Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 8
1.1. Золотистый стафилококк и его характеристика 8
1.2. Стафилококковые и сопутствующие инфекции у животных, в сырье и продуктах животного происхождения 10
1.3. Методы диагностики золотистого стафилококка и сопутствующих инфекций бактериальной и вирусной природы .. 15
2. Собственные исследования 25
2.1. Цель и задачи исследования 25
2.2. Объекты и методы исследований 26
2.2.1. Микробиологические методы определения Staphylococcus aureus в биоматериале 26
2.2.2. Выделение и очистка ДНК из бактерий 27
2.2.3. Включение биотина в ДНК методом ник-трансляции 28
2.2.4. Получение меченых ДНК-зондов с помощью полимеразной цепной реакции 29
2.2.5. Методика идентификации бактерий точечной ДНК-гибридизацией на мембранных фильтрах с биотинилированными ДНК-зондами 30
2.2.6. Методика идентификации парвовируса с применением тест-системы «ПАРВОВИР» 32
2.2.7. Методика определения стафилококковых и сопутствующих инфекций на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией 38
2.2.8. Методика определения антигенов парвовируса собак с использованием тест-набора SNAP Parvo 39
2.2.9. Методика выявления антигенов парвовирусного энтерита собак иммуноферментным анализом 41
2.2.10. Статистическая обработка результатов 46
2.3. Результаты исследований
2.3.1. Результаты мониторинговых исследований по выявлению Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций в биоматериале животных, в мясном сырье и субпродуктах 46
2.3.2. Разработка и совершенствование методик определения Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций в мясном сырье, субпродуктах и биоматериале животных на основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией 48
2.3.3. Усовершенствование определения парвовируса в биоматериале с использованием тест-системы IDEXX SNAP...58
2.3.4. Разработка методики ускоренной индикации Staphylococcus aureus в сырье животного происхождения на основе точечной гибридизации со специфичными ДНК-зондами 63
2.3.5. Сравнительный анализ микробиологических методов и методов ДНК-диагностики по выявлению Staphylococcus aureus в биоматериале животных, в сырье и субпродуктах животного происхождения 69
Обсуждение результатов 72
Выводы 81
Предложения для практики 83
Список литературы 84
Приложение 101
- Стафилококковые и сопутствующие инфекции у животных, в сырье и продуктах животного происхождения
- Методы диагностики золотистого стафилококка и сопутствующих инфекций бактериальной и вирусной природы
- Получение меченых ДНК-зондов с помощью полимеразной цепной реакции
- Результаты мониторинговых исследований по выявлению Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций в биоматериале животных, в мясном сырье и субпродуктах
Введение к работе
Актуальность темы.
Стафилококковые инфекции достаточно широко распространены у различных животных. Основными проявлениями стафилококковой инфекции являются: гнойные воспаления кожи и подкожной клетчатки, стафилококковый сепсис, синдром токсического шока, пневмонии, ангины, энтероколиты, отравление стафилококковым энтеротоксином и поражение центральной нервной системы. Резервуаром инфекции коагулазопозигивных стафилококков являются грызуны, птицы, крупный и мелкий рогатый скот, собаки, кошки. При этом заболевание проявляется у всех возрастных групп, но в большей степени у молодняка. Высок риск взаимного заражения золотистым стафилококком животных и человека. Выделение возбудителя происходит с носовыми истечениями, фекальными массами, мочой, истечениями из половых органов (препуция и влагалища), гнойными выделениями из кожных поражений (язвы, свищи).
Инкубационный период продолжается несколько дней. Клинические проявления стафилококковых болезней многообразны. При смешанном заражении стафилококками и вирусами (например, парвовирус) иногда наблюдаются сходные клинические признаки заболеваний. Возбудитель ПВС-2 очень устойчив в окружающей среде и при комнатной температуре может сохраняться в инфицированных объектах в течение 6 месяцев (Б.Ф. Шуляк, 2003; М. Уиллард, Г. Тведтен, 2004; Я.Рэмси, Б.Теннат, 2005г). Лечение заболеваний, вызванных бактериальными, вирусными или смешанными инфекциями требуют различного подхода, вследствие чего, существует необходимость дифференциации возбудителей заболеваний.
Сырье животного происхождения (молоко, мясо, субпродукты) подвержено как первичной, так и вторичной контаминации ( Логвинов Д.Д.,
1992; Горяинова Г.М., 2004; Eshraghi Н., 1997; Pfleger R. et al„ 2002). При ветеринарно-санитарнои экспертизе актуальным является дифференциация золотистого стафилококка от других бактериальных инфекций, в частности от синегнойной палочки, сальмонелл, стрептококков.
Диагностика стафилококковых инфекций основана на классическом бактериологическом анализе с применением питательных сред: мясо-пептонный бульон (МПБ), мясо-пептонный агар (МПА). Определение патогенносте возбудителя проводят в реакции плазмокоагуляции.
Для ускоренной диагностики стафилококковых и парвовирусных инфекций применяют методы ПЦР анализа и ИФА (В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко и др. 1998; М. Уиллард, Г. Тведтен и др.,2004 г).
Для проведения мониторинговых исследований по определению золотистого стафилококка и сопутствующих инфекций в большом количестве биоматериала животных и сырья животного происхождения актуальным является разработка ускоренных методов на основе ИФА и ДНК-диагностики. Цель и задачи исследований.
Целью исследований являлась разработка и совершенствование методов определения стафилококковых и сопутствующих парвовирусных инфекций у животных, а также стафилококковых инфекций в сырье животного происхождения на основе ДНК- и иммунодиагностики. В задачи исследований входило:
- провести мониторинговые исследования по выявлению Staphylococcus aureus и сопутствующих парвовирусных инфекций в биоматериале домашних животных по городу Москва;
провести мониторинговые исследования по выявлению
Staphylococcus aureus в сырье животного происхождения;
- усовершенствовать методику определения Staphylococcus aureus и
сопутствующих парвовирусных инфекций в биоматериале животных на
основе амплификации с последующей ДНК-гибридизацией;
усовершенствовать определение антигенов парвовируса у домашних животных с использованием тест системы IDEXX SNAP;
усовершенствовать определения Staphylococcus aureus в мясном сырье и субпродуктах на основе модифицированных методик амплификации с последующей ДНК-гибридизацией;
- разработать модифицированную методику ускоренной индикации
Staphylococcus aureus в мясном сырье и субпродуктах на основе точечной
гибридизации со специфичными ДНК-зондами;
определить чувствительность и специфичность методов;
провести сравнительный анализ микробиологических методов и методов ДНК-диагностики выявления Staphylococcus aureus у животных и в мясном сырье и субпродуктах.
Научная новизна
Проведены мониторинговые исследования по выявлению стафилококковых и парвовирусных инфекций у домашних животных и стафилококковых инфекций в мясном сырье и субпродуктах на территории мегаполиса Москва, которые показали заболеваемость в 2008 году стафилококкозом до 86,1%, парвовирусным энтеритом до 95,7%, совместных инфекций - 30,2%, и, соответственно, 82,3% , 99,0% и 48,3% - в 2009 году. Золотистый стафилококк был выявлен в сырье животного происхождения в относительно не большом проценте исследуемых проб.
Усовершенствовано определение Staphylococcus aureus и других сопутствующих инфекций бактериальной и вирусной природы в мясе, субпродуктах и у животных на основе разработанных модифицированных методик амплификации с последующей ДНК-гибридизацией, позволяющих
6 проводить анализ в течение 6-8 часов. Методики дают возможность
одновременно определять смешанные инфекции (Staphylococcus aureus и
Salmonella typhi murium) в мясном сырье и субпродуктах и (Staphylococcus
aureus и парвовирус) в биоматериале животных.
Усовершенствовано определение парвовируса в биоматериале с использованием тест-системы ШЕХХ SNAP. Тест-система позволяет проводить анализ в течение одного часа.
Разработана методика ускоренного определения Staphylococcus aureus в мясе и субпродуктах на основе ДНК гибридизации со специфичными ДНК-зондами. Методика позволяет проводить дифференциацию Staphylococcus aureus от других бактериальных инфекций. Практическая ценность.
На основе проведённых исследований разработаны:
-
«Методические рекомендации по определению антигенов и антител на основе иммуноферментного анализа при инфекционных заболеваниях мелких домашних животных», утверждённые Отделением ветеринарной медицины РАСХН 30.05.2008г.
-
Проект Национального стандарта Российской Федерации «Экспресс-метод определения антигенов и антител при внутренних заболеваниях животных, на основе иммуноферментного анализа».
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены и обсуждены:
- на Международной научно-практической конференции «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойиых и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел», посвященной 100-летию со дня рождения Героя Социалистического труда, лауреата Государственной
премии СССР и премии Эстонской ССР, доктора ветеринарных наук, профессора, академика ВАСХНИЛ А.Х. Саркисова (Москва, 2009 г.).
на Ученом совете ГНУ ВНИИВСГЭ (2009 г.).
на межлабораторном совещании ГНУ ВНИИВСГЭ (2009 г.). Публикации Результаты исследований отражены в 3 научных статьях. Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения.
Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 14 рисунков. Список литературы включает 154 источника отечественных и зарубежных авторов.
Стафилококковые и сопутствующие инфекции у животных, в сырье и продуктах животного происхождения
Сырье и продукция животного происхождения довольно часто могут быть контаминированы золотистым стафилококком.
Индикация бактериальных клеток на всех стадиях их развития является важной задачей при определении качества продуктов питания и сырья животного происхождения.
Энтеротоксин золотистого стафилококка при попадании в организм животного и человека вызывает токсикозы за счет длительного сохранения в пищевых продуктах, даже в отсутствии бактериальных клеток (2, 37, 62, 69, 98).
Молочнокислые бактерии Serratia, Pseudomonas и другие ингибируют развитие стафилококков и образование ими токсина в результате изменения реакции среды в кислую сторону. Микрофлора бифидобактерий также оказывает подобное действие. Изменение температуры вызывает задержку роста стафилококков и образование токсина (9, 19, 66, 113, 123).
В молоке от больных субклиническим и клиническим маститом коров, как правило, выделяются стафилококки, в том числе и золотистый.
Наличие золотистого стафилококка в молоке обуславливает возникновение токсикоинфекций у человека.
Наиболее важными и частыми возбудителями мастита являются стафилококки и стрептококки серогрупп В, С, Е, которые выделяются из молока и секрета вымени больных коров и вызывают заболевание в 90% случаев, при чем стафилококки выявляются в 22,9-59,5% случаев, а стрептококки- 11,7-47,1% (17, 29, 47, 61, 81, 88, 153).
В настоящее время накоплен большой материал, свидетельствующий о том, что стафилококки выделяют энтеротоксин, способный вызывать остро протекающий гастроэнтерит.
На его долю приходится от 9,6 до 89% случаев, причем мастит, вызываемый золотистым стафилококком, является наиболее опасным, так как его трудно ликвидировать (11, 22, 30, 58, 92,116). Это происходит в результате того, что золотистый стафилококк более устойчив к антибиотикам. Он паразитирует внутри клеток (L-форма), в результате чего, требуется длительное время для оздоровления животного (94, 110, 115, 137).
Золотистый стафилококк вызывает мягкое воспаление и понижение молочной продуктивности, но без проявления явных признаков болезни, что является опасным в плане неконтролируемого поступления инфекции в молоко (129).
Присутствие золотистого стафилококка ведет к нарушению развития молочной железы и секреторных тканей и, следовательно, снижению молочной продуктивности (31, 154).
Показано, что эффективность лечения коров при мастите, вызываемом золотистыми стафилококками, была в пределах 60%, тогда как при стрептококках- 90-100% (ПО, 143).
Золотистый стафилококк присутствует в вымени не только больных маститом, но и здоровых коров-бактерионосителей, которые постоянно выделяют его с молоком и поэтому являются потенциальным источником инфекции. По некоторым данным, доля коагулазоположительных стафилококков от общего числа выделенных микроорганизмов из молока здоровых коров составляла 3,5% (58), а по другим - 24,4% (18, 22, 30).
В отличие от мастита, вызванного золотистым стафилококком, мастит стрептококковой этиологии (возбудитель Str. agalactiae) трудноизлечим и легко передается от одной коровы к другой. На его долю приходится 30-48% от числа коров, больных маститом бактериального происхождения. Кроме Str.agalactiae выделяют также стрептококки серогрупп С (Str.disgalactiae), Е (Str.uberis), A (Str.pyogenes) (13, 38, 39).
У мелких домашних животных среди смешанных со стафилококкозом инфекций, довольно часто выделяется возбудитель парвовирусного энтерита.
Возбудитель парвовирусного энтерита относится к семейству Парвовирусы (Parvoviridae). У собак выделено 2 типа вируса. Типы вируса различаются спектром чувствительности культур клеток и отсутствием перекрестной серологической реакции (8,71). Парвовирус типа 2 - это ДНК-содержащий вирус, лишенный оболочки, икосаэдрической формы, диаметром 20±4 нм (12), устойчивый к физико-химическим факторам. Инфекционная активность сохраняется при воздействии эфира, хлороформа, а также при рН среды до 3. При температуре 80 С вирус инактивируется за 15 минут, при 56 С - в течение 30 минут. При низких температурах инфекционная активность возбудителя сохраняется до двух-трех лет и более. Парвовирус типа 2 характеризуется гемагглютинирующей активностью (реакции с эритроцитами свиньи, обезьяны макаки-резус) (64,71,72,); с помощью РТГА, РН и моноклональных антител выявлено его антигенное родство с вирусом панлейкопении кошек и вирусным энтеритом норок. При заражении собак образуются антитела ингибирующие гемагглютинацию. Для репродукции вируса используют первично-трипсинизированную культуру клеток почки котенка или перевиваемую линию клеток (CRFK). Вирус при репродукции образует внутриядерные включения и проявляет слабо выраженное ЦПД, которое под световым микроскопом не обнаруживают. Поэтому используют косвенные методы: выявление внутриядерных включений, МФА, tELISA, ПЦР, РГА (44,45,71,100). Основным источником распространения возбудителя служат фекалии больных собак. В низких титрах вирус обнаруживают в рвотных массах со слизью в течение 2-12 дней. Другой не менее важный фактор - высокая устойчивость вируса к физико-химическим факторам и сохранение его во внешней среде до нескольких месяцев. При попадании в организм животного небольшой дозы вируса часто возникает субклиническая форма болезни, а более высокая доза вызывает заболевание, характерное для парвовирусного энтерита (75). Больные собаки распространяют вирус в течение 2-3 недель. Собаки, переболевшие парвовирусным энтеритом, длительное время могут быть источником заражения(72,75).
Методы диагностики золотистого стафилококка и сопутствующих инфекций бактериальной и вирусной природы
Диагностику золотистого стафилококка и сопутствующих инфекций в биоматериале животных, сырье и продуктах животного происхождения проводят различными методами. Наиболее часто используют микробиологические, иммунологические метода и методы ДНК-диагностики.
Одним из методов выявления бактерий является классический микробиологический метод, основанный на выращивании бактерий на элективных питательных средах, с помощью которых можно разделять микроорганизмы по их ростовым свойствам. На агаре Байрд Паркера колонии S. aureus окрашены в черный цвет, на яично-желточно-азидном агаре колонии окружены зоной лецитиназной активности; эшерихии на среде Эндо растут в виде красных, с металлическим блеском колоний; колонии сальмонелл на висмут-солевом агаре окрашиваются в характерный черный цвет (83).
К классическим микробиологическим методам выявления и идентификации микроорганизмов также относятся расщепление углеводов и выделение газов при росте на специальных селективных средах, а также выявление различных ферментов, выделяемых бактериями, например, коагулаза, уреаза, ДНКаза и др. (20, 35, 36, 41).
Весьма информативными являются методы световой и люминесцентной микроскопии. Для этого применяются различные методики фиксации и окрашивания микроорганизмов. Окраска по Граму является одним из основных методом, позволяющих дифференцировать бактерии (9, 14, 20, 40, 46, 51, 74, 83, 101, 134).
Методы электронномикроскопического анализа позволяют изучать изменения в строении микроорганизмов и в развитии их популяций (51, 53, 55,86,88,106, 111, 128).
Методы генной диагностики: гибридизация нуклеиновых кислот, рестрикционныи анализ, полимеразная цепная реакция используются при диагностике микроорганизмов и вирусов.
Среди методов ДНК-диагностики наиболее перспективными в плане практического применения для индикации и идентификации возбудителей инфекций, в том числе смешанной этиологии, являются методы гибридизации нуклеиновых кислот и амплификации (81, 120).
Гибридизация нуклеиновых кислот осуществляется путем специфического взаимодействия гомологичных последовательностей полинуклеотидных цепей ДНК или РНК, с образованием водородных связей между комплиментарными основаниями. Одну из гибридизуемых одноцепочных молекул предварительно метят (3,24, 25, 79, 90, 109).
Индикацию различных микроорганизмов и вирусов проводят с помощью специфичных генных зондов (4, 5, 16, 76, 89, 91, 105, 122, 131, 145, 148).
В настоящее время известны нуклеотидные последовательности, которые позволяют с высокой специфичностью проводить индикацию возбудителей заболеваний вирусной и бактериальной природы (27, 48, 112, 119,140,121, 152).
В качестве генных зондов для выявления токсигенных штаммов золотистого стафилококка применяются олигонуклеотиды локусов ДНК, кодирующие токсины (144, 148).
Для индикации микроорганизмов используют ДНК-зонды, содержащие гены рибосомальньгх ДНК (99, 130).
При индикации возбудителей используют также РНК-зонды, которые обладают некоторым рядом преимуществ: 1) отсутствие конкурентной гибридизации молекул зонда друг с другом; 2) высокий уровень введения метки по сравнению с продуктом ник - трансляции ДНК; 3) более высокая стабильность дуплексов ДНК-РНК, чем ДНК-ДНК.
Однонитевые РНК-зонды получают с помощью клонирующих векторов, содержащих SP6 или Т7 РНК-полимеразные промоторы (107, 133). Однако, РНК-зонды менее стабильны, чем ДНК-зонды (117). Для введения метки в ДНК используется метод ник-трансляции с помощью ДНК-полимеразы 1.
Методика рассеянной затравки основана на синтезе новой цепи ДНК с помощью ДНК полимеразы и комплиментарной матрицы. В качестве праймеров используются синтетические гексануклеотиды, инициирующие синтез ДНК со случайной последовательностью (70).
Наиболее часто для получения зондов применяется метод полимеразной цепной реакции (ПНР). Преимуществом данного метода является то, что метку можно ввести в зонд непосредственно в ходе ПЦР (27,125, 141, 146).
При получении ДНК-зондов для индикации возбудителей в микробиологической и вирусологической практике наиболее часто используют нерадиоактивную метку (78, 87, 102, 103, 135, 136).
В основе большинства способов введения метки лежат ферментативные реакции с участием нуклеозидтрифосфатов, ковалентно связанных с молекулой свидетелем (обычно биотином или дигоксигинином). После гибридизации меченые гибридные молекулы выявляют с помощью конъюгатов, субстратов и красителей (114, 126, 142).
Получение меченых ДНК-зондов с помощью полимеразной цепной реакции
Для получения меченых зондов готовили следующие реактивы: 20х реакционный буфер (20РБ): ЇМ KCI, 200 мМ трис-HCI, рН 8,3; 30 мМ MgCI, 0,2 % (в/о) желатина, по 4 мМ dAT D, dTT0 , агтФ. ДНК-матрица, смесь праймеров: по 20 мкМ каждого из S -npanMepoB, ыо-антФ, ДНК-полимераза Taq: 2 ЕД/мкл, минеральное масло, стоп-буфер: 300 мМ ЭДТА, рН 8,0. Для зондов, меченных биотином, использовали также реактивы со следующими изменениями: 20РБ: ЇМ KCI, 200 мМ трис-НСІ, рН 8,3; 30 мМ MgCI, 0,2 % (в/о) желатина, по 4 мМ dAT D, ёЦТФ, dITO; мМ сіТТФ; 1,4 мМ Ыо-11-ёУТФ. В микроценнтрифужную пробирку добавляли в указанном порядке следующие реактивы: 20 РБ 1мкл, вода 1 мкл, смесь праймеров 2 мкл, Ьіо-сіНТФ 15 мкл, ДНК-матрица 1 мкл (2нг). Пробирку помещали в термоцикл ер «Терцик». Смесь инкубировали при 93С, 10 минут. Добавляли ДНК полимеразы Taq 0,5 мкл (1ЕД). Дальнейшую реакцию амплификации проводили по следующей программе: і. Отжиг - 1 минут при 55С. 2. Элонгация- 1 минут при 72С. 3. Денатурация- 1 минут при 93С. Для получения зондов проводили 35-40 циклов ПЦР. Реакцию останавливали добавлением 2 мкл стоп-буфера. ДНК-зонд очищали от не включившейся метки переосаждением этанолом или хроматографией на сафедексе. Нерадиоактивное мечение проводили по той же схеме. Состав реакционной смеси включал реагенты в следующем порядке: 20хРБ (с bio-11 -сІУТФ) 1 мкл, смесь праймеров 23 мкл, ДНК-матрица 1 мкл (2нг), вода 16 мкл. Для получения и мечения ДНК-зондов методами ник-трансляции, рассеянной затравки и амплификации, использовали реагенты из коммерческих наборов «Amersham International ріс», Великобритания. Пробы сырья и продукции гомогенизировали физраствором, подращивали микроорганизмы в жидкой питательной среде. Бактерии осаждали центрифугированием, осадок гомогенизировали в буфере для лизиса с лизостафином. ДНК очищали обработкой протеиназой-К и хроматографией на сорбенте. При очистке с использованием сорбентов NucleoS или ЭкстраГен, содержимое пробирки перемешивали на ротаторе в течение 10 минут, затем центрифугировали 10 секунд при 5000g, надосадочную жидкость осторожно удаляли. К осадку добавляли 300 мкл промывающего реагента, тщательно перемешивали и центрифугировали в течение 10 секунд при комнатной температуре при 5000xg. Супернатант удаляли, и, к осадку добавляли 1 мл рабочего раствора солевого буфера. После добавления солевого буфера содержимое пробирки перемешивали до получения гомогенной суспензии и центрифугировали 10 секунд при 5000g при комнатной температуре. Супернатант осторожно удаляли. Отмывку солевым буфером проводили дважды. После этого, осадок подсушивали при температуре 65С не более 3 минут. Затем вносили 100 мкл элюирующего буфера. Суспендировали содержимое пробирки на вортексе 5-10 секунд до получения гомогенной суспензии, после чего, инкубировали 10-15 минут при комнатной температуре, или 3-4 минуты при 65С. Проводили повторное суспендирование и центрифугировали 2 минуты при 12000 g при комнатной температуре. Супернатант содержащий ДНК переносили в чистую пробирку и хранили при температуре минус 20С до использования. Исследуемую ДНК денатурировали в кипящей водяной бане в течение 5-10 минут, иммобилизовали на фильтры, предварительно обработанные раствором ЮхССР в виде точек, не допуская их перекрывания. Иммобилизованную ДНК фиксировали в течение 1 часа, при 80С. Проводили предгибридизацию и гибридизацию, как описано в предыдущем разделе. При этом в качестве ДНК-зонда использовали биотинилированную ДНК. Затем фильтры отмывали от несвязавшегося зонда трехкратной обработкой по 10 минут при комнатной температуре в промывочном растворе 1, содержащем 50 мл 20хССР, 10 мл 10% раствора ДСН и 440 мл дистиллированной воды. Далее осуществляли промывку в промывочном растворе 3, содержащем 50 мл 20хССР, 450 мл дистиллированной воды. Проводили «забивку» фильтров в течение 40 минут при 37С в растворе содержащем: 25 сухого молока, 22 мл раствора АР7.5, 3 мл 10% желатина. Раствор АР7.5 содержал: 5 мл 1 М MgCI2, 20 мл 5 М NaCI, 75 мл 1 М трис рН 9,5 в одном литре дистиллированной воды. Затем фильтры промывали в растворе АР7.5 и помещали в 6 мл рабочего раствора коньюгата стрептавидинфосфатазы на 15 минут, при комнатной температуре. Фильтры промывали три раза по 10 минут в растворе АР7.5 и 1 раз в течение 5 минут в растворе АР9.5. Затем фильтры инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 20-30 минут в проявляющемся растворе, содержащем: 4 мл раствора АР9.5, 17,6 мкл раствора хромогена тетразолия нитроголубого и 13,2 мкл раствора субстрата бромхлориндолилфосфата. Результаты гибридизации оценивали визуально или на фотометре «Эльфограф» при длине волны 500 нм по интенсивности окрашивания пятен, по сравнению с контрольными образцами.
Результаты мониторинговых исследований по выявлению Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций в биоматериале животных, в мясном сырье и субпродуктах
На первом этапе наших исследований мы проводили мониторинговый анализ выявления инфекций, вызванных Staphylococcus aureus в сырье животного происхождения, а так же Staphylococcus aureus и парвовирусом у домашних животных, находящихся в приютах и у частных лиц города Москвы. Определение золотистого стафилококка проводили по классическому микробиологическому методу, выявление возбудителя парвовирусного энтерита собак и кошек осуществляли с помощью тест-набора ИФА и ПЦР в соответствии с наставлениями к применению, утвержденными Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ. В опытах использовали мясное сырье и субпродукты, а также биоматериал: слизь из носа, половых органов, кровь, мочу, фекалии.
Биоматериал высевали на селективно-диагностические среды, и бактерии выращивали в течение 18-24 часов при 37С, и идентифицировали колонии Staphylococcus aureus по морфологическим признакам. При этом, имели в виду, что на Байрд-Паркер агаре, колонии Staphylococcus aureus выглядели черными, блестящими, 1,5-2,5 мм в диаметре, окруженные зоной лицитиназной активности; на молочно-солевом агаре - круглыми, возвышенными над поверхностью, диаметром 2,0-2,5 мм, окрашенными в желтый, золотистый, желтый или белый цвет; на яично-желточно-ацидном и яично-желточно-солевом агаре колонии окружены зоной лицитиназной активности.
Подозрительные колонии пересевали в пробирки на скошенный МПА (мясопептонный агар) и инкубировали при температуре 37С в течение 20-24 часов. Выросшие колонии окрашивали по Граму, определяли способность коагулировать плазму крови, образовывать каталазу и ферментировать мальтозу в анаэробных условиях (по ГОСТ 10444.2-94). Если в ходе исследований были обнаружены грамположительные кокки, обладающие каталазной и ферментативной активностью, способные коагулировать плазму крови, то считали, что выделенный микроорганизм относятся к Staphylococcus aureus. Результаты исследований представлены в таблице 1 и таблице 2.
Проведенные исследования показали, что заболеваемость стафилококкозом у домашних животных составляла 86,1%, парвовирусным энтеритом - 95,7% и совместных инфекций - 30,2% в 2008 году, и, соответственно, 82,3% , 99,0% и 48,3% - в 2009 году
При определении золотистого стафилококка в мясе и субпродуктах процент контаминированных проб был значительно ниже, чем в биоматериале животных и составлял 10-16,2%.
При ветсанэкспертизе сырья животного происхождения существует необходимость дифференциации стафилококковой инфекции от других возбудителей бактериальной природы (синегнойной палочки, сальмонелл, стрептококков).
При диагностике стафилококкозов также возникает необходимость дифференциации этой бактериальной инфекции от возбудителей вирусной этиологии, в частности, от парвовируса.
Стафилококковые и парвовирусные инфекции наиболее часто встречаются у домашних животных. Причем часто, парвовирус может осложняться вторичной стафилококковой инфекцией и наоборот. При патологоанатомическом вскрытии обнаруживаются сходные изменения внутренних органов ( легкие, тонкий отдел кишечника) (рис. 1,2).
На рисунках внутренних органов видны патологоанатомические изменения - обширные кровоизлияния и отек легких, острое катарально-геморрагическое воспаление слизистой оболочки тонкого отдела кишечника с участками некроза, вызванные парвовирусной инфекцией осложненной золотистым стафилококком.
Заболевания, вызванные смешанными инфекциями, определили направления наших исследований по разработке методов ускоренной одновременной диагностике возбудителей.
Нами разработаны модифицированные методики амплификации для определения Staphylococcus aureus и сопутствующих инфекций в биоматериале животных, мясном сырье и субпродуктах.
В первом варианте мы разработали модификацию метода на основе ПНР выделенных из исследуемого материала матричных ДНК с последующей ДНК-гибридизацией с меченными биотином ДНК-зондами. Пробы гомогенезировали буфером, проводили осаждение крупных частиц центрифугированием. К супернатанту добавляли лизостафин (для лизиса стафилококка), протеиназу К, ДНК-парвовируса и Staphylococcus aureus, очищали на сорбенте и добавляли в инкубационную смесь для ПНР, содержащую дезоксинуклеозидтрифосфаты и праймеры для парвовируса и Staphylococcus aureus. В качестве праймеров для индикации Staphylococcus aureus были выбраны ранее используемые нуклеотидные последовательности: Sa442-1 (5Ч-ААТ СТТ TGT CGG ТАС ACG АТА ТТС ТТС ACG-3\ позиция с 5 по 34; Sa442-2 (5 -CGT GAG ATT TGA GAT AAT АСА ACA-3\ позиция с 83 по 112 {66)
Ампликоны иммобилизовали на мембранные фильтры и гибридизовали с меченными биотином специфичными ДНК-зондами. ДНК-зонды предварительно получали в ПНР с меченными биотином дезоксинуклеозидтрифосфатами. После реакции с конъюгатом, субстратом и красителем по визуальной оценке окрашенных пятен с гибридными молекулами определяли возбудители. Схема определения представлена на рисунке 3.
