Введение к работе
Актуальность проблемы.
Туберкулёз сельскохозяйственных животных продолжает оставаться одной из наиболее распространённых инфекционных болезней, представляющей серьёзную угрозу здоровью людей и препятствующая развитию животноводства, хотя следует заметить, что в борьбе с ней в последние годы достигнуты неплохие результаты.
Наметившаяся тенденция, к улучшению эпизоотической ситуации по туберкулёзу в целом по России, указывает на создание в нашей стране довольно эффективной научно -обоснованной системы, позволяющей в большинстве краёв и областей РФ успешно осуществлять оздоровительные и профилактические мероприятия. Однако эта система ещё далека от совершенства.
При туберкулёзе крупного рогатого скота, как ни при какой другой болезни, успех её ликвидации, сохранности поголовья и предупреждения распространения возбудителя во многом зависит от того, насколько своевременно ставится диагноз.
Степень разработанности темы.
К середине девяностых годов прошлого века, благодаря усилиям учёных многих отечественных НИИ и вузов (М.К. Юсковец, И.В. Поддубский, В.Е. Щуревский, В.П. Урбан, В.И. Ротов, Н.С. Щепилов, Н.А. Александров, А.И. Кузин, М.А. Сафин, A.C. Донченко, Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Р.А. Нуратинов, В.И. Ротов, Н.А. Налетов, О.В. Мартма, Д.Д. Новак, Г.А. Юдин, А.Н. Шаров, Б.Я. Хайкин, Н.М. Колычев, А.С. Жумаш, Ю.И. Смолянинов, Н.А. Шкиль, В.И. Околелов, Н.А. Донченко, Ю.А. Макаров, В.Г. Луницын, В.Н. Кисленко, В.В. Разумовская, М.А. Бажин и другие) была усовершенствована методика комплексной диагностики туберкулёза у этого вида животных и включена в обязательные санитарные и ветеринарные Правила, действующие на всей территории РФ. Но и эта уже усовершенствованная методика ещё очень сложна и требует затрат времени на окончательную постановку диагноза до 3 и более месяцев (В.Г. Ощепков 2001, 2003 и др.).
Кроме того, в последние годы во многих благополучных регионах стала более очевидной проблема пара- и псевдоаллергических реакций, обусловленных циркуляцией в стадах крупного рогатого скота так называемых атипичных микобактерий и других патогенов, которые вызывают аллергические реакции на ППД туберкулин. Эти реакции зачастую носят массовый характер и вынуждают в большинстве случаев проводить преждевременный убой здорового, продуктивного скота, нанося значительный материальный ущерб, который зачастую превышает в десятки раз ущерб от туберкулёза.
Цель и задачи исследований.
С учётом актуальности дифференциальной диагностики туберкулёза нами была поставлена цель – дать сравнительную оценку существующим и новым экспресс - методам дифференциальной диагностики аллергических реакций у крупного рогатого скота, вызываемых патогенными микобактериями (М. bovis, M. tuberculosis) и другими факторами бактериальной и не бактериальной природы.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
- провести анализ эпизоотической ситуации по туберкулёзу крупного рогатого скота, сложившейся в Российской Федерации в последние два десятилетия и значимости неспецифических реакций на ППД-туберкулин в диагностике этой инфекции;
- разработать эффективный способ определения аллергизирующих свойств у атипичных микобактерий, выделяемых от крупного рогатого скота, реагирующего на ППД-туберкулин
- дать сравнительную оценку специфичности аллергического метода диагностики туберкулёза и микобактериозов с применением ППД-туберкулина во внутрикожной и пальпебральной пробах;
- усовершенствовать хемилюминесцентный метод дифференциации туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота, содержащегося в благополучных по туберкулёзу фермах;
- провести научно-производственное испытание диагностического иммунохроматографического теста BovidTB START-PAK, предложенного фирмой Chembio Diagnostic Systems, Inc. (США);
- изучить диагностическое значение КАД-теста с новым рекомбинантным аллергеном в условиях благополучных и неблагополучных по туберкулёзу хозяйств;
- разработать комплексную систему дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин с применением традиционных и новых экспресс-методов.
Научная новизна исследований.
Впервые дана комплексная сравнительная оценка аллергического, хемилюминесцентного и иммунохроматографического методов диагностики туберкулёза, а также их значимости в дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин.
Экспериментально обоснована комплексная схема прижизненной и послеубойной (посмертной) дифференциальной диагностики специфических и неспецифических реакций на ППД-туберкулин у крупного рогатого скота, включающая модифицированную пальпебральную пробу, внутрикожные пробы с ППД-туберкулином и новым рекомбинантным аллергеном, хемилюминесцентный и культурально - генетический методы.
Теоретическая и практическая значимость работы.
На основании результатов сравнительных исследований диагностическим лабораториям, занимающимся проблемами туберкулёза, предложены наиболее надёжные тесты и методики их применения для дифференциации неспецифических реакций на ППД-туберкулин, проявляющихся в скотоводческих фермах, благополучных по туберкулёзу.
Материалы исследований, приведённых в диссертации и её автореферате, могут быть использованы в учебных программах ветеринарных академий, институтов и колледжей.
Материалы и методы исследований.
Работа по теме выполнялась в период с 2007 по 2012 г. в лаборатории эпизоотологии и мер борьбы с туберкулёзом Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллёза и туберкулеза животных. В производственных условиях исследования проводились в животноводческих хозяйствах Омской, Новосибирской и Тюменской областей РФ.
При анализе эпизоотического состояния различных регионов Российской Федерации, в том числе и Омской области, использованы доступные для изучения статистические данные Департамента ветеринарии МСХ, ФГУ «Центр ветеринарии», материалы Главного управления ветеринарии Омской области, областной и районных ветеринарных лабораторий.
Объектом экспериментальных исследований служили: крупный рогатый скот и лабораторные животные (морские свинки). Всего было исследовано 21615 коров и 188 лабораторных животных.
В работе были использованы эпизоотологический, клинический, аллергический, хемилюминесцентный, иммунохроматографический, патологоанатомический, бактериологический, молекулярно-генетический (ПЦР) и культурально - генетический методы исследований. Эпизоотологические, клинические, патологоанатомические и бактериологические исследования выполнены по общепринятым методикам.
При аллергических исследованиях использовали ППД-туберкулин для млекопитающих, ППД-туберкулин для птиц и КАМ (комплексный аллерген из атипичных микобактерии) производства Курской биофабрики. Для внутрикожного, введения туберкулинов использовали безигольные инъекторы БИ-7.
Все традиционные диагностические исследования в производственных условиях проводили с участием представителей районных ветеринарных служб и специалистов хозяйств. Работа проводилась в соответствии с Санитарными правилами СП 3.1.093-96 и Ветеринарными правилами ВП 13.3.1325-96, п. 10 «Туберкулез», утвержденными Госкомсанэпиднадзором и Минсельхозпродом России (1996), а также «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» (утверждено Департаментом ветеринарии МСХ Российской Федерации 18.11.2002). Отдельные фрагменты аллергических исследований (пальпебральная проба, КАД-тест) проводили в собственной модификации.
Усовершенствование хемилюминесцентного метода диагностики, осуществлялось с позиций повышения безопасности его использования и увеличения срока хранения и транспортировки проб крови с жизнеспособными лейкоцитами и их пригодности для диагностических исследований (до 6 – 7 суток).
Диагностическая ценность усовершенствованного ХЛ-анализа испытана в опытах на 40 морских свинках и на 1249 коровах из благополучных и неблагополучных по туберкулёзу стад.
Иммунохроматографический тест (ИХТ), испытан с учётом рекомендаций сотрудников фирмы-разработчика «Chembio Diagnostic Systems, Inc.» (США) и собственных предварительных данных (2007г.).
Антиген, используемый в этом тесте, готовится по генно-инженерной технологии, включающую секвенцию ДНК патогенных микобактерий и встраивание генов, кодирующих специфическую структуру их антигенов, в ДНК кишечных бактерий E.coli, синтезирующих эти антигены в нужных количествах.
Такие рекомбинантные антигены обычно отличаются высокой специфичностью и взаимодействуют, как считают авторы этой технологии (Les S., Stuzman et al.), только с антигенами к патогенным микобактериям (М. tuberculosis, M. bovis и др.).
До использования диагностический комплект теста (хроматографические пластинки с антигеном, буферный раствор, сыворотки крови), хранили в оригинальной упаковке фирмы-изготовителя при температуре плюс 2-8С с обязательным учетом сроков его изготовления.
Первоначально была изучена специфичность и чувствительность в опытах на морских свинках (по 20 голов), а затем в производственных условиях на 249 коровах и нетелях из благополучных и неблагополучных по туберкулёзу ферм.
Для лабораторных исследований был отобран биологический материал (лимфатические узлы, фрагменты паренхиматозных органов) от 235 голов убитого с диагностической целью крупного рогатого скота.
Пробы отбирали в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению лабораторных исследований при туберкулезе животных», (М., 1992). Отобранный материал обрабатывали методом Гона и А.П. Аликаевой. Материал использовали для микроскопии, посева на питательные среды (Фаст–3Л, Левенштейна–Йенсена) и биологического исследования на лабораторных животных (морских свинках).
Животных опытных групп содержали в соответствии с «Правилами работы с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 №755). Лабораторные животные находились в условиях вивария, кормление осуществляли согласно норм рациона для лабораторных животных (Г.Е. Батрак, А.М. Кудрин, 1979). За подопытными животными вели постоянное наблюдение, в опыт брали только клинически здоровых животных.
Идентификацию выделенных культур проводили соответственно ГОСТ 26072-84 «Методы лабораторной диагностики туберкулеза» и ГОСТ 27318-87 – «Методы идентификации атипичных микобактерий». Культурально-морфологические и биохимические свойства микобактерий изучали в соответствии с: методическими рекомендациями «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий» (Оттен Т.Ф., 1994), приказом Минздрава СССР № 558 от 08.06.78 года «Об унификации микробиологических методов исследований при туберкулезе» и приказом Минздрава РФ № 109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации».
Бактериоскопические исследования проводили по методу Циля-Нильсена с оценкой результатов в визуализированной системе с фотодокументированием Axiostar plus Carl Zeiss. Результаты обработаны в программе Axiovision Rel 4.7.
Культурально-генетический метод исследования, основанный на сочетании культурального посева на модифицированные питательные среды и полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили с использованием тест-системы «МТБ-КОМ» производства НИИ эпидемиологии и микробиологии, г. Москва.
Выявление ДНК Mycobacterium tuberculosis complex проводили методом полимеразной цепной реакции с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле. ПЦР-амплификацию проводили на приборе «Ampli-4» производства «ДНК-Технология», Россия.
Кожно-аллергический дифференциальный тест (КАД-тест) использовался по методике аналогичной применению «Диаскинтеста» в медицинской практике. Аллерген (антигены-гаптены) для этого теста был изготовлен научно-производственными фармацевтическими фирмами «Лекко» и «Генериум» (Россия) с участием сотрудников ВНИИБТЖ (профессора В.Г. Ощепкова и старшего научного сотрудника Н.Н. Кощеева).
Опытные серии аллергена, условно-названного «НРА» (новый рекомбинантный аллерген) были испытаны в опытах на 40 морских свинках и 2460 коровах, нетелях и тёлках скотоводческих ферм (хозяйств), из которых 4 были благополучными и 2 неблагополучными по туберкулёзу крупного рогатого скота.
Все цифровые данные экспериментов и научно-производственных опытов были обработаны методами математической статистики, принятыми в биологии и медицине с использованием компьютерной программы Microsoft Office Excel 2007 и с учётом рекомендаций Н.А. Плохинского (1969) и Г.Ф. Лакина (1990).
Отдельные фрагменты исследований выполнялись совместно с канд. ветеринар. наук, доцентом Таллер Л.А., канд. ветеринар. наук Дюсеновой Г.М., канд. ветеринар. наук Бордюгом В.Ф., канд. ветеринар. наук Кощеевым Н.Н., канд. ветеринар. наук Секиным Е.Ю., канд. ветеринар. наук Понкратовой А.Д., аспирантом Янченко Т.А. За оказанную методическую и практическую помощь всем им искренне благодарен.
Особую признательность за полезные советы и конструктивные замечания при выполнении и оформлении результатов диссертационной работы выражаю научному руководителю – профессору Владимиру Григорьевичу Ощепкову.
Апробация полученных результатов.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИБТЖ Россельхозакадемии (Омск, 2008-2012гг.), на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов Института ветеринарной медицины ОмГАУ (Омск, 2009г., 2010г.), на межрегиональных научно-практических конференциях ВНИИБТЖ (Омск 2008-2012гг.), на международной научно-практической конференции посвященной 105-летию КазНИВИ (Алматы, 2010г.), на втором Сибирском ветеринарном конгрессе (Новосибирск, 2010г.), обсуждены и рекомендованы к защите на межлабораторном заседании сотрудников ВНИИБТЖ (Омск, 2012г.).
Публикация результатов исследований.
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, 4 статьи в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Достижения науки и техники АПК», «Ветеринария и кормление»).
Объем и структура диссертации.
