Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Антигенная структура микобактерий
1.2. Общие сведения об иммунной системе
1.3. Механизм приобретенного антибактериального иммунитета
1.4. Гиперчувствительность замедленного типа в противотуберкулезном иммунитете
1.5. Иммунопрофилактика в комплексе противотуберкулезных мероприятий .
1.6. Высокоиммуногенные комплексы на основе синтетических полиионов
1.7. Заключение к обзору литературы
2. Собственные исследования
2.1. Материалы и методы исследований
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Разработка новых способов повышения иммуномодулирующих свойств синтезируемых препаратов
2.2.1.1. Оценка синтезируемых препаратов на их способность восстанавли-вать у морских свинок иммунологическую реактивность .
2.2.1.2. Испытание иммунологической активности специфического имму-номодулятора микробного происхождения (КИМ-М2) на морских свинках
2.2.2. Производственное испытание специфического иммуномодулятора на крупном рогатом скоте
2.2.2.1. Иммунные реакции у молодняка крупного рогатого скота на введе-ние специфического иммуномодулятора КИМ-М2 .
2.2.2.2. Иммунные реакции у коров на введение специфического иммуномодулятора КИМ-М2
2.2.3. Разработка схемы специфической профилактики туберкулеза круп-ного рогатого скота с применением специфического иммуномодулирую-щего средства КИМ-М2 .
3. Обсуждение результатов исследования
4. Выводы
5. Практические предложения список литературы .
- Механизм приобретенного антибактериального иммунитета
- Высокоиммуногенные комплексы на основе синтетических полиионов
- Оценка синтезируемых препаратов на их способность восстанавли-вать у морских свинок иммунологическую реактивность
- Иммунные реакции у молодняка крупного рогатого скота на введе-ние специфического иммуномодулятора КИМ-М2
Введение к работе
Актуальность темы. Туберкулез продолжает оставаться одной из наиболее сложных проблем инфекционной патологии в большинстве стран мира, включая Российскую Федерацию. Значительный экономический ущерб, наносимый туберкулезной инфекцией, приводит к острой необходимости специфической защиты животных и охране здоровья людей (А.С. Донченко, 2004; Н.М. Колычев с соавт., 2007, 2010; Н.А. Донченко, 2008).
В настоящее время стоит задача сокращения в качестве вакцин цельных микробных клеток, введение которых хотя и оказывает высокий протективный эффект, но является далеко не безвредным. Вакцина БЦЖ, применяемая в настоящее время с целью профилактики туберкулеза, стимулирует одновременно естественную резистентность организма, а также используется для специфической патогенетической терапии больных туберкулезом легких. Стимулирующие свойства вакцины БЦЖ послужили основанием для приготовления из отдельных фракций разрушенной культуры БЦЖ иммуномодулирующих средств (А.Г. Хоменко с соавт., 1998; М.А. Бажин с соавт., 2003, 2010).
Открытие генов иммунного ответа и механизмов генетического контроля иммунного ответа определили необходимость фенотипической коррекции иммунного ответа, изыскание препаратов, способных перевести животных с генетически низкой реактивностью в высокореагирующие.
Создание вакцин особого типа с включением в них стимулирующего компонента открывает такую возможность. Для осуществления фенотипической коррекции разрабатываются комплексные антигены – такие искусственные макромолекулярные комплексы, в состав которых входят необходимые антигенные детерминанты, и стимулирующая (адъювантная) структура, обеспечивающая фенотипическую коррекцию. Необходимыми для этого свойствами обладают синтетические неприродные полиэлектролиты (Р.В. Петров, Р.М. Хаитов, 1976, 2011).
Следовательно, для более эффективного восстановления реактивности у животных можно использовать молекулярные препараты, позитивно воздействующие на систему иммунитета и не осложняющие контроль за туберкулезной инфекцией в стадах, которые могут быть созданы на основе конъюгации антигенов, выделенных из вакцинного штамма БЦЖ, с полимеразной матрицей. Включение таких препаратов в схему специфической профилактики туберкулеза животных является актуальным.
Степень разработанности проблемы. Принцип создания иммуногенов и вакцин путем химического соединения (конъюгирования) заданных антигенов с иммуностимулирующим полиэлектролитом теоретически обоснован и экспериментально разработан Р.В. Петровым, В.А. Кабановым, Р.М. Хаитовым и другими (1981) в ГНЦ РФ – Институт иммунологии федерального медико-биологического агентства. Приняв за основу этот принцип создания иммуногенов, учеными ВНИИБТЖ была разработана технология изготовления специфического (противотуберкулезного) иммуномодулирующего средства (М.А. Бажин с соавт., 2009; Е.М. Шулико, 2011), которая, как показали исследования, нуждается в дальнейшем усовершенствовании.
Цель и задачи исследования. Цель исследований состояла в разработке технологии изготовления специфического иммуномодулятора и оценке эффективности иммунных реакций на его введение у крупного рогатого скота в противотуберкулезном иммунитете.
Для достижения намеченной цели были определены следующие задачи:
- разработать технологию изготовления специфического иммуномодулирующего средства на основе антигенов микобактерий вакцинного штамма БЦЖ и полиэлектролитов;
- изучить на морских свинках иммуностимулирующие и протективные свойства иммуномодулятора, изготовленного на основе антигенного комплекса разрушенной культуры БЦЖ;
- изучить иммунные реакции у крупного рогатого скота разного возраста на введение специфического иммуномодулирующего средства;
- разработать схему специфической профилактики туберкулеза и микобактериозов крупного рогатого скота с применением специфического иммуномодулирующего средства.
Научная новизна. Разработана технологическая схема изготовления протективных специфических средств микробного происхождения из комплекса антигенов разрушенной культуры БЦЖ и полиэлектролитов. Установлено, что наиболее эффективным конъюгатом является составленный на основе комплекса антигенов разрушенной культуры БЦЖ, инкубированный с формалином, и конъюгированный с ПВП и ПЭГ в соотношении 1 мг/мл белка комплекса антигенов к 480 мг ПВП и 120 мг ПЭГ. Определены иммуномодулирующие и протективные свойства препарата на морских свинках и крупном рогатом скоте разного возраста.
Разработаны условия применения специфического иммуномодулятора микробного происхождения КИМ-М2 на крупном рогатом скоте и дана оценка иммунного статуса животных на основе взаимосвязей в системе иммунитета.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретически обоснована технология изготовления специфических экологически безопасных молекулярных препаратов и оценена эффективность иммунных реакций на их введение у крупного рогатого скота в противотуберкулезном иммунитете.
Материалы диссертации вошли в проект нормативно-технической документации на препарат, а также использованы для разработки методических рекомендаций по методам дифференциальной диагностики и профилактики туберкулеза и микобактериозов у крупного рогатого скота.
По результатам работы получен патент РФ на изобретение №2478399 от 10.04.2013 г. «Способ получения специфического иммуномодулятора».
Методология и методы исследования. Методологическая основа исследований – анализ и синтез информации по проблеме совершенствования и создания новых средств и методов иммунной защиты на основе применения молекулярных специфических препаратов, представленной в отечественных и зарубежных источниках литературы, а также полученной в экспериментальных условиях. Для достижения поставленной цели изготовлен специфический иммуномодулятор по измененной технологии и оценена степень его влияния на иммунный статус лабораторных животных и крупного рогатого скота разного возраста.
В работе использованы следующие методы исследований: аллергические, иммунологические, фотометрические, серологические, патологоанатомические, бактериологические и биометрические.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Технология изготовления специфического иммуномодулятора и степень его влияния на иммунный статус морских свинок и крупного рогатого скота;
2. Материалы по разработке схемы специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота с использованием специфического иммуномодулятора.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность полученных результатов подтверждается организацией большого количества экспериментов в лабораторных и производственных условиях с использованием комплекса современных методов исследований и статистической обработкой цифрового материала с помощью программы одно- и многофакторного корреляционного и регрессионного анализов, а также одним из вариантов регрессионного метода – дискретно-динамическим анализом. Степень достоверности полученных показателей оценена путем сравнения величин вариационных рядов с помощью критерия Стьюдента.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (Омск, 2011-2014), на Международных научно-практических конференциях «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых» (пос. Краснообск, 2012) и «Обеспечение ветеринарного благополучия в животноводстве и птицеводстве» (Омск, 2013).
Личный вклад соискателя. Работа выполнена соискателем самостоятельно, участие соавторов отражено в совместно изданных научных статьях. В выполнении отдельных этапов работы принимали участие: кандидат ветеринарных наук А.Н. Новиков и кандидат ветеринарных наук Е.М. Шулико.
Автор приносит глубокую благодарность за оказание научно-методической помощи доктору ветеринарных наук, профессору М.А. Бажину.
Механизм приобретенного антибактериального иммунитета
Многочисленные исследования отечественных и зарубежных авторов показали, что центральным звеном приобретенной резистентности к туберкулезу является специфический клеточный иммунитет, недостаточность которого во многом определяет особенности клинического течения и исход заболевания (Е.Ф. Чернушенко, Л.С. Когосова, 1981; А.Е. Александрова, 1987; Л.С. Когосова с соавт., 1990; И.С. Хоменко, 1993; Б.С. Брискин, З.И. Савченко, 1994; Б.Е. Кноринг, 1995; И.С. Фрейдлин, 1998; А.В. Елькин с соавт., 2002; L. Lenzini et al., 1981; V.R. Perumal, 1981; A.M. Dannenberg, 1989; А. Ghosh et al., 1989).
При туберкулезе легких возникает количественный дефицит и выраженная функциональная дисфункция Т-системы иммунитета. У больных прогрессирующим туберкулезом недостаточность клеточного иммунного ответа определяется в 60-100%. Проявление иммунологических дисфункций при развитии туберкулёза связано с уменьшением количества активированных моноцитов и снижением как количественного содержания, так и функциональной активности Т-хелперов (стимулированная продукция ИЛ-2 и пролиферативный ответ на митоген). При прогрессировании заболевания регистрируется углубление степени иммунодепрессии: дальнейшее снижение количественного содержания активированных моноцитов и подавление функциональной активности Т-клеток (В.Ю. Мишин с соавт., 1996; Д.А. Адамбеков с соавт., 1998; М.А. Карачунский с соавт., 1997; Н.А. Хонина с соавт., 2000; M. Goren, 1982; U. Greinert et al., 1990). Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) представляет неотъемлемую часть иммунных реакций организма при туберкулезе. Несмотря на то, что отсутствуют детально разработанные теории о роли ГЗТ в формировании повышенной устойчивости к туберкулезу, связанной с механизмами приобретенного иммунитета, уже имеется достаточно фактов, чтобы рассматривать ее как центральное звено в развитии противотуберкулезной резистентности: 1) ГЗТ всегда сопровождает туберкулезную инфекцию и лишь при анергии перед смертью животных и при очень тяжелом процессе у больных туберкулезом людей проявления этого феномена отсутствуют; 2) ГЗТ всегда развивается при вакцинации, и существуют лишь единичные сообщения о том, что можно выделить иммуногенную фракцию микобактерий туберкулеза, не вызывающую ГЗТ; 3) ГЗТ нельзя подавить с помощью удаления тимуса, иммунодепрессантов, рентгеновского облучения или антилимфоцитарной сыворотки, не снизив при этом устойчивости к туберкулезу (М.М. Авербах, 1976). ГЗТ является центральным звеном в процессе формирования устойчивости к туберкулезной инфекции и клетки-эффекторы ГЗТ оказывают регулирующее влияние на систему макрофагов, осуществляющих разрушение микобактерий (М.М. Авербах, 1972).
Своеобразие противотуберкулезного иммунитета заключается в развитии комплекса иммунных процессов – клеточно-опосредованного иммунитета, ГЗТ и антителообразования. Но если клеточный иммунитет и замедленная гиперчувствительность единодушно рассматриваются как основные механизмы противотуберкулезного иммунитета, то в отношении биологической роли антител ясности нет (Н.П. Овдиенко с соавт., 1986). При туберкулезе имеет место антителообразование, хотя уровень антител невысокий. Четкой зависимости между концентрацией антител и состоянием иммунитета не установлено. Еще Кальмет отмечал, что антитела при туберкулезе являются лишь свидетелями развития клеточных реакций. Они не нейтрализуют ни туберкулин, ни микобактерии туберкулеза (Е.Ф. Чернушенко, Р.Г. Процюк, 2010).
На сегодняшний день не определена сущность антителообразования в механизме противотуберкулезной устойчивости. Четко установлено, что антителам не свойственен защитный эффект, т. е. предварительное введение их здоровому животному не препятствует развитию туберкулезной инфекции. Сыворотки крови, которые содержат антитела, не угнетают рост микобактерий in vitro. Пассивное введение В-лимфоцитов инфицированного животного здоровым не передает им стойкости к микобактериям туберкулеза. Однако установлено, что специфические противотуберкулезные антитела способны усиливать фагоцитоз. Таким образом, преобладающий клеточный характер противотуберкулезного иммунитета дополняется гуморальным звеном, который определяет кооперацию Т-, В-лимфоцитов и фагоцитирующих клеток (Е.Ф. Чернушенко, Р.Г. Процюк, 2010).
Высокий уровень антител не является отражением повышенной сопротивляемости организма, однако если в случае тяжелого прогрессирующего течения туберкулеза легких имеет место подавление клеточного и гуморального иммунитета и повышение уровня иммуноглобулинов и концентрации антител, то это свидетельствует о благоприятной динамике процесса (А.П. Анипко с соавт., 1992; Б.Е. Кноринг, 1996; J. Grange et al., 1980; I. Orme, E. Collins, 1984; U. Greinert et al., 1990).
Кожные и клеточные реакции на туберкулин и антителообразование при туберкулезе часто происходят не параллельно. Умеренные и даже слабые реакции на туберкулин и антителообразование при туберкулезе часто развиваются параллельно. Умеренные и даже слабые реакции на туберкулин могут сочетаться с высокими титрами противотуберкулезных антител. Также существуют конкурентные отношения ГЗТ и антителообразования. Так, высокий уровень антител угнетает клеточный ответ на специфический антиген (Е.Ф. Чернушенко, Л.С. Когосова, 1981; Е.Ф. Чернушенко, Р.Г. Процюк, 2010)
Помимо реакций клеточного и гуморального иммунного ответа, в организме участвует целый спектр так называемых неспецифических защитных реакций, которые реализуются через эффекторные факторы. С ними связывают развитие механизмов защиты при микобактериальном инфекционном процессе. Цитокины играют важную роль в активации макрофагов, тем самым они оказывают патогенетическое влияние на формирование иммунитета при инфицировании микобактериями туберкулеза (M. Moraes, 1999; A. Lein, 1999). Существенное влияние на иммунитет оказывают цитокины, в частности IL-1, IL-2, IL-4, IFN- и TNF-, обеспечивающие последовательность этапов, сбалансированность и возможность завершения иммунного ответа. Туберкулез относят к интерлейкин зависимым иммунодефицитам с выраженными изменениями в цитокиновой сети, в результате чего нарушается количественный баланс регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (В.Я. Гергерт с соавт., 1995; Б.Е. Кноринг с соавт., 1998; J. Ellner, R. Wallis, 1989; I. Orme et al., 1993).
Высокоиммуногенные комплексы на основе синтетических полиионов
Учение об иммунной системе млекопитающих является наиболее важным звеном в развитии иммунологии. Эта система, как совокупность лимфоидной тка-ни и органов, контролирующих постоянство внутренней среды организма, имеет огромное значение в этиологии и патогенезе гомеостатических нарушений (Р.В. Петров, 1976; П.Д. Горизонтов, 1981; А.Я. Кульберг, 1986; G. Steinmann, H. Muller-Hermelink, 1985).
Иоффе и Куртис (Yoffey, Courtice, 1970) объединили лимфоидную и кроветворную систему в единый лимфоидно-миелоидный комплекс. Комплекс представлен совокупностью лимфоидных органов и тканей, паренхима которых содержит клетки мезинхимального происхождения. В него входят: красный костный мозг, тимус, селезенка, лимфоидная ткань кишечника и соединительная ткань. Функциональное назначение комплекса – обеспечение кроветворения (миелопоэза) и формирование клеток иммунной системы (лимфопоэза). Среди органов и тканей комплекса имеются истинно лимфоидные образования, в которых происходит только лимфопоэз (тимус, лимфатические узлы, лимфоидная ткань кишечника) и «смешанные» образования, где представлен как лимфо-, так и миелопоэз (костный мозг, селезенка) (В.Г. Галактионов, 1998).
Клеточный состав формируется за счет дифференцировки единого предшест-венника – полипотентной стволовой клетки, находящейся в костном мозге. Каж-дая стволовая клетка дает начало всем росткам дифференцировки клеток лимфо-идной и миелоидной тканей. Дифференцируются лимфоциты в центральных лимфоидных органах: В-лимфоциты в костном мозге, Т-лимфоциты – в тимусе. Из этих органов они мигрируют в периферическую лимфоидную ткань – лимфа-тические узлы, селезенку и лимфоидную ткань, ассоциированную с кишечником. Это движение лимфоцитов от центральных органов иммунной системы на пери-ферию является главным миграционным путем. Кроме того, имеется путь рецир-куляции. Лимфатические сосуды, дренирующие тело, собирают внеклеточную жидкость – лимфу – вместе с рассеянными по телу лимфоцитами и переносят ее в лимфатические узлы. Лимфоциты после некоторого времени пребывания в лимфатических узлах собираются в выносящих, эфферентных, лимфатических узлах. Из них лимфоциты попадают в основной лимфатический сосуд – грудной проток, откуда вновь возвращаются в кровоток через левую подключичную вену (В.Г. Галактионов, 1998; А.А. Ярилин, 1999; Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин, 2000; Л.П. Сизякина, И.И. Андреева, 2005; В.М. Манько, Д.А. Девришов, 2011; C. Janeway et al., 1997).
Органы иммунной системы подразделяются на центральные (первичные) и периферические (вторичные). Центральные органы служат основным местом развития лимфоцитов. Здесь лимфоциты дифференцируются из стволовых лимфоидных клеток, размножаются и созревают в функциональные клетки. У млекопитающих Т-клетки созревают в тимусе, а В-лимфоциты в печени плода и в костном мозге. Птицы имеют особое место образования В-клеток – фабрициеву сумку (М.Р. Сапин, Л.Е. Этинген, 1996; В.Г. Галактионов, 1998; А.А. Ярилин, 1999; А. Ройт с соавт, 2000; Ю.Н. Федоров с соавт., 2000; Е.И. Змушко с соавт., 2001; Л.П. Сизякина, И.И. Андреева, 2005). В последние годы к центральным органам иммунитета относят печень. Установлено, что в эмбриональном периоде она является источником первичной популяции В-лимфоцитов. Здесь осуществляется их антигензависимая дифференцировка и превращение в зрелые В-лимфоциты, а также дифференцировка супрессорных В-лимфоцитов (П.А. Красочко, Ю.Н. Федоров, 2005).
Периферические органы представлены селезенкой, лимфатическими узлами, миндалинами и скоплениями лимфоидной ткани, локализованной в полых органах желудочно-кишечного тракта, дыхательной и мочеполовой систем. Кроме того, лимфоидная ткань диффузно рассеяна в слизистых оболочках внутренних органов (желудочно-кишечный тракт, бронхи). Вторичная лимфоидная ткань – это, то микроокружение, в котором лимфоциты могут взаимодействовать с антигенами, между собой и со вспомогательными клетками. Для возникающего здесь иммунного ответа необходимы фагоцитирующие макрофаги, антигенпрезентирующие клетки, а также зрелые Т- и В-лимфоциты (М.Р. Сапин, Л.Е. Этинген, 1996; А.А. Ярилин, 1999; А. Ройт с соавт, 2000; Е.И. Змушко с соавт., 2001; Л.П. Сизякина, И.И. Андреева, 2005).
Перечисленные лимфоидные органы, ткани и клетки в целостном организме имеют структурно-функциональную взаимосвязь, которая обеспечивается, кроме непрерывно мигрирующих лимфоцитов, гуморальными факторами (медиаторами, гормонами) и нервной системой.
Клетки иммунной системы. В иммунном ответе участвует целый ряд клеток и выделяемых ими растворимых продуктов. Центральная роль принадлежит лейкоцитам (А. Ройт с соавт., 2000; К.А. Лебедев, И.Д. Понякина, 2003).
В крови циркулирует 5 типов лейкоцитов, которые с позиции иммунологии можно разделить на фагоциты (нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и моноциты) и иммуноциты (лимфоциты).
Популяция лимфоцитов, являющихся носителями специфичности иммунных реакций, неоднородна. Она включает различные субпопуляции, имеющие принципиально разные функции.
Имеются два основных типа лимфоцитов, обладающих различным гистогене-зом и конечной эффекторной функцией: Т-лимфоциты, обеспечивающие клеточ-ный иммунитет, и В-лимфоциты, ответственные за антителообразование. Прин-ципиально отличается от них особый тип лимфоцитов – нормальные киллеры, ко-торые сами по себе не обладают специфичностью против антигена (Р.В. Петров, А.Н. Чередеев, 1974; А.Н. Чередеев, 1976; А. Ройт с соавт., 2000; Е.И. Змушко с соавт., 2001; К.А. Лебедев, И.Д. Понякина, 2003; R. Stewart, 1985).
В настоящее время накоплены многочисленные, хорошо аргументированные сведения о необходимости кооперации клеток для развития иммунной реакции. Основными участниками кооперативного процесса являются клетки лимфоидных органов – лимфоциты и нелимфоидные клетки системы мононуклеарных фагоцитов – моноциты, макрофаги. Способность Т- и В-лимфоцитов к миграции обеспечивает кооперацию их между собой и с макрофагами в процессе иммунного ответа (Р.В. Петров, 1976; Л.Н. Фонталин, Л.А. Певницкий, 1978).
В формировании иммунного ответа участвуют в основном три клеточные системы – Т-, В-лимфоциты и макрофаги . В процессе развития иммунной реакции различают две фазы. В фазе распознавания антигена стимулируется взаимодействие макрофага с Т- или В-лимфоцитом, а в эффекторной – Т-лимфоцита с В-лимфоцитом или Т-хелпера с Т-эффектором (В.И. Покровский с соавт., 1979; J. Sheagren et al., 1975).
После воздействия антигена Т-клетки начинают мигрировать в лимфоузлы, где происходит взаимодействие Т-лимфоцитов с В-лимфоцитами и макрофагами и распознаётся антигенная структура чужеродного белка (В.Г. Галактионов, 1986; J. Shifflet, 1985; H. Frost, 1987). Клеточное взаимодействие обеспечивается системой цитокинов (Д.А. Адам-беков, 1993; Г.Н. Дранник, 2010; Н.Я. Спивак с соавт., 2002; Е.Ф. Чернушенко, 2004). Цитокины – растворимые белковые и полипептидные продукты, синтези-рованные активированными иммунокомпетентными клетками – лимфоцитами, моноцитами, макрофагами, эндотелиоцитами, фибробластами и др. На сегодняш-ний день известно более 300 цитокинов, в состав которых входят интерлейкины (ИЛ), интерфероны (ИФН), гемопоэтические ростовые факторы, которые тормо-зят или стимулируют рост опухолей (ФНО, онкостатин и др.). Каждый цитокин имеет определенную направленность действия; дефект одного компенсируется наличием других, которые выполняют подобную функцию. Этим определяется сбалансированность цитокинового спектра.
Оценка синтезируемых препаратов на их способность восстанавли-вать у морских свинок иммунологическую реактивность
На сегодняшний день не определена сущность антителообразования в механизме противотуберкулезной устойчивости. Четко установлено, что антителам не свойственен защитный эффект, т. е. предварительное введение их здоровому животному не препятствует развитию туберкулезной инфекции. Сыворотки крови, которые содержат антитела, не угнетают рост микобактерий in vitro. Пассивное введение В-лимфоцитов инфицированного животного здоровым не передает им стойкости к микобактериям туберкулеза. Однако установлено, что специфические противотуберкулезные антитела способны усиливать фагоцитоз. Таким образом, преобладающий клеточный характер противотуберкулезного иммунитета дополняется гуморальным звеном, который определяет кооперацию Т-, В-лимфоцитов и фагоцитирующих клеток (Е.Ф. Чернушенко, Р.Г. Процюк, 2010).
Высокий уровень антител не является отражением повышенной сопротивляемости организма, однако если в случае тяжелого прогрессирующего течения туберкулеза легких имеет место подавление клеточного и гуморального иммунитета и повышение уровня иммуноглобулинов и концентрации антител, то это свидетельствует о благоприятной динамике процесса (А.П. Анипко с соавт., 1992; Б.Е. Кноринг, 1996; J. Grange et al., 1980; I. Orme, E. Collins, 1984; U. Greinert et al., 1990).
Кожные и клеточные реакции на туберкулин и антителообразование при ту-беркулезе часто происходят не параллельно. Умеренные и даже слабые реакции на туберкулин и антителообразование при туберкулезе часто развиваются парал-лельно. Умеренные и даже слабые реакции на туберкулин могут сочетаться с вы-сокими титрами противотуберкулезных антител. Также существуют конкурент-ные отношения ГЗТ и антителообразования. Так, высокий уровень антител угне-тает клеточный ответ на специфический антиген (Е.Ф. Чернушенко, Л.С. Когосо-ва, 1981; Е.Ф. Чернушенко, Р.Г. Процюк, 2010)
Помимо реакций клеточного и гуморального иммунного ответа, в организме участвует целый спектр так называемых неспецифических защитных реакций, которые реализуются через эффекторные факторы. С ними связывают развитие механизмов защиты при микобактериальном инфекционном процессе. Цитокины играют важную роль в активации макрофагов, тем самым они оказывают патогенетическое влияние на формирование иммунитета при инфицировании микобактериями туберкулеза (M. Moraes, 1999; A. Lein, 1999). Существенное влияние на иммунитет оказывают цитокины, в частности IL-1, IL-2, IL-4, IFN- и TNF-, обеспечивающие последовательность этапов, сбалансированность и возможность завершения иммунного ответа. Туберкулез относят к интерлейкин зависимым иммунодефицитам с выраженными изменениями в цитокиновой сети, в результате чего нарушается количественный баланс регуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов (В.Я. Гергерт с соавт., 1995; Б.Е. Кноринг с соавт., 1998; J. Ellner, R. Wallis, 1989; I. Orme et al., 1993).
Согласно современным представлениям ключевую роль в формировании иммунитета к туберкулёзу играют альвеолярные макрофаги и различные субпопуляции Т-клеток. Исход взаимодействия макрофагов и микобактерий туберкулеза зависит от баланса антимикробной активности фагоцитирующих клеток и резистентности микобактерий к бактерицидному действию макрофагов. При этом важную роль в генерации антимикробной активности макрофагов выполняют Т-хелперные клетки 1-го типа, продуцирующие провоспалительные цитокины интерлейкина-2 (ИЛ-2), -интерферона (-ИНФ), фактора некроза опухоли (ФНО-) (И.А. Щепеткин с соавт., 1994; Н.А. Хонина с соавт., 2000).
Одной из главных причин неблагоприятного течения туберкулеза легких яв-ляется неконтролируемая, высокая продукция противовоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, IL-8, TNF-), с действием которых связывают погрессирование специ-фического процесса, развитие бактериально-токсического шока (В.Я. Гергерт с соавт., 1995; J. Ellner, R. Wallis, 1989; D. Heumann, M.P. Glauser, 1994; J. Ellner, 1997).
Наиболее четко с течением специфической инфекции связаны сдвиги в статусе IL-2 и IL-4. Высокий протективный иммунитет, в основном, связывают с ответом Th1 и уровнем IL-2, а низкую сопротивляемость к инфекции – с активностью Th2, секретирующих IL-4. При туберкулезе легких отмечается снижение уровня спонтанной продукции IL-2, а величина индуцированной продукции IL-2 длительное время остается нормальной (В.Я. Гергерт с соавт., 1995; Н.А. Хонина с соавт., 2000; S.A. Rosenberg et al., 1987).
В последние годы появилось много сообщений о роли и нарушениях апоптоза клеток иммунной системы, физиологическая роль которого заключается в предупреждении появления злокачественных клеток, регуляции интенсивности иммунного ответа, уровня антителообразования, в снижении интенсивности воспалительного процесса (А.Г. Хоменко с соавт., 1996; Р.И. Сепиашвили с соавт., 2000).
Патогенез туберкулеза легких связан с развитием системной воспалительной реакции, поэтому апоптоз Т-клеток может рассматриваться в качестве важного механизма ее ограничения за счет элиминации клеток, продуцирующих противовоспалительные цитокины, что благоприятно сказывается на течении болезни. С другой стороны, апоптоз и анергия иммунокомпетентных клеток могут рассматриваться как отрицательные факторы, способствующие развитию иммунодепрессии (Б.В. Пинегин с соавт., 1998; М.Н. Норкин с соавт., 2000; Н.А. Хонина с соавт., 2000)
Таким образом, результаты исследований последних лет существенно дополняют представления о развитии иммунодефицитных состояний, однако механизм иммунитета при туберкулезной болезни во многом еще не изучен, и некоторые вопросы его остаются спорными.
Иммунные реакции у молодняка крупного рогатого скота на введе-ние специфического иммуномодулятора КИМ-М2
Разработанная схема специфической профилактики туберкулеза крупного ро-гатого скота с применением специфического иммуномодулятора КИМ-М2 была испытана на базе ОПХ СибМИС (ООО «Полтава») Таврического района Омской области. Препарат выпускают во флаконах, он представляет собой жидкость свет-ло-коричневого цвета, состоящую из комплекса антигенов разрушенной культуры БЦЖ, инкубированную с формалином и конъюгированную с ПВП и ПЭГ.
Опыты, проведенные на морских свинках, показали, что протективные свой-ства специфического иммуномодулятора КИМ-М2 сопоставимы с протективными свойствами вакцины БЦЖ, при этом у лабораторных животных не развивалась кожная аллергическая реакция. Все это послужило основанием использовать КИМ-М2 для иммунизации крупного рогатого скота разного возраста.
Для проведения эксперимента на крупном рогатом скоте отобрали 90 телок в возрасте от 20-и суток до 4-х мес. Всем телятам иммуномодулятор инъецировали подкожно в шею на расстоянии 8-10 см от переднего края лопатки в дозе 2,5 мг белка на голову. Затем через 45 суток после введения препарата телят исследова-ли на туберкулез с помощью однократной туберкулиновой пробы. Контроль за испытанием специфического иммуномодулятора КИМ-М2 вели с помощью способа оценки иммунного статуса. С этой целью определяли в периферической крови число иммунокомпетентных клеток, функциональную активность нейтрофилов, концентрацию иммунных комплексов в сыворотке крови и их взаимосвязи дискретно-динамическим анализом.
С помощью специальной программы для ПК составляли дифференциально-прогностические таблицы, позволяющие оценить иммунный статус животных, иммунизированных противотуберкулезными препаратами, а также выявить животных с функциональных напряжением иммунной системы. Кроме того, описанный способ позволяет установить сроки очередной иммунизации.
В результате исследований установили функциональное напряжение иммунной системы у 50 % животных в 20-дневном возрасте перед введением препарата и у 45 % через 180 суток после введения КИМ-М2. На 20-е и 45-е сутки после введения иммуномодулятора телят с напряженным иммунитетом не выявлено (табл. 16).
Результаты этих исследований убедили в необходимости повторного введения специфического иммуномодулятора через 6 мес. после первичной иммунизации.
Таким образом, применение специфического иммуномодулятора КИМ-М2 возможно на всех возрастных группах с 10-20 дневного возраста 2 раза в год на молодняке крупного рогатого скота.
Иммунный статус коров определяли также с помощью дискретно-динамического анализа. Перед введением иммуномодулятора животных исследовали туберкулиновой аллергической пробой и установили, что у всех коров кожная реакция на ППД-туберкулин отсутствовала. Коровам специфический иммуномодулятор вводили подкожно в дозе 5-7 мг белка на одно животное.
Результаты дискретно-динамического анализа у молодняка крупного рогатого скота в разные сроки исследования после введения иммуномодулятора КИМ-М2 Сроки исследования n Количество животных с функциональ-ным напряжением иммунной системы % перед введением КИМ-М2 20 10 50 на 20-е сутки после введения КИМ-М2 20 0 на 45-е сутки после введения КИМ-М2 20 0 на 180-е сутки после введения КИМ-М2 20 9 Через 6 мес. после введения КИМ-М2 животных исследовали туберкулиновой аллергической пробой, а также провели оценку иммунного статуса дискретно-динамическим анализом. Кожной сенсибилизации у коров не обнаружено. Результаты исследования коров через 6 мес. после введения иммуномодулятора с помощью регрессионного анализа представлены в таблице 17, где только у 10 % крупного рогатого скота установили функциональное напряжение иммунной системы.
Аналогичные исследования коров с помощью дискретно-динамического анализа через 12 мес. после введения специфического иммуномодулятора КИМ-М2 выявили 40 % животных с функциональным напряжением иммунной системы, т.е. точно такое же число, что и перед введением этого препарата (табл. 17). Это побудило нас провести повторную иммунизацию коров иммуномодулятором КИМ-М2.
Полученные результаты позволяют утверждать, что применение специфического иммуномодулятора КИМ-М2 на коровах возможно 1 раз в год после исследования ППД-туберкулиновой пробой.
В последующем по результатам дискретно-динамического анализа иммунизацию коров провели еще дважды с интервалом 12 месяцев, что позволило закрепить оздоровительные мероприятия ранее неблагополучной по туберкулезу ферме в течение более 10-ти лет.
Таким образом, в эксперименте разработана схема специфической профилактики, которая способствовала восстановлению утраченной иммунологической реактивности и устранению вторичных иммунодефицитов у новорожденных телят.
Необходимо отметить, что создаваемый в стаде противотуберкулезный иммунитет профилактировал неспецифические туберкулиновые реакции тем самым исключив необоснованный убой маточного поголовья. В 2005 году при исследовании на туберкулез было выделено 4 животных, положительно реагирующих на ППД-туберкулин, однако последующим комиссионным убоем и исследованием биологического материала в районной ветлаборатории туберкулез исключен. В последующем (в 2006-2012 гг.) при двукратном исследовании молодняка крупного рогатого скота, нетелей и коров, реагирующих на туберкулез, не выявлено.
