Введение к работе
Актуальность проблемы. В результате экологического воздействия на возбудителя бруцеллеза антропогенных факторов (длительная персистенция в организме носителей, промежуточных хозяев, длительное хранение музейных культур, широкое применение антибиотиков и дезинфицирующих средств, массовая вакцинация животных), участились случаи появления измененных форм бруцелл, в частности R- и L-форм (Триленко П.А., 1976; Проворский С.В. с соавт., 1981; Хузин Д.А., 1990; Плотникова Э.М. с соавт., 1994).
Известно, что в процессе хранения музейных культур эпизоотических и вакцинных штаммов нередко происходят изменения как фенотипических, так и генетических характеристик, отражаясь на основных свойствах - вирулентности эпизоотических штаммов и иммуногенности вакцинных штаммов. Определение принадлежности таких атипичных культур к роду Brucella, а также их дифференциация от антиген - родственных гетерологических микроорганизмов, а также иммуногенности вакцинных штаммов по общепринятым методам весьма трудоемки, продолжительны и требуют значительных материальных затрат (Салмаков К.М. с соавт., 2008).
Успешное решение проблемы бруцеллеза возможно только при внедрении в широкую практику эффективной научно-обоснованной системы мероприятий с использованием наиболее совершенных средств и методов диагностики и специфической профилактики болезни, актуальность разработки которой возрастает в последнее время с учетом изменения форм ведения сельского хозяйства (Иванов А.В. с соавт., 2009).
Важное место в комплексе противобруцеллезных мероприятий занимает специфическая профилактика (Иванов А.В. с соавт., 2008; Иванов А.В. с соавт., 2012). В последние годы в нашей стране широко используется вакцина из слабоагглютиногенного штамма B.abortus 82. В ряде мест ее применение способствовало достижению определенных успехов в борьбе с бруцеллезом крупного рогатого скота (Салмаков К.М., 1980; Никифоров И.П. с соавт., 1981; Исхаков О.З. с соавт., 1981, 1986; Черкасов В.В., Ростов А.П., 1981; Косилов И.А. с соавт., 1986). Однако существенным недостатком этой вакцины является ее высокая реактогенность, обуславливающая большой процент абортов у стельных животных (Шумилов К.В. с соавт., 1983; Скляров О.Д., с соавт., 2004). Кроме того, при проведении противобруцеллезных мероприятий (иммунопрофилактика и антибиотикотерапия) в очагах инфекции с использованием указанной вакцины и антибиотиков резко снижается лечебно-профилактический эффект этих средств, что связано с губительным действием применяемых антибиотиков не только на возбудителя инфекции, но и на вакцинные штаммы бруцелл. Использование для этих целей пенициллинчувстви-тельного (B.abortus 82 Пч) и стрептомицинрезистентного (B.abortus 82 St) вариантов шт. 82, также малоэффективно, поскольку эти антибиотики при бруцеллезе малоэффективны и, во-вторых, они высокотоксичны (Кайтмазова Е.И., 1962).
Наиболее перспективным в этом направлении является использование антибиотиков широкого спектра действия, в частности ципролета, который является гораздо менее токсичным и обладает более широким терапевтическим действием (Плотникова Э.М. с соавт., 2009).
Учитывая, что оценка иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл на сегодняшний день несовершенна, поскольку она предполагает обязательное последующее заражение иммунизированных животных вирулентным штаммом возбудителя бруцеллеза, диктуется необходимость проведения исследований в этом направлении (Григорьева Г.И. с соавт., 1998).
Из вышеуказанного следует, что разработка простых и надежных методов идентификации бруцелл (в т.ч. измененных форм) и определение иммуногенности вакцинных штаммов с использованием достижений современной биотехнологии (состава мембранных белков, гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК, а также по способности синтеза медиаторов иммуногенеза-цитокинов), является актуальной задачей ветеринарной медицины.
Цель и задачи. Целью исследований явилось изучение влияния различных факторов на фено-, генотипические свойства бруцелл и разработка экспресс - метода оценки их иммуногенности.
Исходя из цели, на решение проблемы были поставлены следующие задачи:
- изучить культурально-морфологические и биохимические свойства музейных и эпизоотических штаммов бруцелл;
- изучить полипептидный состав экзобелков бруцелл;
- провести сравнительный анализ степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК музейных штаммов и изолятов, выделенных из организма животных-носителей возбудителя;
- разработать и апробировать способ оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл по их цитокининдуцирующей способности.
Научная новизна. Впервые изучены в сравнительном аспекте культурально - морфологические, биохимические, антигенные свойства, полипептидный состав и степень гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК 58 культур бруцелл производственных, музейных штаммов и изолятов, выделенных из организма носителей возбудителя животных.
Дана сравнительная оценка эффективности методов оценки фенотипических и генотипических характеристик различных штаммов бруцелл для их достоверной идентификации и дифференциации.
Установлена корреляция между иммуногенностью вакцинных штаммов и их способностью индуцировать синтез медиаторов иммуногенеза - цитокинов. Предложен способ использования цитокинового профиля сывороток привитых испытуемыми штаммами животных в качестве оценочного критерия иммуногенности потенциальных вакцинных препаратов.
Практическая значимость. На основании изучения фенотипических, генотипических и цитокининдуцирующих свойств различных штаммов бруцелл получен антибиотикорезистентный вариант - B.abortus 82Ц и предложен для дальнейшего изучения как перспективный штамм в качестве исходного для получения вакцины против бруцеллеза животных.
Предложен для практики способ экспресс - метода оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл путем определения цитокинового профиля сывороток крови животных, иммунизированных испытуемыми вакцинными препаратами.
Результаты исследований использованы при составлении «Методических рекомендаций по индикации и дифференциации отдельных видов бруцелл с использованием полимеразной цепной реакции в реальном времени», утв. директором ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» проф. Ивановым А.В. 11 октября 2011 г.; «Методических указаний по применению иммуноферментного анализа (ИФА) для серодиагностики бруцеллеза» и «Временной инструкции по изготовлению и контролю набора диагностических препаратов для дифференциальной диагностики бруцеллеза», утв. начальником Главного управления ветеринарии КМ РТ Камаловым Б.В. 26 июля 2011 г.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на научных сессиях Ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2008 - 2012 гг., на Международных научно-практических симпозиумах и конференциях (г. Саратов, 2011; г. Москва, 2012).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Основные положения, выносимые на защиту:
- фенотипические и генотипические характеристики штаммов бруцелл в зависимости от персистенции в различных условиях;
- разработка способа экспресс - метода оценки иммуногенности вакцинных штаммов бруцелл методом иммуноферментного анализа;
- результаты апробации эффективности способа оценки иммуногенности полученного штамма B.abortus 82Ц.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 198 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов исследований, выводов, практических предложений и приложений.
Материалы диссертации иллюстрированы 26 таблицами и 11 рисунками. Список литературы содержит 277 наименований работ, в том числе - 89 зарубежных авторов.
