Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 14
2.1. Краткая характеристика ЧМЖЖ 14
2.2. Эпизоотология ЧМЖЖ 15
2.2.1. Распространение ЧМЖЖ 15
2.2.2. Факторы распространения ЧМЖЖ 18
2.3. Биологические свойства вируса ЧМЖЖ 20
2.4. Физико-химические свойства вируса ЧМЖЖ 23
2.5. Антигенные свойства вируса ЧМЖЖ 25
2.6. Диагностика ЧМЖЖ 26
2.7. Молекулярно-генетические методы диагностики 29
2.7.1. Полимеразная цепная реакция 29
2.7.2. Применение ПЦР для диагностики ЧМЖЖ 33
2.8 .Выводы по обзору литературы 34
Собственные исследования 36
3. Материалы и методы 36
3.1. Материалы 36
3.1.1. Вирусы и вируссодержащие материалы 36
3.1.2. Реактивы, растворы и оборудование 36
3 3.2. Культивирование и титрование вируса ЧМЖЖ 39
3.3. Очистка и концентрирование вируса ЧМЖЖ 40
3.4. Оценка эффективности методов очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ 41
3.5. Электрофоретический анализ белков ЧМЖЖ 42
3.6. Электрофоретический анализ вирусного белка в ПААГе 42
3.7. Выделение нуклеиновых кислот из очищенных препаратов вирусов, культуральных и органо-тканевых вируссодержащих материалов 42
3.7.1. Выделение РНК из очищенных и концентрированных препаратов вируса ЧМЖЖ 43
3.8. Сбор данных нуклеотидных последовательностей вируса 44
3.9. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей 44
3.10. Конструирование праймеров 44
3.11. Синтез и очистка олигонуклеотидов 44
3.11.1 Синтез кДНК на РНК вируса 45
3.12. Оптимизация параметров постановки ПЦР при идентификации 45
3.12.1. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот 46
3.12.2. Определение чувствительности и специфичности ПНР 46
3.12.3. Определение диагностической ценности ПЦР 47
3.13. Постановка и учет результатов серологических реакций 47
3.13.1. Подготовка проб патологического материала 47
3.13.2. Постановка РДП 47
3.13.3. Постановка ИФА 48
3.14. Статистическая обработка данных 49
4. Результаты исследований 50
4.1. Очистка и концентрирование вируса ЧМЖЖ 50
4.1.1. Подбор оптимальных условий культивирования вируса ЧМЖЖ 50
4.1.2. Получение очищенных и концентрированных препаратов вируса ЧМЖЖ из вируссодержащих материалов 51
4.1.3. Электронномикроскопическое изучение морфологии и структуры вируса ЧМЖЖ 53
4.2. Подбор оптимальных методов выделения РНК вируса 55
4.3. Определение физико-химических свойств РНК вируса ЧМЖЖ 57
4.3.1. Определение константы седиментации РНК вируса ЧМЖЖ 57
4.3.2. Определение плавучей плотности РНК вируса ЧМЖЖ 57
4.4. Поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генома вируса чумы МЖЖ в международных базах данных 58
4.5. Разработка метода ПЦР для идентификации вируса ЧМЖЖ 62
4.5.1. Подбор праймеров 62
4.5.2. Подбор и отработка температурно-временного режима 65
4.5.3. Подбор оптимальных условий проведение ПЦР 70
4.5.4. Определение специфичности и чувствительности ПЦР при идентификации ЧМЖЖ 76
4.5.5. Тест-система для диагностики ЧМЖЖ на основе ПЦР 79
4.6. Комиссионная апробация тест-системы для диагностики ЧМЖЖ на основе ПЦР 82
4.7. Эпизоото логический мониторинг и использование метода ПЦР для выявления кДНК вируса ЧМЖЖ в полевых материалах 86
5. Обсуждение 100
6. Выводы 106
7. Практические предложения 107
8. Список литературы 108
9. Приложение 125
- Полимеразная цепная реакция
- Поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генома вируса чумы МЖЖ в международных базах данных
- Подбор оптимальных условий проведение ПЦР
- Эпизоото логический мониторинг и использование метода ПЦР для выявления кДНК вируса ЧМЖЖ в полевых материалах
Введение к работе
Актуальность проблемы. Чума мелких жвачных животных – чрезвычайно инфекционное заболевание домашних и диких жвачных животных. Впервые оно было зарегистрировано в Западной Африке (Кот-д’Ивуаре) в 1942 году.
В последние годы болезнь была зарегистрирована на Ближнем Востоке и Аравийском Полуострове, в таких странах, как Исламская Республика Иран, Ирак, Израиль, Иордания, Кувейт, Ливан, Оман, Саудовская Аравия, Объединенные Арабские Эмираты и Йемен, а также есть серологические подтверждения в Сирийской арабской Республике и Турции. Известны вспышки чумы МЖЖ в Индии, Непале, Бангладеш, Пакистане и Афганистане. Распространение ЧМЖЖ на территориях в странах бывшего Советского Союза среди животных изучено недостаточно.
Для диагностики и идентификации вируса ЧМЖЖ на сегодняшний день в мире разработаны и применяются различные серологические и иммунологические методы. Все они имеют различную диагностическую ценность – одни требуют значительных затрат по времени, другие имеют низкую чувствительность и специфичность (133, 134, 135, 136). Поэтому усовершенствование и разработка более чувствительных и специфичных, а также экспрессных методов диагностики остается актуальной проблемой.
Метод ПЦР имеет ряд преимуществ – прямое определение ДНК возбудителя, высокая специфичность, высокая чувствительность, универсальность процедуры, простота и удобство проведения анализа, сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа. В зарубежных странах метод ПЦР успешно применяют для диагностики ЧМЖЖ. (56,57, 133, 134). Разработка эффективных, быстрых и надежных методов диагностики ЧМЖЖ является весьма актуальной проблемой для Таджикистана.
Цель и задачи исследования. Целью работы являлась разработка тест-системы (набора) для диагностики ЧМЖЖ, c использованием компьютерно-моделированных и синтезированных специфических праймеров.
Для достижения указанной цели поставлены следующие задачи:
1. Отработать оптимальные методы очистки и концентрирования вируса ЧМЖЖ из вируссодержащих материалов с целью получения вирусной РНК;
2. Отработать оптимальные методы выделения РНК из очищенного вируса ЧМЖЖ;
3. Сконструировать, отобрать и синтезировать оптимальные специфические праймеры для амплификации участка геномной кДНК вируса ЧМЖЖ;
4. Отработать оптимальные условия проведения ПЦР (временный и температурный режим реакции, концентрация основных компонентов в реакционной смеси) при выявлении кДНК вируса ЧМЖЖ;
5. Изучить специфичность и чувствительность ПЦР системы при выявлении кДНК вируса ЧМЖЖ.
Научная новизна работы. Впервые сконструированы и синтезированы оригинальные праймеры для амплификации фрагмента гена РНК-полимеразы вируса ЧМЖЖ, имеющие нуклеотидный состав:
- PCR_PPRV_f3;
- PCR_PPRV_r3.
Данные праймеры ограничивали участок кДНК вируса ЧМЖЖ размером 274 п.о.
Установлено, что использование подобранных праймеров, позволяет сократить общее время проведения анализа. Показано, что для отжига данных специфических праймеров и наработки ПЦР-продукта размером 274 п.о. достаточно по 60 с.
Разработан и апробирован вариант ПЦР тест-системы для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ.
Практическая значимость работы. Разработана ПЦР тест-система для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ, которая является высокочувствительной, простой в исполнении, позволяет поставить диагноз в короткие сроки, включая ранние стадии инфекции.
По результатам исследований разработана и составлена нормативно-техническая документация, включающая:
- Тест-система [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции, СТ 405-1919-04 ГП-050–2012 (28 февраля 2012г.);
- Временная инструкция по изготовлению и контролю тест-системы [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (28 февраля 2012г.);
- Временное наставление по применению тест-системы [набор] для диагностики чумы мелких жвачных животных методом полимеразной цепной реакции (28 февраля 2012г.);
- Тавсияхо оид ба гузаронидани тадбирхои зиддиэпизооти ва пешгирикунанда хангоми тоуни чорвои хурди шохдор (Рекомендации по проведению противоэпизоотических мероприятий при чуме мелких жвачных животных (15 марта 2011г.))..
Таким образом, полученные в диссертационной работе результаты позволяют упростить диагностику ЧМЖЖ и повысить её эффективность, что может сократить экономические потери в животноводстве от данного заболевания.
Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на: заседаниях Ученого Совета Научно-производственное предприятие «Биологические препараты» (Среднеазиатского ящурного института) Таджикская Академия сельскохозяйственных наук - 2003-2011гг. Основные положения диссертационной работы изложены и обсуждены на научно – теоретических конференциях в гг. Бишкеке Республики Кыргызстан, в Казани и Москве Российской Федерации.
Основные положения, выносимые на защиту:
- сконструированные, отобранные и синтезированные специфические праймеры могут быть использованы для амплификации участка геномной кДНК вируса ЧМЖЖ размером 274 п.о.;
- предлагаемый температурно-временной режим, обеспечивающий отжиг праймеров и синтез ПЦР-продукта, позволяет уменьшить время постановки диагноза на ЧМЖЖ;
- создан ПЦР тест-системы для детекции кДНК вируса ЧМЖЖ, позволяющий упростить и сократить время постановки диагноза, значительно повысить эффективность обнаружения вируса, в том числе на ранних сроках инфекции.
Личный вклад соискателя. Экспериментальные данные получены автором самостоятельно. Теоретическое обоснование, проведение экспериментов, анализ и обработка полученных данных проведена при личном участии автора и сотрудников РГП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан. Результаты работы опубликованы и апробированы в производственных условиях.
Автор выражает искреннюю благодарность и признательность за неоценимую помощь, оказанную при выполнении данной работы, критическую оценку и ценные советы при оформлении диссертации сотрудникам РГП Научно- исследовательского института проблем биологической безопасности Республики Казахстан, Ж.К. Кошеметову, С. Нурабаеву, НПП «Биологические препараты» ТАСХН Т.К. Висковой, М.И. Косумбекову.
Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, из них три статьи в изданиях, по перечню ВАК Российской Федерации, в которых изложены основные положения и выводы по изучаемым вопросам.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 странице компьютерного текста (Word) и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы. Список используемой литературы включает 138 источников, из которых 114 иностранных. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками, 9 таблицами. Приложение на 3 страницах.
Полимеразная цепная реакция
В настоящее время, как для диагностики, так и для дифференциации различных групп вирусов и других микроорганизмов широко используется метод ПЦР или специфической амплификации ДНК. ПЦР поднимает лабораторную диагностику на иной уровень определения ДНК или РНК, что позволяет прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации. Внедрение метода в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий в медицине и ветеринарии за последнее время. По данным журнала Labmedica International с 1995 г. наблюдается увеличение расходов на ПЦР-диагностику, что является показателем роста ее использования. В 1996 г. на ДНК-диагностику было потрачено 181.6 млн. долларов, а в 2003 г. затраты возросли до 1400 млн. долларов.
ПЦР состоит из трех основных процедур: подготовки исследуемой пробы, которая в большинстве случаев сводится к изоляции ДНК или РНК, собственно ПЦР и детекции продукта.
Сущность метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. В реакции участвуют искусственно синтезированные олигонуклеотиды (праймеры), повторяющие строение участка генома микроорганизма, и фермент Taq-полимераза, с помощью которого происходит воспроизведение специфического фрагмента ДНК. На каждом цикле синтезированные ранее фрагменты вновь вступают в реакцию амплификации - это есть цепная
-30 реакция. После 30-40 циклов амплификации исходное количество специфических фрагментов микроорганизма увеличивается в 10 раз (число копий исследуемого фрагмента увеличивается в 2П раз, где п-число прошедших циклов амплификации), что делает возможным регистрацию наработанной ДНК с помощью электрофореза в агарозном геле [19, 20, 41, 136, 137].
Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым эффектом «плато». Точка, в которой ПНР достигает своего плато, в первую очередь определяется числом копий матрицы, изначально присутствующих в реакционной смеси и количеством синтезированной ДНК. В дополнение к обычным причинам, таким как инактивация полимеразы или недостаток дезоксинуклеотидтрифосфата (дНТФ), выход реакции в стадию плато может быть вызван следующими причинами: нехватка полимеразы на однонитевые матрицы в поздних циклах, конкуренция с неспецифическим продуктом или реассоциация продуктов амплификации.
Таким образом, для проведения амплификации с помощью ПНР необходимы два олигонуклеотидных праймера, которые служат затравкой для ДНК-полимеразы и фланкируют исследуемый участок ДНК или РНК, так что синтез с помощью ДНК-полимеразы протекает только между ними.
В качестве полимеразы обычно используют термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из бактерии Thermus aquaticus [96, 102]. Taq-полимераза сохраняет свою активность после тепловой денатурации ДНК, в результате чего отпадает необходимость в замене фермента после каждого цикла. Еще одним достоинством Taq-полимеразы является ее более высокий температурный оптимум: 70-75С, позволяющий значительно повысить специфичность реакции и количественный выход амплификата.
Кроме исследуемой нуклеотидной последовательности, Taq-полимеразы и праймеров в реакционную смесь для ПЦР входят четыре дНТФ, которые являются строительным материалом для достройки праймера Taq-полимеразой [59, 81].
Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов: денатурации, отжига, элонгации (синтеза). На стадии денатурации двуцепочечные молекулы ДІЖ расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул. На стадии отжига праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа. Температура отжига является специфичной для каждой пары праймеров. После отжига праймеров Taq-полимераза начинает комплементарное достраивание второй цепи ДНК (синтез фрагмента) с 3-конца праймера [102, 103].
Амплификацию проводят в термоциклере в автоматическом режиме по заданной программе, который осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.
Многократное копирование участка ДНК возбудителя определяет широкие возможности использования метода. Теоретически чувствительность этого метода безгранична и достигает возможности определения единичной молекулы нуклеиновой кислоты вируса. Таким образом, основным достоинством метода ПЦР является чрезвычайно высокая чувствительность этого молекулярно-биологического исследования.
Другим достоинством является то, что ПЦР позволяет достигать максимальной специфичности анализа, то есть способности выявлять ДНК конкретного инфекционного агента в присутствии ДНК других микроорганизмов и ДНК организма-хозяина, а также проводить генотипирование.
Метод ПНР позволяет работать с любым исходным патматериалом без выделения возбудителя в чистом виде. Кроме того, различные органические компоненты клеток, такие как белки, липиды, углеводы, фрагменты клеточных органелл или мембран, заметно непрепятствуют процессу амплификации. Поэтому в качестве источника матричной ДНК может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал, сохранивший в своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных молекул ДНК. ПНР позволяет осуществлять диагностику латентных форм инфекции.
Особенно ПНР эффективна для диагностики трудно культивируемых и некультивируемых форм микроорганизмов. При этом в отличие от культурального метода не происходит накопления патогенных микроорганизмов, что особенно важно при исследовании высоко вирулентных штаммов возбудителей.
К достоинствам ПЦР относится универсальность процедуры выявления различных возбудителей.
Унифицированный метод обработки биоматериала и детекции продуктов реакции, и автоматизация процесса амплификации дают возможность провести полное исследование в течение 4-8 ч.
К недостаткам метода можно отнести лишь необходимость использования специфических праймеров, которые конструируют и синтезируют только при наличии данных о последовательности нуклеотидов выявляемой нуклеиновой кислоты.
ПЦР является незаменимым референс-методом в тех случаях, когда другие методы дают противоречивые или неопределенные результаты.
Поиск и анализ нуклеотидных последовательностей генома вируса чумы МЖЖ в международных базах данных
На начальном этапе исследований при разработке метода ПЦР для идентификации возбудителя заболевания первостепенным этапом является поиск нуклеотидных последовательностей в международных базах данных по последовательностям нуклеотидов интересующих генома вируса. Поиск проводился в трех широко известных базах данных по ДНК последовательностям: Ген банк (Gen Bank, USA), Европейская лаборатория Молекулярной биологии (EMBL Nucleotide Sequence Database, Europe) и Японская база данных ДНК (DNA Database Bank of Japan), доступная на сайте National Centrefor Biotechnology Information (NCBI).
В результате проведенных работ по отбору нуклеотидных последовательностей генома или отдельных фрагментов РНК вируса из международных баз данных показало огромное количество последовательностей для вируса ЧМЖЖ, хранящиеся в банках генов и ежедневно пополняющиеся новыми данными.
В связи с этим на начальном этапе работ перед нами стояла задача анализа литературных данных по применению метода ПЦР для диагностики ЧМЖЖ.
Особое внимание заслуживают работы, вовлеченные в разработку ПЦР для идентификации вируса ЧМЖЖ. Их близкое родство и высокая гомологичность по нуклеотидным последовательностям затрудняет разработку метода, позволяющего не только идентифицировать возбудителя, но и также дифференцировать данные заболевания. Литературные данные при разработке метода ПЦР для диагностики вируса ЧМЖЖ показывают, что основными объектами при конструировании специфических праймеров являются гены нуклеопротеина и белка слияния. NP-ген, являясь высококонсервативным участком генома для всех морбилливирусов, успешно применяется для диагностики представителей этого рода. Однако ген белка слияния (F-ген) является умеренно консервативным участком генома и может быть использован для разработки праймеров для идентификации вируса ЧМЖЖ и их дифференциации.
В связи с этим в наших работах при конструировании олигонуклеотидных затравок были использованы последовательности генов нуклеопротеина и белка слияния. В результате анализа базы данных Генбанка были сгенерированы более 40 нуклеотидных последовательностей для вируса ЧМЖЖ.
Сравнительный анализ фрагментов генов нуклеопротеина и белка слияния позволил выявить гомологичные участки среди различных штаммов вируса с целью создания специфических праймеров на данные участки (рисунки 4 и 5).
Подбор оптимальных условий проведение ПЦР
Специфичность и чувствительность ПЦР находятся в большой зависимости от таких параметров входящих в состав буфера, как концентрация MgCb и КС1, рН буфера. Изменения в буфере для ПЦР вызывают качественное или количественное изменение выхода амплификата.
MgCl2 необходим для поддержания активности Taq-полимеразы. Концентрация MgCl2 также влияет на отжиг праймеров и денатурацию образца. Однако избыток может вызывать неспецифичность продукта. КС1 и Трис-HCl обеспечивают необходимую ионную силу и рН смеси. Хлорид калия является активатором ПЦР и его добавляют для улучшения отжига праймеров. Предельной концентрацией КС1 является 50 мМ, так как последующее увеличение может привести к ингибированию полимеразы.
Варьирование концентраций MgCl2, КС1 и рН буфера может приводить к уменьшению выхода неспецифического продукта и увеличению выхода амплификата. Обычно оптимальные концентрации перечисленных выше соединений подбираются эмпирическим путем в процессе оптимизации условий реакции. Однако существующие на сегодняшний день наборы для оптимизации ПЦР значительно упрощают эту задачу.
Для подбора оптимальных условий проведения ПЦР был использован набор для оптимизации ПЦР - "PCR Optimization Kit П" фирмы "Sigma".
В ходе работы были апробированы 10 буферных систем, которые различались концентрацией хлористого магния и калия, а также величиной рН. Состав буферных систем приведен в табл. 5.
Амплификацию специфического ПНР продукта проводят в реакционной смеси состоящей из:
1 Ох ПЦР буфер - 2,0 мкл
дНТФ - 0,5 мкл
праймер PCR_PPRV_f3 - 1,0 мкл
праймер PCR_PPRV_r3 - 1,0 мкл
Taq ДНК полимераза - 0,5 мкл
кДНК вируса ЧМЖЖ - 1 мкл
вода до 20 мкл
Амплификацию специфического участка проводили на термоциклере "Gene Amp PCR 9700", фирмы "Applied Bio systems" при следующих режимах:
95С - 2 минуты - денатурация кДНК
94С-30сек
55С-30сек У 40 циклов
72С - 60 сек
72С-10 минут
По завершению очистки кДНК, полученные пробы детектировали электрофорезом в 2% агарозном геле, приготовленном на ТБЕ буфере в присутствии бромистого этидия. Полученные результаты представлены на рисунке 9.
Из полученных результатов видно, что при использовании буферных систем № 6, 7 и 10 не происходит амплификации фрагмента. При использовании остальных буферных систем (№ 1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) нарабатывается ПЦР-продукт размером 274 п.о., представленный на рисунке яркими и четкими полосами. Существенных различий при использовании буферных систем (№1, 2, 3, 4, 5, 8 и 9) не наблюдается. По-видимому, в буферных системах (№ 6, 7 и 10) сочетание более высокой рН и использование данных концентраций MgCb и КС1 приводит к ингибированию реакции.
При проведении ПЦР как было упомянуто основная роль, отведена ферменту Taq-полимеразе. Концентрация фермента в реакции подбирается в зависимости от индивидуальной мишени (кДНК) или праймеров. Если концентрация фермента слишком высокая, то могут образовываться неспецифические продукты, а если слишком низкая, то образуется недостаточное количество амплификата. При подборе оптимальной концентрации брали активность фермента в реакционной смеси от 0,5 едениц до 3,0 ед/50 мкл, и проверяли результаты амплификации гель-электрофорезом в 2 % агарозе, которые представлены на рисунке 10.
Как видно из рисунка 10 концентрация Taq ДНК-полимеразы влияет на выход конечного продукта; заметно, что с повышением концентрации фермента в реакционной смеси происходит увеличение интенсивности полос, а, следовательно, и концентрации ДНК. Однако при активности фермента всего 0,5 едениц нарабатывается ПЦР-продукт, который достаточно легко визуализировать в 2 % агарозном геле в присутствии бромистого этидия под УФ-светом. Нужно отметить, что в разрабатываемой тест-системе полимераза является самым дорогим компонентом. Поэтому в наших экспериментах мы выбрали экономичный расход фермента - 0,5 едениц.
Ионы Mg являются необходимым кофактором для ДНК-полимеразы в ПЦР. Многие компоненты реакционной смеси связывают эти ионы, в том числе ДНК-матрица, праймеры, ампликоны и дНТФ. Как известно, избыток концентрации ионов магния может приводить к появлению неспецифичности продукта реакции. Поэтому, чтобы определить и создать оптимальный избыток несвязанного иона проводили оптимизацию для выбранных концентраций ДНК-матрицы, праймера, дНТФ и ДНК-полимеразы путем изменения концентрации ионов в интервале 1-5 мМ. В наших экспериментах мы изучили влияние концентрации хлорида магния, начиная с 1 мМ постепенно повышая концентрацию до предельного значения 2,5 мМ. Результаты представлены на рисунке 11.
Как видно из рисунка 11, изменение концентрации соли в пределах 1-2,5 мМ существенно не влияло на процесс амплификации. Выход специфического ПЦР-продукта был приблизительно одинаков. Нужно заметить, что и при максимальной концентрации MgCb (2,5 мМ) нарабатывалось достаточно большое количество специфического продукта. На основании полученных экспериментальных данных в дальнейших экспериментах при проведении ПЦР, для приготовления реакционных смесей использовали концентрацию соли 1,5 мМ.
Эпизоото логический мониторинг и использование метода ПЦР для выявления кДНК вируса ЧМЖЖ в полевых материалах
Чума мелких жвачных животных является новым заболеванием на территории Таджикистана.
Анализ материалов статистической ветеринарной отчетности за 1993 - 1999 гг. показывает, что заболеваемость и падеж овец и коз с характерными признаками ЧМЖЖ отмечалось с 1993 года.
По данным ветеринарных служб клинические признаки заболевших и павших животных ранее не встречались на территории Республики Таджикистан среди животных. У больного животного были отмечены общее угнетение, повышение температуры тела, слизистые истечение из носа, из глаз и диарея.
В дальнейшем наличие ЧМЖЖ в Таджикистане было подтверждено в результате эпизоотологического обследования территории республики и лабораторных исследований проб сывороток и патологического материала, взятых от больных животных и была составлена карта распространения ЧМЖЖ в Республики Таджикистан, рисунок 18.
Из данных представленных на рисунке 1 видно, что ЧМЖЖ имеет широкое распространение. Полученные нами данные свидетельствует о том что, ЧМЖЖ в Таджикистане имеет широкое географическое распространение и носит энзоотический характер, то есть случаи заболевания отмечаются ежегодно, отличаясь различной интенсивностью. В эпизоотический процесс вовлекается от 20 до 50% молодняка, в основном 2-6 месячного возраста.
По данным эпизоотических наблюдений за период 2005 по 2008гг., ЧМЖЖ в Таджикистане регистрируется почти круглогодично, за исключением декабря и января. Зимние пастбища низменные, здесь выпадает мало осадков и отсутствует сырость. Кроме того, зимой овцы и козы дополнительно получают концентрированные корма, что способствует повышению общей резистентности организма. Этим объясняется резкое снижение, и даже прекращение случаев заболевания овец чумой в зимний период. Очевидно, этому способствует и приобретённый активный постинфекционный групповой иммунитет овцепоголовья. В апреле-мае количество больных овец и коз резко возрастает и максимальной напряженности эпизоотический процесс достигает в июне. С июля по сентябрь он ослабевает, в октябре-ноябре отмечаются единичные случаи заболевания.
Определенное влияние на эпизоотическую обстановку по ЧМЖЖ оказывает фактор пользования трассами перегона животных с зимних пастбищ на летние, особенно в период следования отар из неблагополучных по заболеваемости хозяйств.
В связи с этим сотрудниками НИИ «Биологические препараты» Республики Таджикистан и РГП НИИПББ Республики Казахстан, были проведены эпизоотические и клинические обследования в хозяйствах Республики Таджикистан. По словам владельцев хозяйств на территорию Республики Таджикистан были завезены овцы из Афганистана. После этого в хозяйстве были зарегистрированы заболевание и падеж молодняка овец и коз в возрасте 1,5-9 месяцев.
Результаты наблюдений показывает, что ЧМЖЖ, где практикуется круглогодичное отгонно-пастбищное содержание животных, встречается периодически независимо от сезона, но чаще всего весной и осенью.
Наибольшая заболеваемость ягнят отмечается при перегоне овец на весенне-летние выпаса и после формирования молодняка текущего года рождения.
Это подтверждается результатами многолетних клинико-эпизоотологических наблюдений. Так, на одной из ферм государственного предприятия «Машъал» Вахшского района Хатлонской области массовые заболевания ягнят 7-8 месячного возраста с характерными признаками чумы мелкого рогатого скота отмечали на 30-35-е сутки после отбивки и формирования стада. Чуму мелких жвачных животных первоначально наблюдали в одной отаре, в дальнейшем заболели 50-60% ягнят соседних отар.
Аналогичные вспышки заболевания в этом хозяйстве наблюдались в 1995 и 1998гг.
Массовые заболевания овец и коз с характерными признаками ЧМЖЖ наблюдали в двух крупных овцеводческих хозяйствах: государственное хозяйство «Чорводор» Вахшского района (34 000 овец) и коллективное хозяйство «Дангара» Дангаринского района (45 000 овец и коз) Хатлонской области. Заболевание отмечали среди ягнят 20-45 дневного возраста. Отход ягнят в этих хозяйствах составил 10-20%. Факторами, способствующими возникновению массовых заболеваний в этих хозяйствах явились плохие условия кормления и содержания животных.
В ходе эпизоотологического мониторинга из очага эпизоотии от больных и павших животных были отобраны 902 пробы биоматериала.
Клиническая картина заболевших животных ЧМЖЖ для наглядности представлена в виде рисунка ниже.
Клинические признаки у овец и коз появились на второй-шестой день после естественного заражения вирусом чумы мелкого рогатого скота.
Пораженные животные заметно ослабевали и становились вялыми. У животных отмечали истечения из глаз, носа и рта, которые затем становились густыми и приобретали желтый цвет в результате вторичного бактериального инфицирования (Рис. 19).
Слизистая оболочка носовой полости, гортани и трахеи покрасневшая, пронизана кровоизлияниями, часто усеяна эррозиями и язвами.
Через два-три дня после начала лихорадки слизистая оболочка ротовой полости и глаз становятся красными. На 4-5-е сутки после лихорадки на слизистых оболочках носовой полости и деснах, небе, губах появляются мелкие точечные сероватые пятна. Ротовая полость становится бледной, и покрывается мертвыми клетками.
Патологоанатомический диагноз
1 Острый катаральный энтерит.
2 Серозный лимфаденит брыжеечных, предлопаточных лимфатических узлов.
3 Точечные и пятнистые кровоизлияния под серозной оболочкой легких, печени, в слизистой оболочке слепой кишки.
4 Острая катаральная пневмония.
5 Серозный лимфаденит бронхиальных лимфатических узлов.
6 Серозный конъюнктивит
7 Серозный ринит.
8 Эксикоз.
9 Истощение.
10 Паралитическое сердце.
Для вирусологических исследований взяты кусочки легких, печени, селезенки, поверхностных лимфатических узлов, почки, сердца, кишечника.
Все пробы, которые были взяты от вынуждено убитого животного исследованы методом ПЦР на выявление кДНК вируса ЧМЖЖ, а также методами ИФА и РДП. Результаты ПЦР представлены на рис. 29.
