Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы
2.1. Антигенная структура микобактерий 15
2.2. Иммунитет при туберкулезе 24
2.3. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота 30
2.3.1. Аллергическая диагностика и неспецифические реакции на туберкулин 34
2.3.2. Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота иммуноферментным методом 43
2.3.3. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза
2.4. Антигенная структура вируса лейкоза крупного рогатого скота 53
2.5. Диагностика, профилактика и меры борьбы лейкозом крупного рогатого скота 61
2.5.1. Иммуноферментный анализ и полимеразная цепная реакция в диагностике лейкоза 65
3. Собственные исследования 68
3.1. Материалы и методы исследования 68
4. Результаты собственных исследований 76
4.1. Микобактериальные антигены и их свойства 76
4.1.1. Электрофоретическая подвижность и характеристика антигенных компонен гов микобактерий 78
4.1.2. Иммуноблот анализ сероактивных компонентов микобактериальных антигенов 83
4.1.3. Антигенные свойства ППД туберкулинов и ДМСО-антигенов 86
4.2. Иммуноферментный анализ для выявления микобактериальных антигенов в патологическом материале 98
4.2.1. Имму но сорбенти ая очистка иммунных сывороток 98
4.2.2. Тест — система иммунофернментная для типизации микобактерий в патологическом материале 104
4.3. Иммуноферментный анализ для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота 110
4.3.1. Дифференциальная диагностика туберкулеза крупного
рогатого скота методом иммуноферментного анализа 128
4.4. Диагностическая ценность ИФА и ПНР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота 135
4.5. Иммуноферментный анализ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота 143
4.5.1. Диагностическая ценность ИФА для выявления антител в сыворотоке крови и молоке при лейкозе крупного рогатого скота 143
4.5.2. Диагностическое значение иммунных комплексов при лейкозе крупного рогатого скота 146
4.6. Диагностическая ценность ПЦР для выявления провирусной ДНКВЛКРС в молоке 158
4.7. Динамика изменения титров антител против антигена инфицированных ВЛКРС животных 161
4.8. Динамика антителогенеза у крупного рогатого скота к различным структурным компонентам вируса лейкоза 165
5. Обсуждение результатов 172
6. Заключение 227
7. Выводы 236
8. Практические предложения 239
9. Литература
- Аллергическая диагностика и неспецифические реакции на туберкулин
- Антигенная структура вируса лейкоза крупного рогатого скота
- Электрофоретическая подвижность и характеристика антигенных компонен гов микобактерий
- Иммуноферментный анализ для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота
Введение к работе
Актуальность. Туберкулез и лейкоз крупного рогатого скота наиболее распространенные хронические инфекции в животноводстве и представляют собой важные проблемы не только ветеринарной медицины, животноводства, но биологии и экологии в целом и имеющие непосредственное отношение к безопасности здоровья человека. На современном этапе борьбы с туберкулёзом и лейкозом животных, основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остаётся своевременная и точная диагностика этих инфекций.
Огромный вклад в изучение эпизоотологии, диагностики и ликвидации туберкулеза сельскохозяйственных животных внесли такие ученые как М.Н.Верещагин (1926), П.П.Вишневский (1935), М.К.Юсковец (1963), О.В.Мартма (1971), В.П.Урбан (1980), М.А.Сафин (1980), Д.Д.Новак (1984), Н.М.Колычев (1992), А.С.Донченко (1993, 1995), В.Г.Ощепков (2001), Н.А.Донченко (2008), А.Х.Найманов (2009) и другие.
Диагноз на туберкулез ставят комплексным методом на основе эпизоотологических, клинических, аллергических, патологоанатомических и лабораторных исследований. Однако не возможно выделить какой-либо один метод диагностики туберкулеза, имеющий значительные преимущества перед другими, скорее они могут взаимодополнять друг друга и поэтому имеют право на существование (С.И.Татьков и др.,2006; В.А.Сазонов и др. 1996). По мнению А.М.Лысенко (1987), Е.В.Маслова (1986), Armbrust А. (1988) и др., для диагностики туберкулеза животных наиболее перспективен иммуноферментный анализ, который позволяет ставить диагноз на туберкулез в лабораторных условиях одновременно у большого количества животных, прост в применении и обладает высокой чувствительностью и специфичностью. В связи с этим, получение и изучение антигенных и иммуногенных характеристик микобактериальных антигенов, специфических антител, возможностей их использования для диагностики туберкулеза, дифференциации неспецифических реакций животных на туберкулин в иммунохимических реакциях являются актуальной задачей для ветеринарной практики в плане повышения эффективности диагностики, индикации и идентификации возбудителей туберкулеза крупного рогатого скота.
Определение современными методами уровня и спектра противотуберкулезных антител далеко не исчерпало себя в качестве средства иммунодиагностики и характеристики особенностей течения туберкулеза, а сами противотуберкулезные антитела не достаточно используются для характеристики микобактериальных антигенов, приготовления диагностикумов и других целей (Л.Н.Черноусова и др., 1995, 2000). Разработка экспресс-методов индикации и идентификации возбудителя туберкулеза из биоматериала животных и дифференциации патогенных микобактерий от атипичных остается актуальной задачей научных исследований (А.Н.Шаров и др., 2000, 2003; М.С.Калмыкова, 2007). Более преспективной в этом отношении, наряду с методами иммуноферментного анализа, является полимеразная цепная реакция (ПЦР). В настоящее время, в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота и идентификации микобактерий, интенсивно разрабатываются различные подходы по применению ПЦР и других приемов генодиагностики (С.Н.Радюк, Г.Р.Мацевич, 1997; Е.Б.Вишневская, 1998; А.Н.Шаров, В.А.Седов, 1998; А.М.Алимов, 1999; А.Х.Найманов и др., 2004; Н.А.Донченко, 2008 и др.).
В структуре инфекционной патологии лейкоз крупного рогатого скота в РФ занимает лидирующее место и составляет более 50% от других нозологий (М.И.Гулюкин, 2003; А.М.Смирнов, 2005). Широкая распространенность лейкоза крупного рогатого скота, отсутствие средств терапии и специфической профилактики определяют актуальность научных исследований по этой проблеме (Г.А.Симонян, 1975; В.А.Бусол, 1983; М.И.Гулюкин, 2003; Л.Г.Бурба, А.Ф.Валихов, 1985; В.М.Нахамсон, 1986; П.Н.Смирнов, 1986; И.М.Донник, 1999; В.В.Храмцов, М.А.Амироков, 2005; А.М.Алимов, 2010).
Одним из приоритетных направлений исследований по изучению особенностей и закономерностей инфекционного процесса лейкоза крупного рогатого скота является разработка высокочувствительных методов прижизненной диагностики болезни (В.А.Бусол, 1997; Р.В; О.А.Верховский и др., 2002; М.И.Гулюкин, В.А.Храмцов, А.С, Донченко и др., 2002; В.И.Околелов и др., 2003; П.Н.Смирнов, 2008; М.И.Гулюкин, 2008; И.М.Донник и др., 2009).
В настоящее время, согласно стандартам МЭБ, узаконенными методами диагностики лейкоза крупного рогатого скота являются реакция иммунодиффузии в геле агара и метод иммуноферментного анализа.
Важным преимуществом иммуноферментных методов, наряду с более высокой чувствительностью и специфичностью, является то, что ИФА позволяет выявлять специфические антитела в пробах сборного молока. Если учесть доступность и простоту выполнения, то ИФА для выявления специфических антител в пробах молока может стать важнейшим элементом в системе противолейкозных мероприятий в хозяйствах (Nguyen V.K., Maes R.F., 1992; Sargeant J.M., Kelton D.F et al., 1997).
Весьма актуальной задачей является изучение иммунологических аспектов патогенеза лейкоза крупного рогатого скота. Определение динамики образования и спектра антител, идентификация и изучение состава иммунных комплексов способствуют расшифровке молекулярно-клеточных механизмов взаимодействия вируса лейкоза с макроорганизмом и объяснению особенностей патогенеза.
Результаты подобных исследований явятся основой для разработки новых высокоспецифичных и ранних методов выявления инфицированности животных возбудителями туберкулеза и лейкоза, а также для создания более надежной системы мер борьбы с этими опасными инфекционными болезнями.
Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось усовершенствование иммунохимических и молекулярно-генетических методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, а также средств индикации и идентификации возбудителей этих инфекций. В соответствии с целью решались следующие задачи:
- изучить антигенную структуру микобактерий и усовершенствовать способы получения антигенных препаратов;
- изыскать способы получения высокоспецифичных антигенов микобактерий и антител, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, и дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин методом ИФА;
- определить эффективность иммуноферментного анализа для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;
- определить диагностическую ценность ИФА и ПЦР в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота;
- изучить динамику образования специфических антител и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота;
- разработать ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке, и определить его диагностическую ценность;
- изучить динамики антителогенеза у крупного рогатого скота к различным структурным компонентам вируса лейкоза;
Научная новизна. Иммунохимическими и биохимическими методами изучена антигенная структура микобактерий и разработаны способы получения высокоспецифичных антигенов из инактивированных культур и антител к ним, обеспечивающих индикацию и идентификацию микобактерий в патологическом материале, дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин. Установлено, что особенности антителогенеза, диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе являются важными факторами повышения эффективности диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Впервые разработан способ получения антигенов микобактерий, обеспечивающих дифференциальную диагностику туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа («Способ получения антигена для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота» – положительное решение о выдаче патента РФ на изобретение от 12.08.2010г., заявка №2009112145).
Показана высокая информативность разработанного ИФА для выяснения эпизоотической ситуации хозяйств по туберкулезу крупного рогатого скота.
Разработана технология повышения специфичности иммунных сывороток к микобактериальным антигенам, обеспечивающая индикацию и дифференциацию микобактерий в патологическом материале методом иммуноферментного анализа («Белково-глутаральдегидный метод очистки иммунной сыворотки против M.bovis» – рационализаторское предложение №314-91 от 5.03.1991).
Разработан ИФА для выявления специфических антител к ВЛКРС в сыворотке крови и молоке с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов в пробах («Способ диагностики лейкоза крупного рогатого скота» – заявка на патент РФ №2010100016, приоритетная справка от 11.02.2010г.) и определена его диагностическая ценность. Установлено, что иммуноферментный анализ с предварительной диссоциацией иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке увеличивает выявляемость инфицированных ВЛКРС животных на 20%.
Впервые изучена динамика образования и спектр свободных антител и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке коров инфицированных ВЛКРС в естественных условиях. Установлено, что при уменьшении титров свободных антител в сыворотке крови повышается уровень циркулирующих иммунных комплексов. На разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота спектр антител меняется. Данные факты свидетельствует о том, что разовые серологические тесты, основанные на выявление антител против только одного антигена, в диагностике лейкоза могут быть не эффективными.
Впервые методом полимеразной цепной реакции доказано присутствие в составе циркулирующих иммунных комплексов провирусной ДНК ВЛКРС, что расширяет представления о патогенезе инфекции и способствует дальнейшему совершенствованию методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Практическая значимость работы. Разработанный способ выделения специфических микобактериальных антигенов повышает эффективность прижизненной дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота иммунологическими методами.
«Набор препаратов для выявления антител к возбудителю туберкулеза крупного рогатого скота методом ИФА» и «Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий в патологическом материале» позволяют выяснить эпизоотическую ситуацию по туберкулезу в хозяйствах, и рекомендуются для включения в комплексную систему мероприятий по борьбе с туберкулезом крупного рогатого скота.
Разработанный иммуноблот анализ микобактериальных антигенов позволяет идентифицировать микобактерии и может быть использован в качестве дополнительного теста для диагностики туберкулеза.
Для повышения выявления инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота целесообразно проводить ИФА с предварительной диссоциацией циркулирующих иммунных комплексов. Разработанный метод ИФА с предварительной диссоциацией ЦИК в исследуемых пробах открывает широкие перспективы для диагностики данной инфекции методом иммуноферментного анализа молока.
Результаты научных исследований успешно апробированы и внедрены в хозяйствах Буинского, Дрожжановского, Зеленодольского, Черемшанского, Тюлячинского, Нижнекамского, Высокогорского, Арского и др. районов РТ. По результатам исследований подготовлены методические рекомендации, направленные на усовершенствование методов диагностики туберкулеза и лейкоза крупного рогатого скота, утвержденные НТС КГАВМ, ГУВ КМ РТ:
«Тест-система иммуноферментная для выявления специфических антител против микобактерий» - утверждены НТС КВИ, протокол №5 от 22.05.92г.
«Тест-система иммуноферментная для типизации микобактерий» - утверждены НТС КВИ, протокол №5 от 22.05.92г.
Методические рекомендации по диагностике лейкоза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа сыворотки крови и молока, утвержденные НТС ГУВ КМ РТ, протокол №1 от 21.01.2008г.
Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 2 от 4.06.2009. и НТС ГУВ КМ РТ, протокол № 3 от 8.10.2010г.
Методические рекомендации по применению микобактериальных антигенов в ИФА для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота, утвержденные НТС ФГОУ ВПО «КГАВМ», протокол № 5 от 15.12.10г. и НТС ГУВ КМ РТ, протокол № 4 от 20.12.2010г.
Методические рекомендации по оценке благополучия хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа и по применению микобактериальных антигенов в ИФА для дифференциации неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота представлены в Федеральную службу по ветеринарному и фитосанитарному надзору МСХ РФ для утверждения в установленном порядке.
Апрбация работы. Результаты диссертационной работы доложены и одобрены на республиканских и Всероссийских научно-производственных конференциях по актуальным проблемам агропромышленного комплекса (Казань, 1989, 1990, 1991, 1993, 1999, 2004, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010); Всесоюзной научно-технической конференции «Современные проблемы иммунологии, биотехнологии, генной и клеточной инженерии в ветеринарной медицине» (Н.Новгород, 1990); межвузовской научно-производственной конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс с/х производства» (Ставрополь, 1991); международной научной конференции посвященной 125-летию КГАВМ (Казань, 1998); международной научной конференции «Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе» (Москва, 1999); международной научно-производственной конференции посвященной 100-летию членкора ВАСХНИИЛ В.Т.Котова (Воронеж, 1999); республиканских научно-производственных конференциях молодых ученых и специалистов (Казань, 1998, 2000); международной научной конференции посвященной 70-летию зооинженерного факультета КГАВМ (Казань, 2000); международной научной конференции «Энтузиазм и творчество студентов в развитии науки» (Троицк, 2000); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007); Международной научно-производственной конференции «Достижения супрамолекулярной химии и биохимии в ветеринарии и зоотехнии» (Москва, 2008); II-м съезде биохимического общества РАН (Москва, 1997); IV-м съезде Российского общества биохимии и молекулярной биологии (Новосибирск, 2008). Международной научно-практической конференции посвященной 90-летию кафедры биологической и органической химии СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2009).
Публикация результатов исследований. Основные результаты исследований, выполненные по теме диссертации, опубликованы в 42 печатных работах, в том числе в 10 изданиях, рекомендованных ВАК, таких как «Ветеринарный врач», «Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии», «Ученые записки КГАВМ».
Основные положения, выносимые на защиту:
- изучением антигенной структуры микобактерий получены высокоспецифичные антигены и антитела для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа.
- полимеразная цепная реакция и иммуноферментный анализ на основе очищенных антигенов и антител повышают эффективность диагностики туберкулеза и лейкоза, обеспечивают дифференциацию неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота, а также индикацию и типизацию микобактерий в патологическом материале.
- инфекционный процесс при лейкозе крупного рогатого скота сопровождается синтезом антител к различным компонентам вируса, уровень которых варьирует в зависимости от стадии болезни.
- диссоциация циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови и молоке, обнаружение провирусной ДНК в их составе повышают эффективность диагностики лейкоза крупного рогатого скота.
Объём и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 296 страницах стандартного компьютерного набора, содержит 41 таблицу и 23 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, заключения и выводов, предложений производству, списка литературы и приложений.
Библиографический список использованной литературы включает 394 источников, в том числе 180 на иностранных языках. Прилагаются акты производственных и комиссионных испытаний, акты внедрения, патенты на изобретение, методические рекомендации и другие документы, подтверждающие результаты исследований, их научно-практическую ценность.
Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: д.б.н. В.П.Коксин, к.б.н. К.С.Хаертдинов, к.в.н. Усольцев, к.б.н. Зиннатов Ф.Ф.
Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи научному консультанту д.в.н., профессору А.М.Алимову, д.в.н., профессору кафедры биохимии КГАВМ Н.З.Хазипову, ректору ФГОУ ВПО КГАВМ, д.в.н., профессору Г.Ф.Кабирову.
Аллергическая диагностика и неспецифические реакции на туберкулин
В процессе роста культуры возбудителя туберкулеза проходят различные фазы развития. Полиморфизм является одной из его особенностей. Установлена способность микобактерий в определенных условиях превращаться в L-форму (А.Г.Хоменко, В.В.Ерохин, 1982; А.М.Кадочкин, Н.А.Иванова, 1983).
Изучение морфологии тонкого строения и биохимических особенностей микобактерий туберкулеза с помощью современных методов исследования позволили определить новый цикл развития возбудителя туберкулеза (В.В.Власенко, 1999). Согласно этой теории цикл развития М.tuberculosis состоит из нескольких стадий: 1- стадия артроспоры, 2-стадия деления, 3-стадия дробления, 4-стадия полового процесса, 5-стадия почкования. Каждая стадия сопровождается изменениями в химическом составе и соответственно, изменениями в антигенной структуре клеток. Эти данные открывают новые возможности в усовершенствовании диагностики, лечения и профилактики туберкулеза человека и животных.
Электронной микроскопией установлено, что микобактериальная клетка имеет тонкую, состоящую из трех слоев стенку, в которых определяются пептидогликолипиды и липополисахариды. Наиболее важным для сохранения жизнеспособности компонентом являются сшитые между собой молекулы пептидогликана, обладающие высокой механической прочностью, которая обусловлена межмолекулярными связями пептидолгико-липидной цепи микобактерий как внутри слоя, так и между слоями клеточной стенки.
В клеточной стенке находятся видоспецифические антигены. Принято считать, что оболочки микобактериальных клеток индуцируют в макроорганизме антителообразование. Они являются полными антигенами (по-лисахаридо-липидный комплекс) (М.М.Авербах, 1976).
Химический состав микобактерий туберкулеза сложен и своеобразен. В него входят вода, белки, углеводы, липиды и соли. При развитии туберкулезного процесса различные компоненты микробной клетки могут действовать как самостоятельно, так и совместно. Нельзя исключить возможность того, что одни из них несут защитные свойства, другие участвуют в развитии в организме повышенной чувствительности замедленного типа, третьи индуцируют антителообразование (Н.З.Хазипов и др., 2000).
Наиболее характерным для химического состава микобактерий туберкулеза является значительное КОЛРЇЧЄСТВО липидов, составляющих от 10 до 45% их веса (M.B.Goren, P.Bronnan, 1976; Л.М.Пинчук и др., 1982; M.Zieba, 2006). Липиды микобактерий своеобразны по химическому составу. Они содержат в значительных количествах группы соединений, отсутствующие у других микроорганизмов, например, некоторые фосфоли-пиды, необычные гликолипиды, пептидолипиды, пептидогликолипиды, миколовые кислоты и другие, которые в значительных количествах локализуются в клеточной стенке, обеспечивая её особую структуру, а также присутствуя в свободном состоянии (G.R.Gray et al.,1982; Т.В.Коронели, 1984).
Свободные липиды клеточной стенки микобактерий представлены миколовыми кислотами, гликолипидами (корд-фактор и другие трегалозы), пептидолипидами, пептидогликолипидами («воск Д», микозиды), фосфатидилинозитманнозидами. После удаления свободных липидов остается слой клеточной стенки, который состоит на 35-40% из связанных липидов (главным образом, миколовых кислот), 33-40% - Сахаров (арабиноза, галактоза), 7-8%о - аминосахаров и аминокислот. Этот основной слой клеточной стенки состоит из двух ковалентно связанных полимеров: пептидогли-кана и миколатарабиногалактана.
Средний слой клеточной стенки — липополисахарид-липидбелковый комплекс, который представляет собой протеиназаустойчивую мембрану, покрытую сетью липополисахаридных фибрилл, и содержит слой свободных липидов. Его полисахаридная часть содержит маннозу, глюкозу, галактозу и арабинозу.
Внутренний слой содержит липополисахарид-мукопептидный комплекс, с прикрепленными к нему фибриллами миколовых кислот с полисахаридами.
Таким образом, клеточная стенка микобактерии представляет собой мощное липофильное образование, подобно которому не обнаружено пока среди других бактерий. Именно это определяет специфику свойств микобактерии туберкулеза (Н.З.Хазипов и др., 2000).
В цитоплазме клетки различают гранулы, микрогранулы и вакуоли. Считают, что гранулы - это нуклеоид (ядро микобактерии, содержащее двухцепочечную ДНК хромосомы, замкнутую в кольцо). Кроме того, в цитоплазме имеются плазмиды, содержащие двухцепочечную ДИК, - образования, определяющие многие свойства бактерии (Р.В.Тузова, 1983).
Изучение структуры микобактерии и функций её компонентов позволяют оценивать специфичность антигенных субстанций, используемых при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота; определить белки клеточной стенки микобактерии, ответственных за индукцию протектив-ного иммунитета и стимуляцию специфической гиперчувствительности замедленного типа. Химический состав антигенов возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота, способность их вызывать образование различных антител, интерферона является предметом изучения многих исследователей. Изучается культуральный фильтрат и сами клетки. По данным Gupta V.K. и др. (1994) культуральные фильтраты вакцинного штамма БЦЖ при гель-фильтрации дают 4 основных фракций. Из них вторая фракция показывает наибольшую антигенную активность в реакциях иммуноферментного анализа, а также развивает гиперчувствительность у морских свинок.
Антигенная структура вируса лейкоза крупного рогатого скота
Автоклавированные культуры микобактерий М. bovis, M.avium, M.nonchromogenes, M.scotochromogenes получены из Курской биофабрики. В опытах был использован штамм M.bovis BCG - коммерческий, производство ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь).
Иммуноферментный анализ ставили по стандартной методике в твердофазном неконкурентном варианте. Использовали микротитрацион-ные планшеты для иммунологических реакций, изготовленные ВНИИ и МТ (г.Москва), а также планшеты полистироловые для иммуноферментно-го анализа производства «Медполимер» (г.Санкт-Петербург).
Коньюгат. Использовали антитела диагностические против иммуноглобулинов крупного рогатого скота, меченные пероксидазой, изготовленные МТО «Инициатива», прикладная биохимическая лаборатория г.Щелково, антитела диагностические против IgG кролика, быка меченые пероксидазой, выпускаемые ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН (филиал «Медгамал»), Anti-Bovine IgG-Peroxidase, antibody produced in rabbit - производства фирмы «Сигма».
Иммуноферментный анализ для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, а также для изучения антигенной общности ВЛКРС и ВИЧ, проводили с использованием «Набора для выявления антител к вирусу лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС)» производства НПО «Нарвак», и «Тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусам иммунодефицита человека 1 и 2 типов» производства ЗАО «Вектор-бест». Учет результатов реакции проводили согласно инструкции диагностического набора.
Для проведения полимеразной цепной реакции (ПНР) использовали коммерческие тест-системы:
Изучение спектра антител в исследуемых пробах сывороток крови коров проводили методом иммуноблот анализа. Иммуноблотинг проводили на тест-системе "New LAV BLOT" фирмы Bio Rad (США). Денситомет-рию результатов иммуноблоттинга проводили в отраженном свете на сканере "Sharp Іх-330". В анализе денситограмм была использована программа "Image Master ID Prime" фирмы "Pharmacia Biotech.
Получение микобактериальных антигенов. Автоклавированную микобактериальную массу отмывали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 15 мин 5 раз в физиологическом растворе. Для удаления свободных липидов, микробные клетки дважды обрабатывали ацетоном в соотношении 1:2, помещая их в термостат при 37С на 1,5 часа и периодически перемешивая. По истечении этого времени, методом центрифугирования при 5000 об/мин в течение 15 мин, микробные клетки отделяли и подсушивали на воздухе. Обработанные ацетоном микробные клетки заливали раствором диметилсульфоксида (ДМСО) подогретым до 37 С, из расчета 6 мл на 1г бактерий и встряхивали в течение 30 мин при 37С, после чего микробные клетки отделяли центрифугированием в том же режиме. Экстракт диализировали против 0,01 М карбонатного буфера (рН 9,6) в течение двух суток. Диализат использовали в качестве антигена в дальнейших исследованиях (ДМСО-антиген).
Электрофоретическое фракционирование антигенов. Диск-электрофорез антигенов проводили по методу Laemli (1970) в пластинчатом полиакриламидном геле с использованием детергента додецилсульфа-та натрия и восстановителя разрыва по S-S связям - 3 мекркаптоэтанола.
Раствор, содержащий акриламид и бисакриламид в соотношении 30:0,8, служил исходным для приготовления концентрирующего и разделяющего гелей. В конечной концентрации разделяющий гель содержал 0,375М трис-HCL буфер (рН 8,8), 0,1% ДСН. Концентрирующий 3% гель -0,125М трис-HCL буфер (рН 6,8), 0,1% ДСН. Катализаторами полимеризации служили аммоний надсернокислый и тетраметилэтилен-диамин (ТЕМЕД). Пробы растворяли в буфере для концентрирующего геля, к которому добавляли 12,5% глицерина, 1,25% ДСН и 1,25% 3- мер-каптоэтанола. Перед электрофорезом их прогревали в течение 5 минут в іводяной бане при 100С. В качестве лидирующего красителя использовали бромфеноловый синий, конечная концентрация которого в пробах составляла 0,001%. Электрофорез проводили при комнатной температуре.
Фракционированный в гелях материал фиксировали в водном растворе, содержащем 20% метилового спирта и 7% уксусной кислоты; окрашивали раствором Кумасси ярко-голубым G-250 (R.Lamb, et al., 1976) и 1 азотнокислым серебром (C.M.Tsai, 1986).
Молекулярные массы белков, содержащихся в антигенных препаратах, определяли в соответствии с разгонкой белковых стандартов (Broad range - изготовитель Сигма и био-Рад) по логарифмической кривой длины пробега маркеров по K.Weber, M.Osborn (1969) и Н.М.Филлипович (1978), а также инструментально при помощи оптического сканирования и денси-тометрирования с дальнейшей компьютерной обработкой данных с использованием программы Image master.
Электрофоретическая подвижность и характеристика антигенных компонен гов микобактерий
По результатам, представленным в графике, видно, что для M.bovis наиболее специфичной является 25-я фракция; M.scotochromogenes - 31-я; M.nonchromogenes - 38-я; M.avium - 46-я;
В ветеринарной практике явление так называемой сенсибилизации вносит большие трудности в дифференциацию реакций на ППД-туберкулин, вызванных не микобактериями бычьего типа. Причина этого установлена и многократно подтверждена наличием родственных, аналогичных для различных типов, видов популяций микобактерий, антигенных структур. Идентичность геномных последовательностей M.bovis и M.tuberculosis составляет 99,95%. Главное отличие между ними в генах отвечающих за некоторые белки клеточных стенок и секретируемые белки (T.Garnier, K.Eiglmeier et all, 2003).
Если учесть, что ППД-туберкулины представляют собой культу-ральные белки, то сравнительное изучение иммуногенности фракций ДМСО-антигенов и ППД-туберкулинов представляют собой определенный практический интерес.
Изучение возможностей использования ППД-туберкулина для получения специфического антигена в дифференциальной диагностике туберкулеза крупного рогатого скота методами ИФА имеет большое значение.
В работе использовали туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих (серия №33), туберкулин сухой ППД для птиц (серия №30) изготовленные Курской биофабрикой и ДМСО-антиген M.bovis. В результате проведенных работ выявлены 21 фракция ППД-туберкулина для млекопитающих, 23 фракции ППД-туберкулина для птиц и 20 фракций ДМСО-антигена. Концентрацию белка в полученных образцах определяли спектрофотометрически при длине волны света 280 нм. Концентрация белка в исходных пробах составила около 16 мг/мл. Предварительно пробы были концентрированы против силикагеля L —100/250 для хроматографии.
Согласно методике Граната и Флодина, составляя калибровочную кривую по результатам гельфильтрации белков с известными молекулярными массами ((3-амилаза — 150 кД, белок А — 40кД, цитохром с — 12,3 кД), были определены молекулярные массы отдельных фракций, что составило: для фракций ДМСО - антигена от 10 до 100 кД; ППД-туберкулина для млекопитающих - от 4 до 55 кД и для ППД-туберкулина для птиц - от 4 до 60 кД.
Методом непрямого твердофазного ИФА были изучены антигенные свойства и определена специфичность каждой фракции. Учет результатов анализа проводили спектрофотометрически при длине волны 492 нм. Коэффициент специфичности рассчитывали при титре специфических антител 1:200. Каждую антигенную фракцию исследовали против антисывороток полученных на клетки M.bovis, ДМСО-антиген, ППД-туберкулин для млекопитающих и птиц.
В результате проведенного анализа выявлено, что наибольшей специфичностью обладают фракция №16 ДМСО-антигена M.bovis, фракции №14 и 15 ППД-туберкулина для млекопитающих и фракция №18 ППД-туберкулина для птиц. Коэффициенты специфичности (К) этих фракций со специфическими антителами составили от 3,5 до 3,8 и показывали перекрестные реакции с К не более 2. Молекулярные массы у них составляет около 15 кД, т.е. они представляют собой низкомолекулярные белки, полипептиды. В зарубежной и отечественной литературе также встречаются данные о высокой специфичности низкомолекулярных микобактериаль-ных антигенов (A.L.Sorensen et al., 1999; В.В.Власенко, 1999).
Фракции с высокой концентрацией белка - №4 ДМСО-антигена, №6 ППД для млекопитающих и №9 ППД для птиц высокой специфичностью не обладали. Видимо, они представляют собой балластные белковые фракции изученных антигенов.
На основании результатов исследования можно заключить, что гель - хроматография по вышеизложенной схеме позволяет избавиться от балластных белков и выделить специфичные, иммуногенные фракции антигенов. Полученные специфичные фракции 1И1 Д-туберкулинов могут быть использованы в дифференциальной диагностике туберкулеза животных.
На втором этапе данной работы изучали антигенные свойства тубер-кулинов, путем иммунизации животных.
Оптимальный способ получения иммунных сывороток зависит от природы антигена, вида подопытного животного и цели, которой будет служить антисыворотка. В качестве продуцентов антисывороток использовали кроликов. Существуют различные схемы иммунизации кроликов. Метод описанный N.Harboe, AJngild (1977), на наш взгляд, является более доступным и простым при получении кроличьих сывороток и успешно был нами применен более ранних исследованиях. Были получены иммунные сыворотки против клеток M.BOvis, ППД-туберкулина для млекопитающих и ППД-туберкулина для птиц. Титры антител и специфичность иммунных сывороток определяли непрямым твердофазным методом ИФА. Результаты изучения специфичности антисывороток представлены в таблице 6.
Наивысшие титры антител получены при иммунизации кроликов целыми клетками M.Bovis и несколько ниже - при иммунизации ППД-туберкулином для млекопитающих, которые составляли от 1:16000 до 1:20000.
Иммуноферментный анализ для выявления специфических антител при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота
Ретровирусы, к семейству которых относится ВЛКРС, характеризуются наличием разных форм генетического материала: РНК в вирусных частицах, провирусная ДНК в ядре и цитоплазме, РНК-транскрипты в клетке. У инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота в В-лимфоцитах синтезируются десятки и сотни (молекул провирусной ДНК, но только часть из них встраивается в геном клетки хозяина, а остальные выходят из клетки при её разрушении (В.А.Сергеев и др., 1983; Н.З.Хазипов и др., 2008).
Исследовали 136 проб молока коров положительно реагирующих в РИД из неблагополучных по лейкозу хозяйств РТ. Пробы молока получены от коров инфицированного ВЛКРС стада со стабильной гематологической картиной на разных стадиях развития инфекционного процесса. Выделили 3 условные группы проб: 1) пробы молока коров реагировавших в РИД впервые; 2) через год после первой реакции; 3) в более поздних сроках развития инфекции.
В иммуноферментном анализе с предварительной диссоциацией ЦИК все пробы молока были положительными. ПЦР ставили с использованием реактивов тест-системы «Лейкоз КРС-провирус» для диагностики лейкоза крупного рогатого скота, ФГУН ЦНИИЭ — фирмы АмплиСенс. Согласно временному наставлению по применению тест-системы, положительными считаются образцы, содержащие на электрофореграмме продуктов амплификации специфическую полосу на уровне 294 п.н.
ПЦР на обнаружение провируса в лейкоцитах содержащихся в молоке показала положительные результаты в 37 пробах (27%). В дальнейшем из этих проб молока были выделены иммунные комплексы и проведен ПЦР анализ. Результаты исследований показали, что в 12 из них содержится провирусная ДНК и 9 из них относится к пробам третий, 3 - второй группы.
Вирус лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС) может находиться в соматических клетках, содержащихся в молозиве и молоке естественно зараженных животных. Установлено, что вирус чувствителен к температурным воздействиям и разрушается при повторных замораживаниях и оттаиваниях. Пастеризация молока разрушает его, и он теряет инфекцион-ность. Полная инактивация вируса в молоке или вируссодержащей жидкости достигается при 50С в течение 70 секунд (В.Н.Сюрин и др., 1986).
Выявление провируснои ДНК служит важным фактором контаминации молока вирусом лейкоза крупного рогатого скота. Поэтому определяли влияния термической обработки молока на выявляемость провируснои ДНК ВЛКРС полимеразнои цепной реакцией.
Исследовали 36 проб молока от больных лейкозом коров из неблагополучных хозяйств РТ. ПЦР ставили на обнаружение провируснои ДНК в лейкоцитах и циркулирующих иммунных комплексах (ЦИК) в молоке.
Каждую пробу обезжиренного молока после тщательного перемешивания делили на 2 ровные части по 30 мл. Первую часть использовали для постановки ПЦР без предварительной обработки с ПЭГ.
Вторую часть обезжиренного молока использовали для выделения ЦИК. Полученный осадок иммунных комплексов растворяли в 1 мл физиологического раствора и также ставили реакцию полимеразнои цепной реакции.
В 10 пробах нативного молока (28%) и в 12 пробах выделенных из него ЦИК (33%) обнаружили провирусную ДНК ВЛКРС. В 7 пробах молока провирусная ДНК выявлена как в соматических клетках, так и в ЦИК. Для дальнейших исследований использовали эти пробы.
Во всех 7 пробах молока, подвергнутых пастеризации и в 5 пробах из 7 после 5 минутного кипячения, обнаруживали провирусную ДНК. Пробы молока, подвергнутые 10 минутному кипячению, были свободны от про-вирусной ДНК ВЛКРС. Однако, при исследовании поверхностных пленок, образовавшихся после кипячения этих проб, ПЦР-анализ показал положительные результаты.
Влияние генетического материала ВЛКРС, содержащегося в молоке, на организм человека мало изучено. Тем более мало известно о нативных свойствах провирусной ДНК после пастеризации и кипячения молока. Изучение структуры и свойств провирусной ДНК в молоке после термической обработки должно стать объектом дальнейших научных исследований для установления её инфекционности.
ВЛКРС обладает выраженной антигенной активностью. В организме крупного рогатого скота антитела вырабатываются преимущественно на структурные белки вириона. У зараженных животных в крови циркулируют антитела к р24, р15, р12, plO, gp30 и gp51. Однако диагностическое значение имеют антитела против gp51 и р24 ВЛКРС. В количественном соотношении они могут коррелировать со стадией инфекционного процесса (В.Н.Сюрин и др., 1998). В настоящее время большинство серологических реакций, применяемых в диагностике лейкоза крупного рогатого скота, направлены на выявление анти-gpSl антител.
В данной работе исследовали изменение титров антител против гли-копротеидного антигена gp51 в сыворотке крови и молоке коров инфицированных ВЛКРС. В опытной группе были 12 животных, из них 2 головы (№№ 5 и 6) гематологически больные, а остальные положительно реагирующие на лейкоз по РИД. Наблюдения велись в течение полугода. Титры антител в исследуемых пробах определялись методом иммуноферментного анализа через каждые два недели с использованием коммерческих тест-систем. Обобщенные результаты исследований представлены в таблице 37.
Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что изменения титров противолейкозных антител, в сыворотке крови естественно инфицированных ВЛКРС коров, значительно отличаются от показателей экспериментального заражения. По данным Л.А.Ивановой (2000), в случае экспериментального заражения алгоритм изменения титров антител равен трем месяцам, то при естественном заражении коров вирусом лейкоза, он оказался разным. За период исследования титры сывороточных антител в отдельных пробах оставались неизменными как в достаточно высоких, так и в относительно низких уровнях. Однако, в целом изменение титров антител в исследованных пробах происходили синусоидально.
