Содержание к диссертации
Введение
1.0. Обзор литературы 9
1.1. Возбудители туберкулеза и его формы изменчивости 9
1.2. Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота 14
1.2.1. Аллергический метод диагностики 15
1.3. Лабораторные методы диагностики туберкулеза животных 21
1.3.1. Бактериоскопический метод исследования 21
1.3.2. Культуральный метод исследования 22
1.3.3. Патологоанатомический метод исследования 23
1.4. Характеристика эпизоотического процесса при туберкулезе крупного рогатого скота 24
1.5. Дезинфицирующие средства применяемые для уничтожения микобактерий 27
2.0. Собственные исследования 40
2.1. Материал и методы исследования 40
3.0. Результаты исследований 47
3.1. Характеристика эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации 47
3.2. Эпизоотический статус ООО "Семхоз Ракитянский" ММК с.Васильевка Ракитянского района, Белгородской области 51
3.3. Динамика выявления животных реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих 54
3.4. Эффективность применения молекулярно-генетического теста при исследовании биоматериала на туберкулез 60
3.5. Результаты поисковых исследований по разработке плотной синтетической элективной питательной среды для первичного выделения микобактерий 63
3.6. Изучение влияния методов предпосевной обработки биоматериала на рост микобактерий, в том числе L-форм при посевах на питательные среды 67
3.7. Изучение сравнительной эффективности дезинфицирующих средств 71
3.7.1. Изучение выделяемости культур микобактерий из объектов внешней среды 71
3.7.2. Изучение бактерицидных свойств анолитов приготовленных по технологии «АКВА-ЭХА» в камеральных условиях 74
3.7.3. Сравнительное изучение дезинфицирующих свойств растворов, полученных по технологии «АКВА-ЭХА» в условиях неблагополучного по туберкулезу хозяйства 78
4.0. Обсуждение результатов исследований 82
5.0.Выводы 93
Практические предложения 94
Список сокращений и условных обозначений 95
Список используемой литературы 96
Список иллюстрированного материла 121
- Аллергический метод диагностики
- Эпизоотический статус ООО "Семхоз Ракитянский" ММК с.Васильевка Ракитянского района, Белгородской области
- Результаты поисковых исследований по разработке плотной синтетической элективной питательной среды для первичного выделения микобактерий
- Изучение бактерицидных свойств анолитов приготовленных по технологии «АКВА-ЭХА» в камеральных условиях
Аллергический метод диагностики
В соответствии с историческими этапами разработки, изучения и особенностями химического строения среди этих соединений выделяют три поколения дезинфицирующих средств на основе хлора, которые существенно отличаются друг от друга (Колычев Н.М., 1984,1985,1987;)
К первому поколению относится хлорная известь, промышленностью выпускается в двух марках: А и Б. По количеству активного хлора каждая форма подразделяется на три сорта. В хлорной извести марки А первого, второго и третьего сортов содержится хлора соответственно 28, 25 и 20%, а в препарате марки Б - 35, 32 и 27%. Обеззараживающим действием в отношении микобактерий туберкулеза имеет осветленный раствор хлорной извести, содержащий 5% активного хлора при 3-6 часовой экспозиции, 20% взвесь свежегашеной извести при трехкратном нанесении с часовым интервалом и экспозицией 6 суток (Менып А.Ф., 1984,1994; Поляков А.А., 1986; Туренгбаев К.А., 1989; Шеина И.В., 1982; Hahesy Т., 1992).
Второе поколение представлено хлорамином Б. Большинство препаратов в которых действующим началом являются хлорамин Б, не обладают туберкулоцидными свойствами. Достаточную активность в отношении микобактерий приобретают активированные аммиаком, сернокислым или хлористым аммонием растворы хлорамина Б, препараты «Клорина» и «трихлороль» при 6-часовой экспозиции (Арзуманян СП., 1993; Барабанов И.И., 1987; Дудницкий И.А., 1989; Кассич Ю.Я., 1990; Поляков А.А., 1975; СадыковаВ.И., 1983).
Несмотря на большое количество разработанных хлорсодержащих препаратов, надо заметить, что они имеют: резкий запах, раздражают слизистые оболочки глаз и верхних дыхательных путей, вызывают коррозию металлов, обесцвечивают окрашенные изделия, имеют низкую стабильность при хранении. К третьему поколению относятся средства дезинфекции, которые в качестве действующего вещества содержат хлороз циануровую кислоту или хлорпроизводные гидантоина (Архипов О.П., 1949,1948; Zorawski С, 1974,1983,1987) Они или их композиционный состав, имеют модернизированную форму выпуска, что позволяет значительно снизить их отрицательные качества. Препараты этой группы имеют широкий спектр противомикробной активности, включая микобактерии туберкулеза.
Группа спиртов. Насчитывается около 14 видов спиртов, входящих в состав дезинфицирующих препаратов, но наибольшее практическое применение получили этиловый и изопропиловый. Механизм их антимикробного действия сводится к денатурации структурных и ферментных белков микробной клетки. В концентрации 60 - 90% они активны в отношении вегетативных форм бактерий, микобактерии, грибов и оболочечных вирусов. Отрицательным действием их является то, что спирты не имеют моющих свойств, фиксируют органические загрязнения и могут портить изделия из пластмасс и резины. В таких препаратов быстро снижается концентрация действующего вещества в результате быстрого испарения (Аржаков П.В., 2002,2004; Березнев А.П., 1990; 1994; Бурганов З.Б., 1995; Волков Ю.П., 1992; Высоцкий А.Э., 2002; Высоцкий А.Э., и соавтр.,2006; Тихонов П.М., 1979).
Применение спиртов в чистом виде для дезинфекции экономически невыгодно, поэтому их вводят в рецептуры современных комбинированных средств: «Декосепт», «Деконекс», «Соларсепт», «АХД 2000», «Хоспидермин».
Для дезинфекции животноводческих и птицеводческих помещений применяют однохлористый йод, 5% спиртовой раствор йода, йодоформ и йодинол используют для очистки и дезинфекции кожи. Аэрозоль йодистого алюминия применяют методом возгонки, что позволяет снизить бактериальную загрязненность воздуха в 3-10 раз.
Негативом применения препаратов этой группы относятся появление йодостойких штаммов бактерий, снижение антимикробной активности при наличии белкового субстрата, токсичность, сенсибилизирующие свойства, дубящие и прижигающие действия на ткани организма, развитие гиперчувствительности (Кузин А.И., 1992).
Альдегиды - высокоактивные соединения с высокими антимикробными свойствами ко всем видам микроорганизмов, механизм действия которых направлен на алкилирование амино - и сульфгидрильных групп протеинов и подавления их синтеза. Альдегиды достаточно широко используются для дезинфекции. Среди них наибольшее распространение получили формальдегид, глутаровый и ортофталевый альдегиды (Ощепков В.Г., 2002; Stonchill, А.А., Krop S., Borick P.M., 1963; Strauch, D. J., 1987)
Формальдегид (альдегид муравьиной кислоты) характеризуется высокой антимикробной активностью. Этот препарат инактивирует микроорганизмы благодаря высокой реакционной способности.
Высокие бактерицидные свойства в отношении микобактерии туберкулеза имеет щелочной раствор формальдегида, содержащий 3% формальдегида и 3% едкого натра. Эта композиция активна при норме расхода 0,5 л/м2, а при обработке объектов с органическим загрязнением - 0,75 л/м2.
Щелочной формальдегид уничтожает возбудителя туберкулеза M.bovis за 60 минут, тогда как большинство атипичных микобактерии устойчивы даже до 5% концентрации щелочного формальдегида и по более длительной экспозиции (несколько часов). Данная композиция препарата при минусовой температуре не уничтожает микобактерии туберкулеза в течение 30 часов. Обеззараживания навоза овец от неспорообразующих патогенной микрофлоры достигается при расходе 3 кг формальдегида на 1 м3 навоза при экспозиции в течение 72 часов. Дезинфекцию спецодежды при туберкулезе проводят путем его погружения в 4% раствор формальдегида не менее 4 часов (Березнев А.П., и соавт., 1990,1994).
Эпизоотический статус ООО "Семхоз Ракитянский" ММК с.Васильевка Ракитянского района, Белгородской области
Наиболее напряженная эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота наблюдалась в животноводческих хозяйствах Белгородской области. Так только за 2009 год в одном из в неблагополучных хозяйств было убито с диагностической целью реагирующего на ППД -туберкулин скота 349 голов, что составило 24% от общего числа убитых и было обнаружено 13% туш с характерными для туберкулеза патологоанатомическими изменениями.
Принимая во внимание вышеизложенные ретроспективные и проспективные эпизоотологические данные можно сделать заключение, о том что эпизоотическая ситуация по туберкулезу крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах РФ имеет характер постоянного устойчивого неблагополучия в ряде регионов.
Приведенные выше данные по изучению эпизоотической ситуации в Российской Федерации по туберкулезу крупного рогатого скота и постоянное неблагополучие животноводческих хозяйств Белгородской области по данной инфекции, подтолкнули нас на изучение эпизоотического статуса одного из стационарно неблагополучных хозяйств - ООО "Семхоз Ракитянский" ММК с. Васильевка. 3.2.Эпизоотический статус ООО "Семхоз Ракитянский" ММК с. Васильевка, Ракитянского района, Белгородской области
ООО "Семхоз Ракитянский" ММК с. Васильевка находиться в Ракитянском районе, Белгородской области. В эксплуатацию животноводческий комплекс ввели в 2010 году. Животноводческие помещения с беспривязным содержанием крупного рогатого скота, состоят из 5 корпусов изготовленных из мягких металлических конструкций, расположенных на расстоянии 5 километров от ближайших административных зданий. Стадо укомплектовано крупным рогатым скотом голштино-фризской и черно-пестрой породы. Удои на одну фуражную корову составляют 3,2 и 3,8 литра. Имеются два выгульных двора. Около 60% животных постоянно реагируют в РИД на антиген вируса лейкоза крупного рогатого скота, т.е. данное хозяйство является неблагополучным по данной инфекции. Наблюдается ранний переход выпойки телят от цельного молока на искусственный заменитель цельного молока. В среднем 25-30% поголовья растелившихся коров имеют послеродовые эндометриты, обнаруживаются последствия инфекционного ринотрахеита с пустулезным вульвовагинитом, проявляющийся обильной сыпью в нижней части влагалища и истечением из носовых отверстий, что подтверждается результатами серологических тестов. Молодняк (35%) до месячного возраста имеет поражения верхних дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, что проявляется длительными кашлевыми реакциями и диарейными явлениями. Около 30% поголовья фуражного стада имеют поражение дистального отдела конечностей, сопровождающиеся хромотой и нарушением двигательной активности.
"Семхоз Ракитянский" является неблагополучным по туберкулезу с ноября 2012 года. В период с 2012 по 2013 гг., в этом хозяйстве было подвергнуто ежемесячным аллергическим исследованиям 21329 голов крупного рогатого скота. Было выявлено 775 голов реагирующих на ППД - туберкулин для млекопитающих. Результаты исследований представлены в таблице 2. Все реагирующие животные подверглись диагностическому убою с проведением патологоанатомических и бактериологических исследований.
Анализируя данные таблицы 2 и рисунка 2 необходимо отметить, что с ноября (2012) по январь (2013) наблюдалась тенденция постепенного уменьшения в 2 раза количества реагирующих животных. В феврале (2013) количества реагирующих животных увеличилось в 1,8 раза. В дальнейшем продолжилась тенденция уменьшения выявляемости количества реагирующих животных. Что касается присутствия у этих особей патологоанатомических изменений, свойственных туберкулезной инфекции, то в этот период исследований данный показатель тоже имел тенденцию к постепенному уменьшению и в июне (2013) понизился в 21 раз против ноября (2012). Рисунок 2. Соотношения выявляемое реагирующих на ППД-туберкулин животных к количеству обнаруженных туберкулезных поражений
Данная корреляционная зависимость прерывалась в июле (2013) и характеризовалась увеличением числа реагирующих на ППД - туберкулин животных в 7,8 раза и выявляемостью особей с туберкулезными патологоанатомическими изменениями в 8,2 раза. Если в начале проведения противотуберкулезных мероприятий среди 194 голов реагирующего скота, АДП позволяла выявить 133 особи с туберкулезными патологоанатомическими изменениями т.е. 68,5%, то уже через 3 месяца данный показатель снизился до 34%, а еще через 5 месяцев уменьшился до 10,0%, к концу исследований (июнь 2013г.) данный показатель составил 4,0%. Это свидетельствует о понижении чувствительности и специфичности АДП в стационарно-неблагополучном хозяйстве, что связано по всей видимости с увеличением количества анергичных животных. Наглядность полученных результатов представлена в рисунке 2. З.З.Динамика выявления животных реагирующих на ППД-туберкулин для млекопитающих
Из данных приведенных в таблице 3 видно, что в ноябре 2012 года было выявлено реагирующих на ППД - туберкулин животных 194 гол., в т.ч. 179 коров, 3 телки (6-12 мес. возраста) и 12 телок (12-18 мес. возраста). Из них с утолщением кожной складки от 3 до 5 мм - 67; от 5 до 10 мм - 58; более 10 мм -69 голов, что составило 35,0%, 29,0%, 36,0%, соответственно. Интенсивность кожных реакций у телок была следующей: из числа реагирующих у двух особей (6-12 мес. возраста) составила 3-5 мм, у одной - более 5; у 7 (12-18 мес. возраста) - 3-5 мм, у 5 от 5 до 10 мм. В декабре положительно реагировало 99 гол., в т.ч. 38 коров, 34 телки (6-12 мес. возраста) и 27 бычков (2-6 мес. возраста). Из них с утолщением кожной складки от 3 до 5 мм - 32; от 5 до 10 мм - 26; более 10 мм -23 головы, что составило 32,0%, 26,0%, 43,0%, соответственно. Интенсивность кожной реакции у молодняка была следующей: у шести телок (6-12 мес. возраста) от 3 до 5 мм, у 11 от 5 до 10 мм, 17 - более 10 мм; у 5 бычков (2-6 мес. возраста) 3 до 5 мм, 7 голов с утолщением от 5-10 мм, у 15 голов более 10 мм.
В январе было выявлено 94 коровы реагирующих на туберкулин. Интенсивность кожной реакции была следующей: у 64 - от 3 до 5 мм; у 20 от 5 до 10 мм; у 10 более 10мм, что составило 68,0%, 21,0%, 11,0%, соответственно.
В феврале выявлено реагирующих 166 голов, в т.ч. 35 коров, 62 телки (2-6 мес. возраста), 11 телок (12-18 мес. возраста), бычков (2-6 мес. возраста) - 58 голов. Из них с утолщением кожной складки от 3 до 5 мм - 47; от 5 до 10 мм -38; более 10 мм - 25 голов, что составило 47,0%, 38,0%, 15,0%, соответственно. Интенсивность кожной реакции у молодняка была следующей: у 28 телок (2-6 мес. возраста) с утолщением кожной складки на 3 до 5 мм; у 24 голов от 5 мм до 10 мм; у 10 голов более 10 мм. У 11 телок (2-18 мес. возраста) от 3 до 5 мм; у 23 бычков (2-6 мес. возраста) от 3 до 5 мм; у 29 голов от 6 до 10 мм; у 6 более 10 мм.
В марте прореагировало 117 голов, в т.ч. 111 коров и 6 телок (12-18 мес. возраста), из них с утолщением кожной складки от 3 до 5 мм - 55; от 5 до 10 мм - 45; более 10 мм - 17 голов, что составило 47,0%, 38,0%, 15,0%, соответственно. Интенсивность кожных реакций у коров проявлялось следующим образом: 7 голов - от 3 до 5 мм; у 15 от 6 до 10 мм; у 19 более 10 мм. У 6 телок (12-18 мес. возраста) - от 3 до 5 мм.
Результаты поисковых исследований по разработке плотной синтетической элективной питательной среды для первичного выделения микобактерий
Разработанная питательная среда предназначена для ускорения выявления микобактерий. В её состав включены компоненты необходимые для роста микобактерий.
В ходе поисковых опытов нами было сконструировано три варианта среды. Считаем уместным привести их составы в мае /%:
Среда №1. Аммоний лимоннокислый-1,5; калий фосфорнокислый двузамещенный-2,0; магний сернокислый семиводный-0,2; железо сернокислое-0,1; сернокислый цинк-0,1; гликокол-2,0; фумаровая кислота-2,0; натрий фосфорнокислый двузамещенный-0,5; хлористый натрий-0,3; глицерин-20,0; агар-агар-23,0; глицин-1,5; остальное вода.
Среда №2. Аммоний лимоннокислый-1,7; калий фосфорнокислый двузамещенный-2,4; магний сернокислый семиводный-0,3; железо сернокислое-0,15; сернокислый цинк-0,15; гликокол-2,5; фумаровая кислота-2,5; натрий фосфорнокислый двузамещенный-1; хлористый натрий-0,4; глицерин-22,0; агар-агар-25,0; глицин-1,8; остальное вода.
Среда №3. Аммоний лимоннокислый-1,3; калий фосфорнокислый двузамещенный-1,8; магний сернокислый семиводный-0,1; железо сернокислое-0,05; сернокислый цинк-0,05; гликокол-1; фумаровая кислота-1,5; натрий фосфорнокислый двузамещенный-0,3; хлористый натрий-0,15; глицерин-18,0; агар-агар-21,0; глицин-1,0; остальное вода. Во всех трех вариантах рН был 7,2±0,2.
Все три варианта испытуемых плотных питательных сред для первичного выделения микобактерий готовили следующим образом. Навески аммония лимоннокислого растворяли в горячей дистиллированной воде. Другие соли и глицерин в указанной выше последовательности добавляли в теплую дистиллированную воду. После полного растворения добавляли 23,0±2,0 гр. агар-агара. рН среды доводили до нужных параметров дробным добавлением гидроксида натрия. Стерилизацию проводили автоклавированием в режиме 120С в течение 30 минут.
Для изучения ростовых свойств микобактерий нами использовались референтная культура M.bovis (в концентрации до 0,00001 мг/мл) и гомогенаты биоматериала (лимфатические узлы). Посевы проводили на все три образца испытуемой плотной питательной среды. В качестве аналога для сравнения использовали среду Левенштейна-Йенсена. Полученные взвеси высевали по 0,25 см3 на 1 пробирку. Пробирки помещались в термостат при 37С. Учет ростовых свойств микобактерий на испытуемых опытных образцах питательных сред и контрольной среды (Левенштейна-Йенсена) проверяли каждые сутки. Полученные данные представлены в таблице 7.
Результаты сравнительного изучения ростовых свойств испытуемой плотной питательной среды .в Пат. материал (п) проб, биоматериала МБТ / взвесь Рост на испытуемых плотных питательных средах Рост на среде Левенштейна Среда №1 Среда №2 Среда №3 - Иенсена (контроль) Выделено в сутки а н л ч Выделено в сутки а н л ч Выделено в сутки а н л ч Выделено в сутки а н л ч 1. Штамм M.bovis -/0,00001 мг/мл 15±0,1 - 17±0,3 - 19±0,3 - 18±0,2 2. (п) проб спат.изменениями 91- 17±0,2 9 21±0,4 9 28±0,1 9 30±0,3 9 3. (п) проб безпат. изменениями 20/- 17±0,2 18 24±0,2 15 30±0,1 12 34±0,3 12 Первичный рост микобактерий туберкулеза M.bovis в образце №1 (опытная среда) отмечен на 15-16 сутки. Обнаруживала колонии в виде мелких с маковое зерно, бугорчатых белого цвета (1-2) образований. Рост микобактерий на опытной среде (образец №2) отмечен на 17-18 сутки. В образце №3 рост появился на 19-20 сутки в виде слабозаметных 1-2 колоний образований величиной меньше макового зерна.
При посеве надосадочной жидкости из биоматериала на испытуемую плотную питательную среду (образец №1) первичный рост колоний наблюдали на 17-18 сутки. Было выделено 27 культур M.bovis.
На испытуемых средах (образцы №2 и №3), рост микобактерий отмечали на 21-22 и 30-31 сутки. При микроскопии мазков окрашенных по Цилю-Нильсену обнаруживали полиморфные палочки красного цвета с округлыми краями (характерно для M.bovis). Колонии были представлены в виде цвета слоновой кости в R-форме (с бугристыми и неровными краями).
На среде Левенштейна-Иенсена (контроль) рост микобактерий отмечали в виде единичных бугорчатых образований с просяное зерно, на 18-19 сутки. Было выделено 21 культура, что на 6 меньше в сравнении с образцом №1.
Исходя из результатов проведенных экспериментальных опытов, можно сделать заключение о том, что разработанный состав питательной среды имеет определенное преимущество перед стандартной питательной средой Левенштейна-Иенсена. Использование этого варианта среды позволяет ускорить процесс получения первичных культур микобактерий в среднем от 3 до 5 суток. Полученные результаты использованы в Методических рекомендациях по применению питательных сред для выделения M.bovis и L-форм, утверждены методической комиссией факультета ветеринарной медицины БелГСХА им. В .Я. Горина протокол №4 от 17.12.2014г. З.б.Изучение влияния методов предпосевной обработки биоматериала на рост микобактерий, в том числе L-форм при посевах на питательные среды
Исследования по изучению ростовых свойств питательных сред провели с использованием двух видов предпосевной обработки: по методу Аликаевой А.П. и более щадящего режима с использованием раствора 3% серной кислоты.
В качестве объекта исследований использовали 75 проб биоматериала, полученного от больных животных: из них 53 без характерных для туберкулеза изменений: 13 с незначительными увеличениями лимфатических узлов и кровоизлияниями; 9 с характерными для туберкулеза патологоанатомическими изменениями в лимфатических узлах.
Посевы проводили на испытуемую плотную питательную среду для первичного выделения микобактерий и среду Левенштейна-Йенсена.
При применении предпосевной обработки биоматериала по Аликаевой А.П. (1940), было выделено: на среде Левенштейна-Иенсена-18 (24,0%) культур микобактерий, а на испытуемой среде-21 (28,0%). Рост микобактерий на среде Левенштейна-Иенсена проявился на 20-21 сутки, а на испытуемой на 14-15 сутки. На среде Левенштейна-Иенсена было выявлено 7 культур в R-форме, S-форме-П, а на испытуемой в R-форме-Іб, 8-форме-5. Загрязненность посевов при использовании предпосевной обработки по Аликаевой А.П. составила 0,6±0,009% на среде Левенштейна-Иенсена и плотной питательной среде 0,5±0,009%.
При применении 3% раствора серной кислоты было выделено: на среде Левенштейна-Иенсена 21 (28,0%) культура микобактерий, а на испытуемой среде-22 (29,3%). Первичный рост наблюдался на 18-19 сутки и 16-17 сутки, , соответственно. При этом на среде Левенштейна-Иенсена в Я-форме-8, S-форме-12, а на плотной питательной среде в R-форме-Іб, S-форме-б. Загрязненность посевов с использованием предпосевной обработки 3-% раствором серной кислоты составила на среде Левенштейна-Иенсена 1,2±0,009% и на плотной питательной для первичного выделения микобактерий 0,95±0,009%.
При посеве 13 проб (лимфатические узлы с незначительным увеличением и кровоизлияниями) на среде Левенштейна-Иенсена было выделено-28 культур M.bovis. Из них при обработке по методу Аликаевой А.П.: 5 на среде Левенштейна-Иенсена, и 9 на плотной питательной среде для первичного выделения микобактерий. При обработке 3% раствором: 6 и 8 культур , соответственно. Что касается L-форм микобактерий, то они получены только после обработки 3% раствором серной кислоты. При этом на среде Дорожковой И.Р. -13, а на испытуемой питательной среде Белгородской ГСХА-18 культур L-форм. Применение предпосевной обработки с использованием 3% раствора серной кислоты позволило выделить на среде Дорожковой И.Р -54 (72,0%) культуры L-форм микобактерий; на испытуемой питательной среде-57 (76,0%). Первичный рост культур L-форм наблюдали на 15-16 сутки и 14-15 сутки, соответственно. Загрязненность посевов при использовании предпосевной обработки с использованием 3-% раствора серной кислоты составила 1,3±0,01% на среде Дорожковой И.Р. и 1,1±0,02% на испытуемой. Результаты исследований представлены в таблице 9.
Изучение бактерицидных свойств анолитов приготовленных по технологии «АКВА-ЭХА» в камеральных условиях
Применение предпосевной обработке лимфатических узлов по методике Аликаевой А.П.(1940) было не информативным. Рост L-форм микобактерий как на питательной среде Дорожковой И.Р., так и на питательной среде для выделения L-форм отсутствовал. Это связано с тем, что высокая концентрация серной кислоты, используемая данной методике, обезвреживает деструктивные по клеточной стенке L-формы микобактерий. Напротив, применение 3% раствора серной кислоты, с использованием того же биоматериала, позволило выделить на среде Дорожковой И.Р.-54 (72%) культуры микобактерий, а на питательной среде Белгородской ГСХА-57 (76%) L-форм микобактерий. Первичный рост наблюдался на 15-16 сутки и 14-15 сутки, соответственно. Загрязненность посевов при использовании предпосевной обработки 3-% раствором серной кислоты составила на среде Дорожковой И.Р. 1,3±0,01% и 1,1 ±0,02% на питательной среде для выделения L-форм микобактерий.
L-форм микобактерий на питательных средах Дорожковой И.Р. и питательной среде Белгородской ГСХА росли в форме облаковидных колоний. При проведении фазово-контрастной микроскопии, в поле зрения наблюдали микроструктурные элементы разной оптической плотности в виде сферобластических аморфных масс.
Эти сведения о выделяемости L-форм микобактерий совпадают по своей значимости с данными Быкова С.Ю., 1994; Гертман М.И., 1988; Дорожковой И.Р., 1982; Коваленко A.M. и соавт., 2012; Кузьмина В.А. и соавт., 2012; Тарасовой Е.В. и соавт., 2012.
Особую значимость в системе мер борьбы с туберкулезом придается дезинфекции помещений и скотных дворов. В настоящее время для дезинфекции животноводческих помещений, наряду с известными средствами, предлагается целый ряд новых, качественно улучшенных дезинфектантов (Аржаков В.Н., 2002, с соавт., 2004; Березнев А.П. с соавт., 1990,1994; Борознов С.Л. с соавт., 2006; Бутко М.П. с соавт., 2003; Высоцкий А.Э. с соавт., 2006 и др.). Выбор того или иного дезинфектанта определяется не только рекомендациями производителей. Большое значение имеют результаты независимых экспертиз, в том числе научно-производственных испытаний. Именно этот аспект был запланирован в нашем диссертационном исследовании. В своих исследованиях мы использовали растворы анолитов, с различным рН и содержанием хлорноватистых соединений. Растворы готовили с использованием прибора «АКВА-ЭХА» "Изумруд" г. Санкт-Петербург.
Наиболее устойчивые показатели бактерицидности, наблюдались у растворов полученных при силе тока 10А с содержанием активного хлора 250 мг/л и рН 6-7, 12А с содержанием активного хлора 400 мг/л и рН 6±0,5 и 9А имеющим в своем составе содержание активного хлора 300 мг/л и рН 5, обеспечивающих отсутствие роста микобактерий туберкулеза на среде Левенштейна-Иенсена в течение 3-х месяцев после посева. Дезинфицирующие средства, на основе пергидроля и хлорсодержащих компонентов "Хлорантоин" и "Кристалл-1000", уступали по своему бактерицидному действию. Об этом свидетельствовал рост культур M.bovis. Бактерицидное действие электрохимических растворов обусловлено низкой минерализацией анолита АНК, его повышенной гидратационной способностью, что способствует увеличению проницаемости клеточных стенок и мембран, создаёт условия для интенсивного осмотического и электроосмотического переноса оксидантов во внутриклеточную среду. Осмотический перенос оксидантов через оболочки и мембраны микробных клеток намного интенсивнее проявляется, чем через мембраны соматических клеток, ввиду существенного различия осмотического градиента этих клеток. Ускоренному электроосмотическому переносу оксидантов внутрь бактериальных клеток способствуют многочисленные электрически заряженные микропузырьки электролизных газов, создающие в зонах контакта с биополимерами мощные локальные электрические поля с высокой степенью неоднородности. По всей видимости электрохимические растворы №1, №2, №3, обладают наиболее приемлемыми бактерицидными свойствами. По всей видимости, это связано с постоянным рН, в пределах от 5 до 7. Для проведения исследований по изучению дезинфицирующих средств, препаратов анолитного ряда необходимо было изучить микобактериальную обсемененность животноводческих ферм и прилегающей территории
В неблагополучном по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйстве из объектов внешней среды (кормушки, стены, из поилок, и прилегающий к ним территории, поверхностные слои почвы, навоза) из 180 проб было выделено: 30 культур микобактерий, 21 проба отобрана внутри животноводческих помещений и 9 культур из прилегающих к животноводческим помещениям территорий. Из них 9 классифицированы как M.bovis, 8-M.fortuitum, 4-M.scrofulaceum; 7-M.marinum, 2-скотохромогенные.
Данные о сенсибилизации различных видов микобактерий в неблагополучных хозяйствах в т.ч. и атипичных подтверждаются исследованиями Кассич Ю.Я. и соавт., (1998), Овдиенко Н.П. и соавт., (1999), Найманова А.Х. и соавт., (2014). Экспериментально и в условиях неблагополучного по туберкулезу хозяйства нами были протестированы бактерицидные свойства анолитных растворов. Анолитные растворы получены при силе тока от 9 до 12А с нейтральным рН 5-7 и содержанием активного хлора 250-400 мг/л. В ходе исследований было установлено, что они обладают высокими бактерицидными свойствами, обеспечивающими инактивацию патогенных и непатогенных форм микобактерий, как возбудителей туберкулеза. Рост культур микобактерий, где применяли 3% NaOH и проводили бактериологический контроль дезинфекции смывов через 30 минут, по всей видимости, связан не только с высокой гигроскопичностью горячих растворов NaOH, но и со слабой проникающей способностью в глубокие слои деревянных поверхностей помещений. Это подтверждалось результатами бактериологических исследований смывов через 1, 3, 5 и 12 часов. Отсутствие роста микобактерий из исследуемых смывов через 3, 5 и 12 часов связано с полным и глубоким проникновением дезинфицирующего раствора и инактивацией микобактерий. В целом, по результатам при изучении эффективности новых антисептических средств в условиях неблагополучного по туберкулезу крупного рогатого скота хозяйства, было установлено, что наиболее приемлемыми и экологически безопасными являются пергидроль-хлорноватистые соединения, которые обладают высокими бактерицидными свойствами в отношении микобактерий туберкулеза.
