Содержание к диссертации
Введение
І.Обзор литературы 12
1.1 Особенности распространения вируса инфекционной анемии цыплят 12
1.2 Характеристика возбудителя инфекционной анемии цыплят 14
1.2.1 Характеристика и свойства белков у вируса инфекционной анемии цыплят 16
1.2.2 Пути и способы передачи вируса инфекционной анемии цыплят 19
1.3 Основные клинические формы проявления инфекционной анемии цыплят 20
1.4 Патологоанатомические и патоморфологические изменения при инфекционной анемии цыплят 23
1.5 Гематологические изменения при инфекционной анемии цыплят 27
1.6 Иммуносупрессивное действие вируса 28
1.7 Современные методы диагностики инфекционной анемии цыплят 30
1.7.1 Серологические методы диагностики инфекционной анемии цыплят
1.7.1.1 Реакция нейтрализации вируса 32
1.7.1.2 Реакция непрямой иммунофлюоресценции
1.7.1.3 Иммуноферментный анализ (ELISА, ИФА) 33
1.7.2 Определение и дифференциация вируса ИАЦ при помощи ПЦР 34
1.8 Последовательность генома кур для разработки количественной ПЦР 35
1.9 Заключение по обзору литературы 27
2 Собственные исследования 41
2.1 Материалы и методы 41
2.2 Результаты исследований 45
2.2.1 Разработка полимеразной цепной реакции для детекции вируса ИАЦ 45
2.2.1.1 Выбор нуклеотидных последовательностей для разработки ПЦР 45
2.2.1.2 Подбор синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления ДНК ИАЦ 48
2.2.1.3 Выявление ДНК вируса ИАЦ в полимеразной цепной реакции 50
2.2.1.4 Адаптация ПЦР для амплификаторов в режиме реального времени 56
2.2.2 Разработка полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для количественной оценки вируса ИАЦ 61
2.2.2.1 Разработка полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для оценки копийности генома птиц 61
2.2.2.2 Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени на ген VP1 вируса инфекционной анемии цыплят 68
2.2.2.3 Количественное определение вируса инфекционной анемии цыплят в пробах биоматериала 72
2.2.3 Гематологическая диагностика инфекционной анемии цыплят
2.2.4 Усовершенствование патоморфологических методов исследования при инфекционной анемии цыплят 77
2.2.5 Изучение диагностической эффективности разработанных методов 81
3 Обсуждение полученных результатов 90
4 Выводы 98
5 Практические предложения 100
6 Список литературы
- Характеристика и свойства белков у вируса инфекционной анемии цыплят
- Гематологические изменения при инфекционной анемии цыплят
- Разработка полимеразной цепной реакции для детекции вируса ИАЦ
- Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени на ген VP1 вируса инфекционной анемии цыплят
Введение к работе
канд. ветеринар. наук Г.М. Стеблева
1
Актуальность темы. Инфекционная анемия цыплят (ИАЦ) распространена в большинстве стран мира с развитой птицеводческой промышленностью. Впервые вирус был выделен от кур в Японии (M. Goryo, 1985; M. Goryo, 1987; Y. Otaki, 1987; N. Yuasa, 1987), затем в европейских странах, Китае, Астралии, Новой Зеландии и Южной Африке (N.J. Chettle, 1989; B.E. Engstrom, 1988; T. , 1992).
Вирус инфекционной анемии цыплят посредством апоптоза поражает кроветворные клетки в костном мозге и тимоциты в корковом веществе тимуса. Заболевание сопровождается быстро прогрессирующей апластической анемией и состоянием выраженного иммунодефицита (V. Bulow, 1986).
В настоящее время в России наблюдается стойкая тенденция глобализации производственных процессов, связанных с введением более интенсивных технологий выращивания птицы. Осуществляется ввоз племенной птицы и финальных гибридов из других стран с различной эпизоотической ситуацией в отношении инфекционной анемии цыплят. В таких условиях, все чаще регистрируются вирусные заболевания, передающиеся не только воздушно-капельным, но и алиментарным путем. В связи с этим инфекционная анемия цыплят стала одной из наиболее часто встречающихся патологий птиц на территории России.
Актуальность борьбы с ней стала возрастать, так как ужесточение конкуренции между отечественными и зарубежными производителями мяса птицы привело к повышению уровня требований к его качеству. При наличии изменений, характерных для указанной болезни, снижаются сроки хранения, товарный вид и категорийность тушек бройлеров. Экономический ущерб птицеводческого предприятия складывается из стоимости павших птиц, недополучения прибыли от реализации продукции и затрат на лечебные мероприятия.
Для постановки диагноза на инфекционную анемию цыплят необходимо проводить комплекс исследований. Зачастую на производстве используют клинический и патологоанатомический методы диагностики ИАЦ. Клиническое проявление инфекционной анемии у цыплят сопровождается гематологичекими изменениями (снижением концентрации гемоглобина, падением гематокрита). Посмертные изменения включают дистрофию костного мозга, поражения тимуса, дерматиты и др. Наличие инфекции в стаде можно установить при помощи выявления титров антител в иммуноферментном анализе при исследовании парных проб сывороток крови. Однако сероконверсию возможно определить только у выжившей птицы через 3-4 недели после основной волны падежа, что значительно отодвигает сроки установления диагноза и проведения лечебно-профилактических мероприятий. Выделение вируса ИАЦ в культуре клеток является надежной, но трудоемкой процедурой и обычно не используется в лабораторной диагностике.
Для определения генома возбудителя в органах и тканях в мировой практике разработаны различные варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР), которые применяются для научных исследований и диагностики ИАЦ (M.A. Goodwin, 1994; M.H.M Notebom, 1992; K.M. Tham, W.L. Stanislawek, 1992; Cs.N. Dren, 1994; S.P. Taylor, 1993; L.U. Rehman, 2011;J. Hermann, 2012). В настоящее время на территории нашей страны нет сертифицированных ПЦР для диагностики ИАЦ, а используемые за рубежом ПЦР недоступны для России. В связи с этим возникает потребность в высокоспецифичных и чувствительных методах молекулярной диагностики ИАЦ и разработке диагностических тест-систем на их основе.
Цель и задачи исследования. Цель исследования – разработка полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для диагностики инфекционной анемии цыплят, а так же повышение эффективности гематологических и патологоанатомических методов исследований.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
-
Разработать ПЦР и ПЦР в режиме реального времени для выявления ДНК вируса ИАЦ в пробах биоматериала, а так же – критерии использования реакции для количественной оценки вируса;
-
Повысить эффективность гемиглобинцианидного метода для определения гемоглобина в пробах крови;
-
Выявить основные патоморфологические изменения, вызванные вирусом инфекционной анемии цыплят, разработать шкалу дифференциальной оценки качества тушек для выявления распространения ИАЦ на птицефабриках.
Научная новизна работы. Разработаны качественная ПЦР и ПЦР в режиме реального времени для детекции геномной ДНК вируса инфекционной анемии цыплят.
Впервые адаптирован для микропланшет гемиглобинцианидный метод определения концентрации гемоглобина в крови, который может быть использован для оценки популяции птиц в отношении инфекционной анемии цыплят.
Определена положительная связь выраженности патологоанатомических изменений тушек птиц на убое с концентрацией гемоглобина крови.
Разработана шкала оценки качества тушек на основе патологоанатомических изменений, характерных для ИАЦ.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в установлении локализации уникальных геномных структур вируса ИАЦ (VNTR–повторы, CpG-островки), выявлении достоверной взаимосвязи между концентрацией гемоглобина крови и характером патологоанатомических изменений при ИАЦ.
Полученные результаты могут быть использованы в области молекулярной диагностики ИАЦ для качественной и количественной детекции вируса в пробах биоматериала.
Гемиглобинцианидный метод определения концентрации гемоглобина адаптирован для микропланшет, что сокращает сроки и повышает эффективность гематологических исследований при ИАЦ.
Разработанная шкала оценки патологоанатомических признаков при инфекционной анемии цыплят, позволяет выявлять птицу с признаками заболевания и определять распространенность ИАЦ в стаде.
Апробация полученных результатов. Материалы исследований доложены на заседаниях Ученого совета ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии (2009 – 2013); II Сибирском ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2010); VI международной конференции молодых ученых, посвященной 40-летию СО Россельхозакадемии «Новейшие направления аграрной науки в работах молодых ученых» (Краснообск, 2010); на конференции молодых ученых, посвященной 60-летию АНИИСХ «Молодые ученые – сельскому хозяйству Сибири» в секции «Животноводство: разведение, кормление, ветеринария» (Барнаул, 2010); на региональной научно-практической конференции «Современные достижения аграрной науки в животноводстве, растениеводстве и экономике» (Томск, 2011); III международной научно-практической конференции (Горно-Алтайск, 2011); V международной научно-практической конференции «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых» (Краснообск, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 3 – в журналах рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ («Вестник НГАУ», «Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова», «Птицеводство»).
Внедрение результатов исследования. Результаты научных исследований использованы при составлении методического пособия «Новые методы диагностики инфекционной анемии цыплят», утвержденного на подсекции «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 2 от 26.02.2013).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения. Диссертационная работа иллюстрирована 20 рисунками и 16 таблицами. Список литературы представлен 134 источниками, в том числе 117 – зарубежных авторов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработка ПЦР и ПЦР-РВ и оценка возможностей использования их для диагностики инфекционной анемии цыплят;
-
Адаптированный для микропланшет метод гемиглобинцианидного определения концентраций гемоглобина в крови птиц.
Характеристика и свойства белков у вируса инфекционной анемии цыплят
Возбудитель инфекционной анемии цыплят — ДНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Circoviridae, рода Gyrovirus. Семейство Circoviridae включает в себя вирусы, имеющие различия в структуре генома. Так, цирковирусы, поражающие свиней и попугаев (болезнь клюва и перьев), относятся к роду Circovirus, а вирус инфекционной анемии цыплят является единственным представителем рода Gyrovirus (A. Crowther, D. Todd et al. 2003). Вирус, вызывающий инфекционную анемию цыплят, является мелким безоболочечным вирусом, содержащим одноцепочечный кольцевой геном, он имеет остроконечную форму, его размер составляет 25 нм (I. Tischer, Н. Gelderblom, W. Vettermann, 1982).
Вирионы обычно образуют паракристаллическую массу, иногда с рыхлой структурой. Крупные включения представляют собой аутофаголизосомы. Внутриядерные включения окружены мембраной и часто ассоциируются с ядрышковым ретикулюмом или скоплением гетерохроматина (Н. Gelderblom, 1989).
Репликативная форма вирусного генома различается по количеству нуклеотидов. Для изолята CIA-1 она равна 2,298 пар оснований, а для Cuxl(C), L-028 и СоппВ - 2,319 пар оснований. Такое различие длин репликативных форм объясняется наличием или отсутствием направленных повторов в промоторном регионе. Большинство штаммов вируса инфекционной анемии кур имеют четыре повтора со вставкой из 12 пар оснований в средней области. Определено, что дикий (немутантный) тип имеет четыре повтора, но в некоторых изолятах имеется пять повторов, которые были получены после 30 пассажей штамма Сих-1 в клетках MDCC-MSB1 (R.W. Renshaw, 1996). В инфицированных клетках присутствует как одно-, так и двухцепочечная ДНК. Однако вирионы содержат только замкнутую минус цепь (М.Н.М. Noteborn et al. 1991; K.V. Phenix, B.M. Meehan, D. Todd, M.S. McNulty, 1994).
Было отмечено наличие гипервариабельности в области VP1 между аминокислотами 139-151, выражающееся в изменении состава аминокислот, оказывающие влияние на структуру белка и увеличение цитопатогенности. Так, главный структурный белок вируса VP1 несет эпитопы, ответственные за иммунную реакцию, что делает его высокоспецифичным. Отмечено, что эти изменения влияют на репликацию вируса в культуре клеткок MDCC-MSB1.
При анализе большинство штаммов оказалось похожими, однако существуют определенные их различия в отношении последовательностей. Все штаммы имеют три накладывающихся друг на друга кодирующие последовательности, открытые рамки считывания (ORF), потенциально способные кодировать белки вируса ИАЦ массой 52 кДа (ORF1), 24 кДа (ORF2) и 13 кДа (ORF3), одну промоутерную область и один сигнал полиаденилирования (J.G. Jacobson, 1989).
Все ORF расположены в комплементарной части молекулы. ORF3 находится между ORF2 и ORF1 и частично накладывается на ORF1. Японский штамм вируса САА82-2 содержит еще одну ORF, находящуюся ниже ORF1, в позиции 1941-2289. Вероятно, данная последовательность не транслируется, поскольку после стоп-код она ORF1 расположен CpG-богатый участок инвертированного повтора с последующими различными шпилечными структурами и 4 VNTR, состоящими из 18 нуклеотидов. Промотор, содержит прямые повторы, состоящие из 21 пары оснований. Он располагается выше ORF-2.
Участок VNTR и вставка из 12 пар оснований связаны с факторами транскрипции куриных Т-клеток (М.Н.М. Notebom, 1994). Делеция первых двух прямых повторов приводит к уменьшению транскрипционной активности на 40-50% (K.V. Phenix, 1994).
Синтезируется только одна, не подвергшаяся сплайсингу, полицистронная мРНК, состоящая из 2100 оснований, которая кодирует три открытые рамки считывания.
Для ДНК содержащих вирусов уникально использование внутренних инициирующих AUG-KOдонов для синтеза белков массой 52 кДа и 13 кДа (М.Н.М. Notebom, 1992; K.V. Phenix, 1994; L. Henning, 1999).
В очищенных препаратах вируса ИАЦ был идентифицирован вирусный структурный белок с молекулярной массой 52 кДа (VP1). Этот белок, вероятно, является основным белком капсида (J. Claessens, 1991; В.М. Meehan, 1992). Белок VP2, массой 24 кДа имеет связь с вирионами. Он является неструктурным белком и действует как поддерживающий белок при сборке вирионов (D. Wang, 2009). Третий протеин, VP3, обнаруживается в пределах ядер клеток (М.Н.М. Notebom, D.Todd, 1994), и не обнаруживается в пределах очищенных вирусных частиц (В.М. Meehan, 1992).
Исследования, проведенные при помощи реакции нейтрализации позволяют предположить, что нейтрализующие эпитопы являются компонентами VP1 и VP2 (U. Buchholz, 1994). Нейтрализующие антитела образуются только тогда, когда имеются и VP1, и VP2 белки, если одного из них нет - антител не образуется. Вирусный капсид содержит лишь VP1. Антитела связывают нативный VP1, но не денатурированные протеины.
Белок VP3 является вирусным протеином, индуцирующим апоптоз. Молекулярная масса белка VP3 равна 13,6 кДа. Он является самым малым структурным белком вируса ИАЦ, состоящим из 121 аминокислоты. Белок связан с инфицированными клетками (D. Chandratilleke, 1991), а не с очищенными вирусными частицами (U. Buchholz, 1994).
VP3 необходим для репликации вируса. Апоптин фосфорелирует, перемещаясь к ядру, и индуцирует специфичный апоптоз в опухолях или трансформирует клетки. При этом в цитоплазме трансформированных нормальных клеток он не фосфорелирует и остается неподвижным. Его расположение в органе указывает на опухолеспецифичное действие (М.Н.М. Noteborn et al., 1993).
Заслуживает внимание способность VP3 индуцировать апоптоз в злокачественных лимфобластоидных клеточных линиях, в куриных лимфобластоидных клеточных линиях и тимоцитах кур, некоторых злокачественных линиях лимфобластоидных клетках человека и клетках остеосаркомы (D. Chandratilleke, 1991; U. Buchholz, 1994.).
Гематологические изменения при инфекционной анемии цыплят
Графики диссоциации ампликонов и результаты электрофореза ПЦР продуктов, полученных при разных температурах свидетельствовали о том, что оптимальная температура для отжига праймеров составляет 59 С.
Для оценки чувствительности метода проведена серия десятикратных разведений ампликона. После этого с каждым разведением была поставлена ПЦР в режиме реального времени. Учет реакции проводили на основании графиков, отражающих кривые плавления.
Нами было установлено, что накопление продукта ПЦР начинается с 26 цикла, далее начиная с 34 цикла, происходит стадия насыщения (плато). Для визуализации ампликона в пробе с меньшим количеством ДНК должно пройти около 40 циклов. В таблице 6 показана чувствительность ПНР для детекции геномной ДНК вируса ИАЦ.
Проведение ПЦР в режиме реального времени с заведомо известными концентрациями геномной ДНК вируса, позволило установить что чувствительность реакции составляла не менее 10 копий ампликона вируса ИАЦ в пробе объемом 5 мкл.
С целью подтверждения специфичности используемой ПЦР, реакцию ставили с геномной ДНК различных микроорганизмов и вирусов, которые могут присутствовать в организме птицы. Учет проводили на основании графиков флуоресценции. Результаты исследований представлены в таблице 7 и на рисунке 8.
На рисунке 8 изображены графики иллюстрирующие положительные и отрицательные реакции. Два восходящих графика - это графики накопления ДНК ИАЦ, пороговый цикл в данном случае равен 23, остальные графики на рисунке 8 лежат ниже значений порогового цикла такие реакции считаются отрицательными. Из таблицы 7 и рисунка 8 видно, что адаптированная ПЦР для амплификаторов в режиме реального времени обладает специфичностью для вируса ИАЦ. Таблица 7 - Определение специфичности ПЦР для детекции геномной
Графики накопления ДНК в реакциях при определении специфичности ПЦР Таким образом, разработанная ПЦР адаптирована для проведения в режиме реального времени, обладает чувствительностью, специфичностью и может применяться в ветеринарных диагностических лабораториях для выявления ДНК вируса ИАЦ в органах и тканях.
Данным методом исследована 191 проба биологического материала от птиц разного возраста, из них выявлена 71 положительная, что составляет 37%.
Разработка полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для оценки копийности генома птиц
Для разработки критериев использования количественной ПЦР в режиме реального времени для определения концентрации вируса ИАЦ необходимо определить внутренний стандарт, в отношении которого будут сравниваться результаты. В качестве такого стандарта разработана ПЦР-РВ на геном птиц. Нами была выбрана последовательность гена авидина, кодирующая белок авидин.
Для подбора синтетических олигонуклеотидных праймеров выбрана последовательность гена авидина состоящая из 1133 п.н. Прямой праймер 5 GCAGTGCTCGCTGACTGGG-3 комплементарен последовательности в позиции 173-192 п.н, обратный праймер 5 AGGTGGGCTGGCAGGCTCT-3 комплементарен последовательности в позиции 334-351 п.н. Компоненты реакции для исследования одного образца ДІЖ:
На первом этапе нашей работы необходимо было наработать специфический ампликон и выявить температуру его плавления. В нашей работе использовались интеркалирующие красители SYBR Green -наиболее дешевый и простой вариант окраски ДНК в ПЦР. Оценку реакции осуществляли на основании графиков, отражающих температуру диссоциации ампликона. Анализ данных проводили с помощью кривых плавления (melt curve analysis). Для этого по окончании ПЦР пробирку медленно нагревали от 54 до 95 С, одновременно регистрируя изменение флуоресценции (рисунок 9 А,Б).
На рисунке 9А кривая показывает температуру плавления ампликона, ее определяли как точку перегиба на графике, она равна 87С. Так как фрагменты ДНК различной длины и состава будут плавиться при разной температуре, то для конкретной реакции возможно определить специфическую температуру плавления ампликона. На рисунке 9Б значения максимумов отражает температуру плавления ампликона авидина птиц.
Далее необходимо было определить, при какой температуре олигонуклеотидные праймеры будут специфически отжигаться на целевой ДНК. Met Curve Chart Data 2012-QS-31 1306 opd
Аналитическую чувствительность определяли путем постановки ПЦР-РВ с ампликоном очищенным от примесей реакции. Первым этапом определяли концентрацию полученного и очищенного ампликона с использованием прибора Qubit и набора реагентов HS DNA. Анализ производили флюоресцентным методом согласно протоколу. Копийность ампликона определяли в объеме 1 см3. Для этого при помощи реактивов HS DNA и прибора Qubit определяли концентрацию ДНК в пробе, для вычисления количества ампликонов использовали формулу конверсия: масса-моли (для нуклеиновых кислот), размещенную на http://molbiol.ru/scripts/01_07.html. Затем проводили серию десятикратных разведений ампликона. С каждым из разведений проводили ПЦР-РВ. Результаты исследований представлены в таблице 9.
Разработка полимеразной цепной реакции для детекции вируса ИАЦ
В литературе описано, что изолят вируса Сих-1 приобретает дополнительный, пятый, VNTR стабильно после 30 пассажей в культуре клеток MSB1 (М.Н.М. Noteborn, 1991; K.V. Phenix, 1994). Так же известно, что именно этот изолят используется для производства живых вакцинных препаратов. Таким образом, можно предположить, что именно пятый вариабельный тандемный повтор обеспечивает патогенные или вирулентные свойства изолята вируса ИАЦ. Если это предположение верно, то возникает вопрос, может ли дополнительный тандемный повтор утрачиваться вирусом по мере воспроизводства копий вирионов и восстанавливать свою инфекционную активность.
Для проведения диагностических исследований нами была создана ПЦР, которая позволяет выявить вариабельный участок внутри генома вируса, локализованный в позиции 144-259 п.н. и имеющий в своем составе VNTR и CpG-островки. Также ее можно использовать в режиме реального времени с интеркалирующим красителем SybrGreen, что позволяет анализировать результаты ПЦР на основании графиков без проведения электрофореза. Принцип построения графиков «кривых плавления» основан на том, что для конкретной ДНК-последовательности существует своя температура плавления. Для нашей реакции она составляет 88 С. По диапазону температур, в которых происходит денатурация ампликона, можно судить о его составе. Соответственно, изменение количества VNTR влияет не только на размер ампликона, но и на температуру плавления. Если в пробирке находится ампликон с неспецифической температурой плавления, то пик на кривой флюоресценции сместится, что будет свидетельствовать об ином составе ампликона.
Разработанна ПЦР-РВ для количественного измерения вируса в тканях и органах. Алгоритм определения количества ДНК ИАЦ в пробе основан на анализе проб биоматериала и образца сравнения. Сначала определяется концентрация генома организма курицы, выраженная в геномных эквивалентах (ГЭ), а затем - количество генома вируса ИАЦ (ГЭ). Метод основан на анализе исследуемых проб и серии калибровочных образцов с вычислениями по калибровочным графикам. Для каждой реакции нами были разработаны калибровочные кривые.
Разработанная ПЦР-РВ дает возможность дальнейшего изучения вируса инфекционной анемии цыплят, а также проведения лабораторной диагностики. Посредством реакции возможно выявление вирусного генома в органах и тканях птицы с клиническими признаками заболевания, вирусоносителя. В настоящий момент не установлено прямой связи между уровнем вирусной нагрузки и тяжестью течения заболевания. В этом направлении необходимо проводить дальнейшие исследования. Так же требуют изучения такие вопросы как: возможногсть использования ПЦР-РВ на птицефабриках с целью мониторинга качества вакцинных препаратов против инфекционной анемии цыплят и выявление вирусных контаминантов в вакцинных препаратах против различных заболеваний птиц; количественная оценка вируса ИАЦ в подстилке или системе вентиляции в корпусе птицефабрики.
Один из признаков инфекционной анемии цыплят - низкий уровень гемоглобина. По данным исследователя D.Todd, снижение интенсивности различных поэзов происходит из-за индуцированного вирусом апоптоза стволовых клеток и дифференцирующихся клеток крови. По нашему мнению одним из способов диагностики болезни могут быть гематологические исследования. Для упрощения проведения анализа крови стандартный, гемиглобинцианидный метод определения концентрации гемоглобина был адаптирован для микропланшет. Определение концентрации гемоглобина в каждой исследуемой пробе крови происходит на основании калибровочного графика. В результате проведенных исследований установлено, что разработанный метод определения концентрации гемоглобина в крови в микрообьемах достоверно не отличается от стандартного, Р=0,96.
Ужесточение конкуренции между отечественными и зарубежными производителями мяса птицы привело к возрастанию требований к качеству мяса и куриных субпродуктов. В связи с этим большую актуальность приобретает изучение инфекционнойая анемии цыплят, так как при наличии изменений, характеризующих ИАЦ, снижаются сроки хранения, товарный вид и категорийность тушки бройлера.
В результате проведенных исследований установлено, что качество тушек птицы, при жизни имевших субклиническую форму ИАЦ, значительно ниже. Снижение качества тушки складывается из поверхностных повреждений кожи, к которым относятся целлюлиты, дерматиты, язвы, гематомы. Мясо птицы, больной или переболевшей ИАЦ, часто недостаточно обескровлено, а значит, сроки хранения таких продуктов сокращаются. Органолептические характеристики таких тушек низкие. Нами установлено, что 85,6% тушек из обследованных корпусов птицефабрик, неблагополучных по ИАЦ, имеют поражения, снижающие товарный вид бройлера. Из них наиболее часто встречаются поражения кожи и перьевых фолликулов. Таким образом, определили патологоанатомические признаки, характерные для ИАЦ. В связи с этим разработали шкалу оценки степени выраженности патологоанатомических признаков (в крестах). Птица с первой и второй степенью выраженности признаков ИАЦ (-;+/-) соответствует первому сорту качества мяса бройлеров, такая птица без ограничений поступает в торговые сети. Тушки с третьей и четвертой степенью выраженностью признаков ИАЦ (+;++) относятся ко второму сорту и поступают в торговую сеть в виде отдельных частей (голень, бедро, грудка и др.), консервов, колбас. Тушки с пятой степенью выраженности признаков ИАЦ (+++) направляются на промышленную переработку.
В связи с увеличением частоты встречаемости ИАЦ на птицефабриках, разработанную шкалу оценки патологоанатомических признаков, характерных для ИАЦ рекомендуется использовать в сочетании с действующим ГОСТом, так как предложенная шкала, даст возможность повысить выявляемость тушек с признаками заболевания.
С целью изучения диагностической значимости разработанной гематологической диагностики ИАЦ нами были проведены сравнительные исследования зависимости патоморфологических изменений птицы и концентрации гемоглобина в крови. Исследованию подвергались бройлеры убойного возраста (42 дня) кросса Иза. Диагноз на инфекционную анемию цыплят ставили на основании характерных патологоанатомических и гистологических исследований. Нами выявлена взаимосвязь патологоанатомических проявлений ИАЦ и количества гемоглобина в крови птиц убойного возраста кросса Иза. У бройлеров, имеющих патологоанатомические признаки, характерные для ИАЦ, концентрация гемоглобина в крови составила 82,33 +.2,5 г/л, что достоверно ниже, чем у птиц, не имеющих таких признаков 92,98 + 2,09 г/л (Р 0,01).
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени на ген VP1 вируса инфекционной анемии цыплят
При вскрытии и постановке диагноза пользовались шкалой оценки патологоанатомических признаков ИАЦ, приведенной выше. Птицу с комплексом признаков соответствующих «-» оценивали как условно здоровую, а тушки с признаками «+/-», «+», «++», «-Н-+» как условно больную. Всего исследовано 85 голов, из них 32 не имели патологоанатомичесих признаков ИАЦ, а 53 имели разную степень их проявления. В результате проведенных исследований установлено что среднее значение концентрации гемоглобина у птиц, не имеющих патологоанатомических признаков ИАЦ составляет 92,98+2,09 г/л, а у птицы с проявлением признаков ИАЦ 82,33+2,51 г/л. Концентрация гемоглобина в крови пораженной птицы достоверно ниже, чем у непораженной (Р 0,01).
Так как низкая концентрация гемоглобина крови является одним из признаков инфекционной анемии, то на основании полученных результатов исследования можно сделать вывод о том, что на птицефабриках, неблагополучных по данному заболеванию необходимо проводить исследования гемоглобина крови.
Тяжесть и течение заболевания у птиц зависит от возраста. По данным зарубежных исследователей к вирусу ИАЦ восприимчивы цыплята яичных и мясных направлений в первый 21 день жизни. В более старшем возрасте восприимчивость к вирусу снижается. Установлено, что птицы мясных пород наиболее восприимчивы к инфекции. (N. Yuasa, 1980; М. Н. Goryo, 1985). Для диагностики инфекционной анемии мы исследовали популяцию птиц одного предприятия, где наблюдался падеж с патологоанатомической картиной, характерной для ИАЦ. С целью изучения диагностической значимости разработанных методов диагностики ИАЦ исследовали пробы биологического материала от одних и тех же птиц в ИФА и ПЦР, а так же проводили оценку динамики падежа в исследуемом корпусе (рис.16).
Примечание - Исследованию подверглись 20 эмбрионов, у каждого эмбриона исследовали печень, селезенку и костный мозг методом ПЦР, всего 60 проб.
Трансовариальные антитела обеспечивают цыплятам пассивный иммунитет и устойчивость к естественному заражению вирусом ИАЦ до 3-недельного возраста при условии, что у них отсутствуют признаки иммуносупрессии, вызванные действием других вирусов (А.С. Алиев, 2011). В пробах сыворотки крови эмбрионов от вакцинированных родителей, средний титр МА составлял 96791og10±757,993. Это свидетельствует о том, что цыплята в стаде имеют равный иммунный статус в отношении ИАЦ. Исследованию методом ПЦР подвергались костный мозг, печень, селезенка от эмбрионов. Результаты ПЦР показали, что эмбрионы были свободны от вируса ИАЦ. Начиная с 16-и дневного возраста ДНК вируса ИАЦ регистрировали методом ПЦР. Стада бройлеров, где птица не имеет защитных титров или имеет неоднородные концентрации МА, наиболее предрасположены к развитию инфекционного процесса, вызванного вирусом ИАЦ.
На обследованной нами птицефабрике клинические признаки ИАЦ регистрировали начиная с 29 дня, а резкое увеличение падежа - с 34 (см. рис.16). Сероконверсию к ИАЦ оценивали у 29-дневной птицы и у передержанной — в 50 дней. Титр антител к вирусу ИАЦ при первичной отборки сыворотки крови в 29 дней составил 197,5 ± 39,2. У бройлеров в 29-дневном возрасте отмечали клинические признаки характерные для инфекционной анемии цыплят: общую слабость, анемичность слизистых и кожных покровов, нередко с кровоизлияниями, снижение тургора кожи, одышку, тахикардию, дрожание мускулатуры. Исследования методом ПЦР показало, что 40% исследованных проб имеют ДНК вируса ИАЦ. У погибших птиц отмечали следующие патологоанатомические изменения: перья слипшиеся, кожа трупа увлажнена экссудатом, тургор снижен, имеются изъязвления. На крыльях регистрировали подкожные и внутримышечные кровоизлияния, корочки засохшей крови (рис. 17). Мышечная ткань дряблая, анемичная с точечными и полосчатыми кровоизлияниями. Хрящевая головка бедренной кости истончена, кость хрупкая, костный мозг бледный с желтоватым оттенком (рис. 18), тимус анемичен, значительно уменьшен в размере, у некоторых птиц редуцирован (рис. 19). Сердце дряблое, вены расширены, кровоизлияния на эпикарде. Печень увеличена, имеет тупые края, неравномерно окрашена, цвет варьирует от темно-бордового (застойные явления) до желтушно-зеленоватого (вследствие разрушения гемоглобина) (рис. 20). Отмечали спленомегалию, кровоизлияния на поверхности органа. На рисунках 17-20 изображены патологоанатомические изменения, характерные для инфекционной анемии цыплят.
