Введение к работе
Актуальность темы. Заболевание животных и человека, называемое гриппом, вызывают представители семейства ортомиксовирусов: вирусы гриппа родов А, В и С. Из них только вирус гриппа А (ВГА) имеет широкий круг хозяев, включающий различные виды млекопитающих и птиц (R.G. Webster et al., 1992). Дикие птицы отрядов гусеобразные и ржанкообразные являются основным природным резервуаром ВГA, в организме которых инфекция часто протекает бессимптомно. К настоящему моменту инфекция зарегистрирована у 105 видов диких птиц 26 отрядов (B. Olsen et al., 2006). Вирусы гриппа А также были выделены у свиней, лошадей, собак, различных видов грызунов, некоторых видов морских млекопитающих, кошек, норок, а также людей (R.G. Webster et al., 1992).
Сезонные миграции диких птиц способствуют распространению различных вариантов ВГА в отдаленные географические регионы и обеспечивают их долговременное присутствие во многих экосистемах, что определяет важность и необходимость эпизоотологического мониторинга вируса гриппа птиц в естественных условиях. Во время сезонных миграций различные экологические группы диких птиц перемещаются различными путями, придерживаясь благоприятных для их обитания мест.
На путях миграций и в местах зимовок осуществляются контакты между популяциями птиц, изолированными друг от друга в период гнездования. Это создает предпосылки для последующего географического распространения различных вариантов вируса ВГА как внутри одного вида, так и между видами (Д.К. Львов и В.Д. Ильичев, 1979). ВГА циркулирует повсеместно среди водно-болотных птиц, однако мониторинг этого вируса не может быть проведен на всей территории. В связи с этим наиболее актуально осуществление такого мониторинга в районах массовых скоплений водно-болотных птиц различных популяций.
Всё это определяет особую сложность ситуации, поскольку наши представления как о разнообразии ВГА, так и характерных для него эпизоотологических и экологических особенностях, до сих пор крайне поверхностны.
Поскольку все известные высокопатогенные для птиц штаммы ВГА относятся к одному из трех субтипов гемагглютинина: Н5, Н7 или к Н9, особое внимание при проведении мониторинга вируса гриппа в популяциях птиц необходимо уделять выявлению и изучению именно таких вариантов.
Другим важным аспектом изучения ВГА является выяснение филогенетических связей штаммов, выделенных от птиц разных регионов, что позволит изучить пути географического распространения вируса в природном резервуаре и разработать превентивные противоэпизоотические мероприятия.
Начиная с 1997 г. на территории стран Юго-Восточной Азии формируется эндемичный очаг вируса гриппа А Н5N1 субтипа. На территории данных стран вирус был обнаружен не только среди диких птиц, но и вызвал крупнейшие эпизоотии у домашней птицы. Высокопатогенные варианты вируса H5N1 также были обнаружены у некоторых видов млекопитающих, в том числе и у человека. На 13 февраля 2013 г. по данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) всего в мире зарегистрировано 620 случаев заболевания человека вируса гриппа А Н5N1 субтипа, из которых 367 закончилось летальным исходом (WHO, 2013).
Таким образом, варианты вируса гриппа А, циркулирующие среди диких птиц, являются как причиной эпизоотий среди сельскохозяйственных птиц, приводящим к огромным экономическим потерям, так и источником опасности для здоровья человека. Поскольку основным резервуаром таких вариантов являются птицы естественных экосистем, для контроля над инфекцией необходимо выявить закономерности циркуляции вируса гриппа А в популяциях диких птиц и его распределения в разных таксономических и экологических группах последних.
На севере России располагаются главные места гнездования многих мигрирующих птиц отрядов гусеобразные. Особую важность представляет территория Западно-Сибирской равнины (M. Gilbert et al., 2006). Территориальные связи западно-сибирских птиц, формирующиеся в процессе сезонных миграций, весьма обширны. Территорию юга Западной Сибири пересекают центрально-азиатский, западноазиатский-восточноафриканский и восточноазиатский-австралийский перелетные пути, объединяя популяции птиц, зимующих в различных регионах мира – Европе, Африке, на Ближнем Востоке и в Средней Азии, Индостане и Юго-Восточной Азии, Австралии, Океании, полуострове Аляска (К.Т. Юрлов, 1981). Экологические особенности данного региона – наличие большого количества пресных и слабосоленых водоемов, а также резко континентальный климат – создают благоприятные условия для длительного сохранения вируса в воде и почве. В связи с этим на территории юга Западной Сибири существуют благоприятные условия для распространения различных вариантов патогена, его персистенции и эволюции (; ).
Таким образом, все вышеизложенное указывает на важность изучения экологии вируса гриппа А на территории юга Западной Сибири, исследование его генетического разнообразия, а также изучение биологических свойств и филогенетических связей выделенных штаммов вируса. Результаты, полученные в ходе данной работы, помогут не только улучшить знания о генетике и эволюции вируса, но также исследовать пути распространения вируса и прогнозировать развитие эпизоотической ситуации в случае ее возникновения.
Цели и задачи исследования. Цель данной работы – выявление биологического разнообразия и экологических особенностей вирусов гриппа А, циркулирующих у диких птиц юга Западной Сибири.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Оценить биологическое разнообразие вариантов вируса гриппа А в популяциях диких птиц юга Западной Сибири.
-
Выявить закономерности распределения вирусов гриппа А в различных таксономических группах птиц.
-
Разработать последовательности синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения нуклеотидных последовательностей генов PB2, PB1, PA, NP, MP, NS вирусов гриппа А евразийской генетической линии.
-
Изучить основные биологические свойства выявленных редких и уникальных вариантов вируса гриппа А.
-
Провести анализ первичных структур генов вирусов гриппа А и установить филогенетические связи штаммов вируса гриппа А, выделенных на юге Западной Сибири.
Научная новизна. В ходе данной работы получены современные данные о циркуляции вирусов гриппа А среди диких птиц на территории юга Западной Сибири в период с 2008 по 2011 гг. Представлены результаты мониторинга вируса гриппа А на территории Новосибирской и Омской областей, а также Алтайского края. Всего было выделено и изучено 105 штаммов вируса гриппа А, относящихся к 21 субтипу.
Впервые в мире выделены вирусы гриппа А с субтипами H8N8 и H15N4 (штаммы A/teal/Chany/444/2009 и A/teal/Chany/7119/2008 соответственно). Изучены основные биологические свойства данных штаммов и показана возможность использования штамма A/teal/Chany/7119/2008 H15N4 субтипа для создания диагностикума (патент № 2478705 «Штамм вируса гриппа A/teal/Chany/7119/08/ H15N4-субтипа для получения антигенсодержащего препарата и поликлональной сыворотки для диагностических целей»).
Также выделены такие варианты вируса гриппа, как низкопатогенные Н5N1 и H16N3, данные о которых в исследуемом регионе отсутствовали.
Показана возможность использования штамма A/common gull/Altai/804/2011 H16N3 субтипа для создания диагностикума (заявка на патент: регистрационный номер 2012123090 от 04.06.2012).
Проведен молекулярно-биологический и филогенетический анализ матриксного гена (MP) выделенных штаммов вируса гриппа.
Теоретическая и практическая значимость. Разработаны последовательности синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения первичных структур генов (PB2, PB1, PA, NP, MP, NS) вирусов гриппа А с учетом особенностей вирусов евразийской генетической линии (заявка на патент 2012143573 от 11.10.2012).
Штаммы вирусов гриппа, полученные в ходе данной работы, могут быть использованы в диагностических целях в качестве антигенов и полученных на основе данных антигенов поликлональных сывороток.
Полученные данные о биологическом разнообразии выделенных штаммов вируса гриппа от диких птиц могут быть использованы в изучении экологии патогена, эволюции, а также путей распространения вируса.
Внедрение полученных результатов. Получена коллекция из 105 штаммов вируса гриппа различных субтипов, выделенных на юге Западной Сибири. Восемь штаммов приняты на патентное депонирование в коллекцию культур микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».
В международной базе данных GenBank задепонированы 132 первичных структуры генов вирусов гриппа.
Разработаны методические рекомендации «Комплексный эпизоотологический мониторинг вируса гриппа А на территории Сибири и Дальнего Востока», утвержденные подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 21 сентября 2011 г.) в целях использования в образовательном процессе в специализированных ВУЗах, а также в дальнейших научных исследованиях и в практической противоэпизоотической работе.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: XLVII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (г. Новосибирск, 2009 г.), Школе-конференции молодых ученых «Секвенирование полных геномов» (г. Иркутск, 2009 г.), 14th International Congress on Infection Diseases (г. Майами, 2010 г.), XLVIII Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (г. Новосибирск, 2010 г.), X International Conference of Molecular Epidemiology and Evolution Genetics of Infectious Diseases (г. Амстердам, 2011 г.), XIV International Symposium on Respiratory Viral Infections (г. Стамбул, 2012 г.), “Influenza 2012: One Influenza, One world” (г. Оксфорд, 2012 г.).
Публикации результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 3 статьи – в российских журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Вестник Новосибирского государственного университета», «Бюллетень Восточно-Сибирского Научного Центра СО РАМН», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки»), 1 патент РФ и 2 статьи – в зарубежных научных изданиях («Avian Diseases», «Journal of Virology»).
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов собственных исследований, выводы, практические приложения, список литературы и приложение.
Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 22 рисунками. Список литературы включает 179 источников, в том числе 163 работ зарубежных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Биологическое разнообразие вирусов гриппа А циркулирующих у диких птиц юга Западной Сибири.
-
Разработанные последовательности синтетических олигонуклеотидов-праймеров для получения нуклеотидных последовательностей генов PB2, PB1, PA, NP, MP, NS вирусов гриппа А евразийской генетической линии.
-
Основные молекулярно-биологических свойства редких и уникальных вариантов вирусов гриппа А субтипов Н8N8, H15N4, H5N1 и H16N3.
-
Филогенетический анализа матриксного гена выделенных штаммов вируса гриппа А.
Похожие диссертации на Современные особенности экологии и биологические свойства различных субтипов вируса гриппа A, циркулирующих в популяциях диких птиц юга Западной Сибири
