипа, вызвавшего эпизоотии среди диких и домашних птиц в России (2005-2009 гг.), к различным генетическим линиям.
Данные об уникальных биологических свойствах ряда штаммов и возможность создания на их основе диагностических препаратов.
Апробация работы Материалы исследований были представлены на следующих конференциях: Международной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», (Москва, 2006),
Третьей международной орнитологической конференции «Современные проблемы орнитологии Сибири и Центральной Азии», (Улан-Удэ, 2006), Шестой международной конференции «Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases», (Бангкок, 2006), Международном совещании «Emerging Diseases: Tick-transmitted and influenza», (Новосибирск, 2007), Шестой международной конференции «Options for the Control of Influenza», (Торонто, 2007), Третьей международной конференции по мигрирующим птицам Севера тихоокеанского региона, (Якутск, 2007), Третьей международной конференции «Basic Science for Medicine», (Новосибирск, 2007), Международной конференции «Avian Influenza 2008: Integration from Knowledge to Control», (Бангкок, 2008), Десятом международном симпозиуме «Respiratory Viral Infections», (Сингапур, 2008), Первой международной конференции «Bird Flu 2008: Avian Influenza and Human Health», (Оксфорд, 2008), Третьей европейской конференции по гриппу, (Виламура, 2008), Международной' научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа», (Новосибирск, 2008), Восьмом азиатско-тихоокеанском конгрессе «Medical Virology», (Гонконг, 2009).
По теме диссертации опубликовано 24 работы (в том числе в трудах международных конференций), 6 из них в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.
Работа была выполнена в-^2005-2009 гг. в отделе зоонозных инфекций и
гриппа Федерального государственного учреждения науки
«Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора.
Внедрение результатов исследований.
Созданная коллекция из 16 штаммов вируса гриппа H5N1 -субтипа, выделенных в России в 2005-2009 гг. принята на патентное депонирование в
Коллекцию микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.
По результатам работы 44 нуклеотидные последовательности полных генов зарегистрированы в международной базе данных GenBank и могут в дальнейшем служить базой для конструирования праймеров и филогенетических исследований вируса гриппа А.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы и список литературы, приложения. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 12 рисунками. Список литературы включает 178 источника, в том числе 153 работы зарубежных авторов.
Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю кандидарту биологических наук Шестопалову Александру Михайловичу за неоценимую помощь в организации работы, обсуждении и апробации полученных результатов. Искреннюю благодарность автор выражает всем сотрудникам отдела зоонозных инфекций и гриппа ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора за помощь в проведении работы. Отдельно автор хотел бы поблагодарить сотрудников ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора с.н.с. Дурыманова Александра Гавриловича, кандидата биологических наук, в.н.с Ильичеву Татьяну Николаевну, кандидата биологических наук, в.н.с. Мазуркову Наталью Алексеевну и м.н.с. Ужаченко Романа Владимировича за ценные советы и указания, высказанные при выполнении и обсуждении данной работы.
Автор выражает благодарность доктору ветеринарных наук, профессору Димову Сергею Константиновичу и кандидату ветеринарных наук Юшкову Юрию Георгиевичу за огромную помошь в подготовке и оформлении материалов диссертации.
