Введение к работе
1 1.1 Актуальность темы
Аденоматоз легких овец (АЛО) — медленно развивающаяся контагиозная инфекционная болезнь, характеризующаяся длительным инкубационным периодом, затяжным течением и прогрессирующим разрастанием альвеолярного и бронхиального эпителия, сопровождающимся образованием в легких железистоподобных опухолей (аденом, аденокарцином) [1].
В естественных условиях АЛО регистрируют в виде энзоотии. Современный ареал распространения АЛО охватывает 39 стран, в которых регистрировали болезнь или подозревали ее наличие.
По данным Международного Эпизоотологического Бюро (МЭБ) на период с 1996 - 2004 гг. заболевание диагностировано у овец в государствах и странах Южной Африки, Кении, Израиле, а также Индии, Турции, Чили, Бразилии, а из европейских стран - в Германии, Великобритании, Испании, Греции, Португалии, Франции [15].
Комплексные исследования овцеводческих хозяйств нечерноземной зоны Российской Федерации показали, что около 35 % из них являются неблагополучными по АЛО [3].
Проведённые к настоящему времени вирусологические, иммунологические, электронно-микроскопические и другие исследования свидетельствуют, что ретровирус - основной этиологический агент АЛО. Возбудителем АЛО РНК-содержащий вирус, относящийся к роду Betaretrovirus подсемейству Orthoretrovirinae семейства Retroviridae (онковирусу типа А, В, С, и Д) [17].
В последние годы обнаружены эндогенные формы вирусов АЛО (enJSRV), имеющие сходную структурную организацию генома с экзогенной формой вируса АЛО [14]. У многих домашних пород овец и их диких предков - муфлона и снежного барана, были выявлены эндогенные формы вирусных последовательностей, очень сходные с геномом вируса АЛО (JSRV). Предполагают, что эти вирусы вошли в состав генома представителей рода Ovis на заре его эволюции. Близкородственные вирусы были обнаружены у диких и домашних овец и коз, а также у ряда представителей семейства Bovidae [7].
Анализ нуклеотидных последовательностей генома показал, что в хромосомах овец содержится, по меньшей мере, 27 копий эндогенных бетаретровирусов (enJSRV), близко родственных экзогенному и патогенному вирусу АЛО (JSRV) [6].
Эндогенные ретровирусы, после формирования вирусных частиц, могут действовать как экзогенные ретровирусы[11].
В результате исследования, проведенного Bernardo Chessa, было установлено, что эндогенный ретровирус (ERVs) можно использовать в качестве информационного маркера для изучения эволюции геномов как вируса, так и хозяина. В своей работе автор показал, что изучение распространения эндогенного вируса АЛО (enJSRVs) у разных пород домашних овец дало ценное понимание истории одомашнивания овец [19].
В настоящее время АЛО диагностируют на основании комплекса эпизоотологических и клинических данных, результатов патологоанатомического вскрытия животных, что не позволяет установить диагноз болезни в короткие сроки [18].
В связи с отсутствием чувствительных клеточных систем для выделения вируса АЛО прижизненная диагностика не разработана. Кроме того, вирус АЛО не вызывает образования специфических антител в организме зараженных животных. Механизм, лежащий в основе отсутствия адаптивной иммунной реакции к вирусу АЛО, не известен, но наиболее вероятным объяснением является то, что овцы иммунологически толерантны к антигенам этого вируса. Возможно, это происходит из-за экспрессии близкородственных белков эндогенного вируса АЛО [13].
Длительный период бессимптомного течения болезни приводит к тому, что животноводы перемещают клинически здоровых, но уже инфицированных животных, что в дальнейшем приводит к возникновению новых энзоотических очагов. Это особенно актуально в современных условиях, когда предпринимаются меры по восстановлению овцеводства в России, в связи с чем, происходит активное перемещение животных между её регионами, а также импорт племенного поголовья из зарубежных стран.
В связи с вышеизложенным, на сегодняшний день актуальной остается проблема прижизненной диагностики вируса АЛО, в том числе для племенного поголовья животных при экспорте и импорте. Проблема может быть решена с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, как наиболее чувствительного и специфичного метода, способного выявить геном возбудителей вирусных болезней в кратчайшие сроки.
1.2 Степень разработанности проблемы
2001 г DeMartini с соавторами опубликовали данные о расшифровке первичных нуклеотидных последовательностей и получении полноразмерных последовательностей генома вируса аденоматоза легких овец, которые были клонированы в плазмидный вектор [12].
В настоящее время зарубежными учеными разработаны различные варианты ПЦР для выявления генома вируса АЛО [5], [8], [16].
В Российской Федерации диагноз на аденоматоз легких овец ставят на основании клинических признаков, данных патологоанатомического вскрытия животного и гистологических исследований [4].
Во ВНИИВВиМ Россельхозакадемии В.Г. Бурдинским (2009 г.) разработана тест-система по выявлению генома вируса аденоматоза легких овец методом ПЦР с электрофоретической детекцией.
В Российской Федерации не разработаны современные методы прижизненной диагностики АЛО, для исследования проб от экспортированного и импортированного племенного поголовья, что явилось основополагающим аргументом при выборе темы диссертационной работы.
1.3 Цели и задачи исследования
В соответствии с вышеизложенным, основная цель данного исследования заключалась в разработке и совершенствовании методов молекулярно-генетической диагностики аденоматоза легких овец.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
-
разработать метод ПЦР с электорофоретической детекцией для выявления участка генома и идентификация экзогенной формы вируса аденоматоза легких овец, позволяющего дифференцировать его от эндогенной формы вируса;
-
разработать тест-систему на основе ПЦР-РВ для выявления участка генома экзогенного вируса аденоматоза легких овец;
-
определить эффективность разработанной тест-системы на основе ПЦР в режиме реального времени по выявлению участка генома вируса аденоматоза легких овец;
4. провести филогенетического анализа нуклеотидных
последовательностей экзогенного и эндогенного вируса аденоматоза легких овец, выделенных в Российской Федерации.
1.4 Научная новизна результатов исследований
Впервые в Российской Федерации проведен сравнительный анализ генома экзогенного и эндогенного вируса аденоматоза легких овец и подобраны оригинальные олигонуклеотидные праймеры для постановки ПЦР с электрофоретической детекцией.
Проведено молекулярно-эпизоотологическое исследование и
филогенетический анализ нуклеотидной последовательности экзогенного и эндогенного вируса аденоматоза легких овец, выделенных в Российской Федерации.
Впервые разработана тест-система для выявления генома вируса аденоматоза легких овец на основе метода ПЦР в режиме реального времени с аналитической чувствительностью выявления 225 копий ДНК на реакцию.
1.5 Теоретическая и практическая значимость работы
Разработаны «Методические рекомендации по выявлению генома вируса АЛО методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины РАСХН A.M. Смирновым 12.04.2012 г.
Проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей экзогенного и эндогенного вируса аденоматоза легких овец, выделенных в Российской Федерации
1.6 Публикация результатов исследований
По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 1 из них в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации: «Веткорм» № 5,2012 г
1.7 Степень достоверности и апробация результатов
Степень достоверности результатов проведенных исследований подтверждена комиссионными испытаниями. Акты комиссионных испытаний утверждены директором ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии 13.12.2011 г. Статистическая обработка включала расчеты средних арифметических значений, стандартных отклонений результатов полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, вычисления эволюционных дистанций с помощью программы MEGA 3.1. Научные
положения, выводы и практические предложения диссертационной работы аргументированно отражают содержание диссертации.
Исследования по теме диссертационной работы представлены и обсуждены на Международной научно-практической конференции молодых учёных "Достижения молодых учёных в ветеринарную практику" (декабрь 2010г., г. Владимир), а также на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИВВиМ Россельхозакадемии в период с 2009 по 2012 гг.
1.8 Основные положения, выносимые на защиту
-
Метод ПЦР с электорофоретической детекцией для выявления и идентификации генома экзогенной формы вируса аденоматоза легких овец, позволяющий дифференцировать его от эндогенной формы вируса.
-
Тест-система на основе ПЦР в режиме реального времени для выявления участка генома экзогенного вируса аденоматоза легких овец,
-
Определение эффективности разработанной тест-системы на основе ПЦР в режиме реального времени по выявлению участка генома вируса аденоматоза легких овец.
-
Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей экзогенного и эндогенного вируса аденоматоза легких овец, выделенных в Российской Федерации.
1.9 Объём и структура работы
Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 25 отечественных и 150 иностранных источников; дополнена приложениями. Диссертация содержит 5 таблиц и 20 рисунков. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.
1.10 Личный вклад соискателя
Основной объём исследований проведён автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: к.б.н ., О.Н. Жигалева; к.в.н., микробиолог лаб. Биофизики А.Ю. Чичикин (эксперименты по заражению животных); к.б.н., н.с. лаб. Молекулярной вирусологии Г.С. Бурмакина; к.б.н. Е.И.
Барышникова зав. Сектором по изучению ретравирусных инфекции животных (освоение молекулярно-биологических методов исследования).
