Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 28
1.1 Ротавирусная диарея новорожденных телят и поросят 28
1.2 Коронавирусная диарея новорожденных телят и поросят .42
1.3 Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота 55
1.4 Эшерихиозная диарея новорожденных телят и поросят 61
1.5 Особенности иммунной системы новорожденных телят и поросят 68
1.6 Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота 72
2 Результаты собственных исследований 80
2.1 Этиологическая структура инфекционных диарей новорожденных телят и поросят в регионах Среднего Поволжья и Предуралья 80
2.2 Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения ассоциированной вакцины и полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят 101
2.2.1 Биологические свойства штаммов микроорганизмов, используемых при изготовлении ассоциированной вакцины и полиспецифической сыворотки .101
2.2.2 Лабораторный регламент изготовления ассоциированной вакцины против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят, контроль ее стерильности, безвредности и антигенной активности 104
2.2.3 Определение прививной дозы ассоциированной вакцины для глубокостельных коров и нетелей .111
2.2.4 Изучение иммуногенной активности ассоциированной вакцины в экспериментальных условиях 112
2.2.5 Оценка эффективности применения ассоциированной вакцины в производственных условиях 118 2.3 Разработка гипериммунной сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят .119
2.3.1 Изыскание оптимальной схемы гипериммунизации быков-продуцентов рота-, корона-, герпесвирусными и эшерихиозными антигенами 119
2.3.2 Оценка безвредности, стерильности и специфической активности гипериммунной сыворотки .123
2.3.3 Определение оптимальной лечебной и профилактической дозы гипериммунной сыворотки для телят 125
2.3.4 Испытание лечебно-профилактической эффективности гипериммунной сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи телят в экспериментальных и производственных условиях. 128
2.4 Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения ассоциированной вакцины и полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят .137
2.4.1 Биологическая характеристика производственных штаммов микроорганизмов, используемых для изготовления ассоциированной вакцины и полиспецифической гипериммунной сыворотки 137
2.4.2 Лабораторный регламент изготовления ассоциированной вакцины против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят, контроль ее стерильности, безвредности и антигенной активности .141
2.4.3 Определение прививной дозы ассоциированной вакцины для супоросных свиноматок .148
2.4.4 Изучение антигенной и иммуногенной активности ассоциированной вакцины в экспериментальных условиях 149
2.4.5 Оценка эффективности ассоциированной вакцины в производственных условиях 152 2.5 Разработка полиспецифической лечебно-профилактической сыворотки против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи просят 154
2.5.1 Отработка оптимальной схемы гипериммунизации свиней-продуцентов
рота-, коронавирусными и эшерихиозными антигенами .154
2.5.2 Оценка безвредности, стерильности и специфической активности гипериммунной сыворотки 160
2.5.3 Определение оптимальной лечебной и профилактической дозы гипериммунной сыворотки при рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят 160
2.5.4 Испытание лечебно-профилактической эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки в производственных условиях 162
2.6 Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1 166
2.6.1 Этиологическая структура инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в отдельных регионах Российской Федерации 166
2.6.2 Разработка технологии изготовления ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1 181
2.6.3 Лабораторный регламент изготовления ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота .183
2.6.4 Оценка эффективности применения ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в производственных условиях 189
2.7 Разработка «Набора препаратов для выявления специфических антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа (ИКК-СЕРОТЕСТ) .192
Заключение 197
Рекомендации производству 226
Список сокращенных терминов 227
Список использованной литературы 229
Список иллюстрированного материала
- Коронавирусная диарея новорожденных телят и поросят
- Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения ассоциированной вакцины и полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят
- Оценка безвредности, стерильности и специфической активности гипериммунной сыворотки
- Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Практика работы животноводческих комплексов как в Российской Федерации, так и за её пределами показывает, что большой экономический ущерб сельскохозяйственным предприятиям наносят болезни желудочно-кишечного тракта новорожденных телят и поросят, которые обусловлены нарушениями параметров микроклимата в помещениях, нерациональным кормлением и содержанием глубокостельных коров и супоросных свиноматок, а также возбудителями различных инфекционных заболеваний вирусной и бактериальной природы [2, 5, 6, 11, 12, 15, 16].
Установлено, что важную этиологическую роль в возникновении желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят и поросят играют рота-, коронавирусы, эшерихии коли, клостридии и др. Данные литературных источников и результаты многолетних исследований сотрудников ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» свидетельствуют о том, что эти инфекции часто протекают в смешанной форме [10,12,14]. При этом заболеваемость телят и поросят в первые дни жизни составляет более 70%, а отход – 80-90% от числа заболевших. В настоящее время главным направлением борьбы с указанными болезнями является активная иммунизация стельных коров и супоросных свиноматок, с молозивом и молоком от которых специфические антитела поступают в организм новорожденных и обеспечивают их защиту. Однако, по различным причинам некоторые животные после рождения не получают в необходимом количестве эту естественную защиту, что связано с недостаточным поступлением иммуноглобулинов с молозивом матери, несвоевременным и недостаточным получением молозива или нарушением механизма абсорбции иммуноглобулинов молозива кишечником новорожденных. Неполноценное кормление беременных животных также обуславливает образование иммунодефицитного молозива, которое не обеспечивает у новорожденных животных иммунитета достаточной напряженности, возникает гипоиммуноглобулинемия, что ведет к возникновению заболеваний, протекающих с признаками диареи. В этих случаях для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний необходимо применять гипериммунные сыворотки. В этой связи разработка ассоциированных вакцин и полиспецифических лечебно-профилактических гипериммунных сывороток против основных возбудителей желудочно-кишечных болезней телят и поросят остается весьма актуальной.
В последние годы в РФ получил широкое распостранение инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота, вызываемый бактериями Moraxella bovis [7]. Болезнь наносит скотоводческим хозяйствам значительный экономический ущерб за счет выбраковки животных, потери племенной ценности, снижения удоев и прироста массы тела, затрат на проведение лечебных и оздоровительных мероприятий.
В связи с вышеизложенным возникла необходимость разработки биологических препаратов для специфической профилактики и лечения смешанных вирусно-бактериальных форм диареи новорожденных телят, поросят, а также инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.
Степень разработанности проблемы. В Российской Федерации разработаны различные моновалентные и ассоциированные вакцины против желудочно-кишечных заболеваний молодняка сельскохозяйственных животных, которые применяются в различных регионах [1, 3, 4, 8, 9, 13,14]. Несмотря на это, во многих хозяйствах заболеваемость новорожденных телят и поросят желудочно-кишечными заболеваниями остается довольно высокой. В отдельных хозяйствах она достигает до 100%. В этих случаях для лечения и повышения общей резистентности организма новорожденных животных применяются различные иммуностимулирующие препараты и гипериммунные лечебно-профилактические сыворотки. Основным недостатком существующих гипериммунных сывороток является то, что в их составе отсутствуют специфические антитела против рота-, коронавирусов, что значительно снижает их лечебно-профилактическую эффективность при смешанных формах инфекционных диарей новорожденных телят и поросят.
В мировой практике для специфической профилактики инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота используется ряд вакцин, отличающихся по принципам получения и по методу проведения вакцинации. В РФ вакцина против инфекционного кератоконъюнктивита не разработана.
В связи с вышеизложенным возникла необходимость разработки биологических препаратов для специфической профилактики и лечения смешанных вирусно-бактериальных форм диареи новорожденных телят, поросят, а также инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.
Цель и задачи. Целью исследований явилось изучение этиологической структуры желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят и поросят, инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота, разработка способов их лечения и специфической профилактики. Для выполнения вышеуказанной цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить этиологическую структуру желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят и поросят, инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в регионах Среднего Поволжья и Предуралья;
-
Разработать технологии изготовления ассоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят и поросят;
-
Разработать технологию изготовления ассоциированной вакцины
против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1;
-
Изучить эффективность ассоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток в лабораторных и производственных условиях;
-
Разработать нормативные документы, регламентирующие изготовление, контроль и применение ассоциированных вакцин и гипериммунных лечебно-профилактических сывороток для внедрения их в ветеринарную практику.
Научная новизна. На основании результатов клинико-эпизоотологичского монторинга инфекционных заболеваний новорожденных телят и поросят сельскохозяйственных предприятий регионов Среднего Поволжья и Предуралья показано, что диарея новорожденных телят и поросят протекает преимущественно в виде смешанной инфекции. Основными этиологическими агентами при этом являются рота-, корона-, герпесвирусы, энтеротоксигенные штаммы Е. соli, синтезирующие адгезивные антигены К88, К99, А20 и 987Р, Cl. perfringens и др.
Установлено, что до 73,1% патогенных штаммов E. coli, вызывающие эшерихиозы новорожденных животных, продуцируют различные адгезивные антигены. Наиболее часто у больных колибактериозом новорожденных телят до 10-дневного возраста встречаются возбудители с адгезивными антигенами А20 и К99, у поросят – с адгезивными антигенами К88, 987Р и К99.
Отработан режим культивирования на перевиваемых линиях культур клеток производственных штаммов рота-, корона-, герпесвирусов в круговом монослое роллерной установки, позволяющий получить вирусную суспензию с высокой биологической активностью.
Обоснована необходимость разработки ассоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток для специфической профилактики и лечения рота-, корона-, герпесвирусных, эшерихиозных диарей новорожденых телят и поросят, а также вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота.
Впервые в РФ разработаны и освоены технологии изготовления ассоциированных вакцин и полиспецифических сывороток для специфической профилактики и лечения смешанных форм инфекционной диареи новорожденных телят и поросят на основе наиболее часто выявляемых в регионах Среднего Поволжья и Предуралья этиологических агентов, а также вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1.
Проведена оценка эффективности ассоциированных вакцин и полиспецифических сывороток против инфекционных диарей новорожденных телят и поросят, а также вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в экспериментальных и производственных условиях. Подтверждена их эффективность в лабораторных и производственных условиях.
Новизна и приоритет научных исследований диссертационной работы подтверждены 7 Патентами РФ на изобретения.
Теоретическая и практическая значимость. На основании результатов исследований разработаны и предложены для внедрения в ветеринарную практику новые эффективные биологические препараты для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят, поросят и инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота:
– Вакцина против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят (Патент РФ №2145236 от 10.02.2000 г);
– Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, корона-, герпесвирусов и Е. соli (А20, К99) новорожденных телят (Патент РФ №2145504 от 20.02.2000 г);
– Вакцина против рота-, коронавирусного гастроэнтерита (ТГС) и эшерихиозной диареи новорожденных поросят (Патент РФ №2137499 от 20.09.1999 г);
– Полиспецифическая гипериммунная сыворотка против рота-, коронавирусного гастроэнтерита и эшерихиозной диареи новорожденных поросят (Патент РФ №2456998 от 27.07.2012 г);
– Вакцина ассоциированная против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов Moraxella bovis и герпесвируса типа 1 (Патенты РФ №2145353 от 10.02.2000 г и №2264227 от 20.11.2005 г).
Разработан набор препаратов для выявления антител к бактериям Moraxella bovis методом иммуноферментного анализа.
Материалы исследований вошли в 18 нормативных документов, регламентирующих изготовление, контроль и применение вышеперечисленных биологических препаратов.
Методология и методы исследований. Работа выполнена в период с 1993 по 2013 гг. в лаборатории по изучению болезней молодняка ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань), результаты исследований апробированы в сельскохозяйственных предприятиях Среднего Поволжья и Предуралья, неблагополучных по желудочно-кишечным заболеваниям новорожденных телят и поросят, а также инфекционному кератоконъюнктивиту крупного рогатого скота. Отдельные этапы работы были выполнены с участием кандидатов наук Ефимовой М.А., Валебной Л.В., Дуплевой Л.Ш., Романова Е.А., Махмутова А.Ф. и Саттаровой Н.В., которым выражаю искреннюю признательность.
В поцессе выполнения работы по разработке ассоциированных вакцин и полиспецифических лечебно-профилактических сывороток были использованы штаммы возбудителей:
– бактерии Е. соli: «ПЗ-3» – синтезирующий адгезивный антиген А20; «КВ-1» – синтезирующий адгезивный антиген К99; «ПЛ-6» – синтезирующий адгезивный антиген К88; «УК- 2» – синтезирующий адгезивный антиген 987Р;
– бактерии Moraxella bovis: штаммы «Г97-ВНИВИ» и «ШЗ-01»;
– ротавирус крупного рогатого скота – штамм «Ш-1»;
– коронавирус крупного рогатого скота – штамм «СМ-1»;
– герпесвирус типа 1 – штаммы «ТКА-ВИЭВ-В2» и «Оксфорд»;
– ротавирус свиней – штамм «Пугачевский 92».
– вирус трансмиссивного гастроэнтерита свиней – штамм «ВГНКИ-5».
Эксперименты проведены на 1256 белых мышах массой 14-16 г, 160 кроликах массой 2,5-3,0 кг, 3292 свиньях, 986 коровах и телятах разного возраста и физиологического состояния.
Использованы диагностические наборы для: выявления антигенов вируса трансмиссивного гастроэнтерита (ТГС) и ротавируса свиней методом иммуноферментного анализа; выявления антител к вирусу трансмиссивного гастроэнтерита свиней иммуноферментным методом «ТГС-СЕРОТЕСТ»;
диагностики коронавирусного энтерита крупного рогатого скота методом гемагглютинации; диагностики ротавирусного энтерита крупного рогатого скота методом иммуноферментного анализа; серологической иммуноферментной диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота «Диарин-С»; определения специфических антител к бактериям Moraxella bovis «ИКК-СЕРОТЕСТ», набор «О» - коли агглютинирующих сывороток; антиадгезивные коли-сыворотки К88, К99, 987Р, А20, F41 «Колиадгезин-тест».
Клинико-эпизоотологическому обследованию подвергнуто поголовье крупного рогатого скота и свиней в 152 сельскохозяйственных предриятиях, расположенных в регионах Среднего Поволжья и Предуралья. Анализ эпизоотической ситуации в неблагополучных хозяйствах проводили согласно рекомендациям, разработанными Бакуловым И.А. и соавт. (1975) и методами эпизоотологического исследования, предложенными Джупиной С.И. (1991).
Для культивирования вирусов использовали перевиваемые культуры клеток: МДВК – для коронавируса крупного рогатого скота, СПЭВ – для ротавируса крупного рогатого скота и свиней, ППК – для вируса ТГС, ТR - для вируса инфекционного ринотрахеита (герпесвируса типа 1). При этом в качестве поддерживающих сред использовали гидролизат лактоальбумина (ГЛА), среду 199 с добавлением глутамина, трипсина и антибиотиков.
Уровень клеточного иммунитета вакцинированных животных определяли по процентному соотношению Т- и В-лимфоцитов. Идентификацию их проводили в одном препарате по образованию реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами (Е-РОК) и розеткообразования лимфоцитов с зимозаном (ЗС3-РОК) (Блинов Н.И., 1985).
Антигенную активность ассоциированных вакцин контролировали путем введения вакцины кроликам и восприимчивым животным и последующего определения титров специфических антител в их сыворотках крови.
Производственное испытание экспериментальных серий ассоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток проводили в хозяйствах, неблагополучных по инфекционным диареям новорожденных телят и поросят, а также по инфекционному кратоконъюнктивиту крупного рогатого скота. Эффективность вакцин и гипериммунных сывороток оценивали по количеству заболевших и павших телят, поросят от желудочно-кишечных заболеваний, по титрам специфических антител и функционально-метаболической активности лейкоцитов, сравнивая эти показатели до и после начала применения биопрепаратов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Этиологическая структура желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят и поросят в регионах Среднего Поволжья и Предуралья;
-
Технологии изготовления ассоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток против рота-, корона-, герпесвирусных и эшерихиозных диареи новорожденных телят и поросят;
-
Иммунобиологические показатели ассоциированных вакцин: стерильность, безвредность, антигенная и иммуногенная активность, профилактическая эффективность;
-
Иммунобиологические показатели полиспецифических гипериммунных сывороток: бактерицидные и превентивные свойства, содержание специфических антител, лечебно-профилакическая активность;
-
Этиологическая структура инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в регионах Среднего Поволжья и Предуралья;
-
Технология изготовления ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1;
-
Иммунобиологические показатели ассоциированной вакцины: безвредность, антигенная и иммуногенная активность, профилактическая эффективность.
Степень достоверности и апробация результатов. Экспериментально полученный цифровой материал обрабатывали методом вариационной статистики с применением пакета прикладных программ Microsoft Excel.
Материалы диссертации доложены, обсуждены и получили положительную оценку на ежегодных заседаниях Ученого совета ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» при обсуждении отчетов о НИР за 1993-2013 гг.; Международных и Всероссийских научно-практических конференциях (Владимир, 2003; Воронеж, 1997, 2002; Казань, 1992, 1998, 2000, 2011, 2012; Киров, 2003; Краснодар. 2011; Краснообск, 2010; Курск, 2010; Львов, 2009, 2013; Москва, 1996, 1997, 2001, 2010, 2011; Новосибирск, 1991; Покров, 2008; С.-Петербург, 2004; Ульяновск, 2010; Уфа, 2000, 2014; Харьков, 2011; Щелково, 2000, 2003, 2004, 2005).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 76 научных работ, из них 25 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в том числе 7 патентов РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 328 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, заключение, рекомендации производству, список использованной литературы, состоящий из 374 источников, в том числе – 86 иностранных авторов и приложения. Диссертация содержит 48 таблиц и иллюстрирована 5 рисунками.
Коронавирусная диарея новорожденных телят и поросят
Ротавирусная диарея новорожденных телят - инфекционная остро протекающая болезнь, характеризующаяся поражением желудочно кишечного тракта, обшей интоксикацией и обезвоживанием организма [249]. Возбудитель. Ротавирусы представляют собой род семейства Reoviridae, который объединяет большое количество сходных по морфологии и антигенной структуре вирусов, вызывающих энтериты (диареи) у новорожденных животных и птиц.
Впервые обнаружены у больных диареей телят [344], а затем у человека и разных видов животных. Они входят в состав семейства Reoviridae, которое включает 6 родов: реовирусы, орбивирусы, ротавирусы, фитореовирусы, фидживирусы и циповирусы. Ротавирусы человека, животных и птиц подразделяются на 7 групп: A, B, C, D, E, F и G, различающихся серологически и по электрофореграммам вирусной РНК [200]. Чаще всего ротавирусные инфекции вызывают «типичные» изоляты, составляющие наиболее многочисленную группу А. Эти вирусы независимо от их видовой принадлежности содержат общие групповые антигены, обнаруживаемые с помощью различных иммунологических тестов [314].
Ротавирусы крупного рогатого скота подразделяют на 3 серотипа. Эталонными штаммами являются NCDV(1), R78/81(2), A2/77(3) [314].
Ультраструктура вириона. Семейство реовирусов характеризуется уникальной структурой белковой оболочки – капсида. Не имея липопротеиновой мембраны, они содержат две белковые оболочки – наружный и внутренний капсиды. Капсомеры последнего достигают наружного слоя, придавая вирусной частице при электронной микроскопии форму колеса, в котором наружный капсид является ободом, а капсомеры внутреннего, радиально отходящего от сердцевины, – спицами. Эта композиция четко выражена у семейства реовирусов в целом и, особенно у рода ротавирусов, получивших соответствующее название (rota – по-латыни «колесо») [201].
Ротавирусы не имеют суперкапсидной липопротеиновой оболочки и не содержат липидов, что обуславливает устойчивость к эфиру, хлороформу и детергентам. Ротавирусы быстро инактивируются фенольными соединениями, крезолом, формалином. Самым эффективным дезинфектантом является этиловый спирт. Протеолитические ферменты (панкреотин, трипсин) усиливают инфекционную активность вируса и их применяют при культивировании вируса в культурах клеток. Инфекционная активность устойчива в диапозоне рН 3-9. Ротавирусы сохраняют инфекционность в течение нескольких месяцев при 40С и даже при 200С, если они хранятся в присутствии стабилизатора [314].
Некоторые штаммы имеют гемагглютинины и агглютинируют эритроциты морских свинок, крыс и эритроциты человека О-группы. В перекрстной реакции нейтрализации выявлено родство между ротавирусами обезьян и свиней, а также между ними и ротавирусами крупного рогатого скота.
Сравнительное изучение антигенных свойств ротавирусов свиней, телят, ягнят, кроликов, жеребят и других животных методами иммунофлюоресценции, реакции нейтрализации, электронной микроскопии, в реакции связывания комплемента, полимеразной цепной реакции показало, что они обладают одним или несколькими общими групповыми антигенами. Вирус репродуцирует в первичной культуре клеток почки пороснка и в перевиваемых клеточных линиях ПК-15, МА-104 и других [31].
Эпизоотология. Ротавирусная диарея телят широко распространена в странах с развитым скотоводством, особенно в крупных животноводческих комлексах [192, 299]. По распространенности и тяжести клинических проявлений она занимает первое место среди вирусных гастроэнтеритов телят [90, 200, 343, 344, 351]. По разным литературным источникам заболеваемость телят при ротавирусной инфекции варьирует от 30 до 100% [90, 131, 315, 360]. Смертность при этом составляет от 8 до 50% [128, 254, 343]. Ротавирусной диареей обычно болеют телята первых двух недель жизни. Гибель в большинстве случаев происходит на 2–6 сутки после рождения и реже в более старшем возрасте. Наибольшее количество ротавируса в фекалиях обнаруживается у 2-3-х дневных больных диареей телят [57]. Одним из основных факторов, обуславливающих ряд эпизоотологических особенностей ротавирусных инфекций у телят, является черезвычайно высокое содержание ротавирусов (1010-1012 частиц/мл) в инфицированных фекалиях и резистентность их к инактивации. Эти факторы обуславливают высокую и практически постоянную контаминацию ротавирусами внешней среды [343, 361].
Клинические признаки и патологоанатомические изменения.
Инфекция клинически проявляется у телят в виде рецидирущей диареи. Заболеваемость достигает 90%, смертность – 5-25% [77, 204]. Наиболее часто болезнь регистрируют поздней зимой и ранней весной. Телята заражаются в первые часы после рождения. У заболевших в первые дни жизни телят наблюдаются диарея, атония, слабость, отказ от воды. В отсутствие сопутствующих заболеваний РВИ телят вызывает энтерит, который связан с незначительными изменениями крови и может сопровождаться легко проходящей диареей. Клинически болезнь у телят характеризуется депрессией, потерей аппетита, диареей. Отмечают западение глаз, дегидратацию и фибрилляцию мышц конечностей, истечение вязкой слюны, тахикардию, коматозное состояние [19, 141]. Цвет фекалий зависит от вида корма. Температура тела иногда поднимается до 41ОС. Если инфекция не осложняется Е.соli, то через 2-3 дня телята выздоравливают. Чем моложе теленок, тем продолжительнее диарея [225].
При патологоанатомическом исследовании основные изменения отмечаются в тонком кишечнике. Стенки кишечника истончены, слизистая оболочка гиперемирована, обнаруживают геморрагии. Мебус (1974) указывает, что верхушки ворсинок часто обнажаются, увеличивается количество ретикулоподопных клеток. В отдельных участках кишечника ворсинки полностью исчезают, крипты укорачиваются, ворсинки становятся неоднородными, форма эпителиальных клеток изменяется (они принимают кубическую форму), в них появляются вирионы, что ведет к изменению функции клеток. Поступающее в кишечник молоко не переваривается, накапливается в пищеварительном тракте, обуславливая появление диареи. По мере накопления вирус выходит из клеток ворсинок. При этом отмечается увеличение мезентериальных лимфатических узлов, иногда их дегенеративно-некротические поражения. При гистологическом исследовании обнаруживается некротический энтерит. Наблюдается деструкция ворсинок кишечника. У переболевших животных изменения в кишечнике исчезают через 8-10 сут после начала заболевания.
Диагноз. Ставят его комплексно на основании эпизоотологических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений, но основной метод диагностики – лабораторные исследования, включающие методы электронной и иммуноэлектронной микроскопии. В лабораторию направляют не менее 10 проб жидких фекалий, взятых от 2-14-дневных телят с клиническими признаками диареи на 1-3-й день заболевания, а также от трупов – тонкий кишечник с содержимым (не позднее 2-3 ч с момента гибели или вынужденного убоя), 10-15 проб парных сывороток крови больных и переболевших животных, а также 6-10 проб крови и молока коров. Для вирусологических и электронно-микроскопических исследований готовят 10%-ную суспензию фекалий на растворе Хенкса.
Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения ассоциированной вакцины и полиспецифической гипериммунной сыворотки против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят
При изготовлении ассоциированной вакцины и полиспецифической сыворотки использовали производственные штаммы вирусов: «Ш-1» ротавируса крупного рогатого скота, «СM-1» коронавируса крупного рогатого скота, «ТКА ВИЭВ-В2» – герпесвируса крупного рогатого скота, а также 2 энтеротоксигенных штамма E.соli: «КВ-1» и «ПЗ-3», продуцирующие соответственно адгезивные антигены К99 и А20. Эпителиотропный штамм «Ш-1» ротавируса крупного рогатого скота возбудитель диареи у новорожденных телят - выделен в 1993 году Спиридоновым Г.Н. и Гаффаровым Х.З. от больного диареей новорожденного теленка из колхоза «Серп и молот» Высокогорского района Республики Татарстан. Штамм отнесен к сем. Reoviridae, роду Rotavirus, виду Rotavirus calves. Репродуцируется в культуре перевиваемых клеток почки эмбриона свиньи (линия СПЭВ) при 37-380С в течение 24-49 часов. Имеет инфекционную активность : на перевиваемой культуре клеток почки эмбриона свиньи (линия СПЭВ) 106,0 ТЦД50/см3 в лиофилизированном и 107,8 ТЦД50/см3 в нативном материалах, обладает высокой антигенной активностью в РНГА и ИФА, имеет группоспецифический и видоспецифический антигены. Штамм производственный, депонирован 28 декабря 2000 г. во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123002, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ), предложен для изготовления вакцины. Регистрационная ссылка (номер) – штамм «Ш-1-ВНИВИ (г. Казань)-ДЕП».
Штамм «Ш-1» устойчив к липидным растворителям, эфиру, хлороформу. Инфекционная активность устойчива в диапазоне рН 3-9. Вирулентность возбудителя сохраняется в течение нескольких месяцев при 40С, быстро инактивируется фенольными соединениями, крезолом, формалином.
Штамм «Ш-1» вызывает у новорожденных телят диарею при пероральном методе заражения в дозе 5 см3. Заболевание характеризуется выделением жидких фекалий водянистой консистенции светло-желтого цвета. При отсутствии лечения новорожденные телят обычно погибают в течение первых 3-7 дней. Вирусологические исследования по выделению ротавируса показали, что возбудитель в наибольшей концентрации содержится в тонком отделе кишечника и в фекалиях. Штамм «СM-1» - возбудитель коронавирусной диареи новорожденных телят, выделен от павшего новорожденного теленка из колхоза «Серп и Молот» Высокогорского района Республики Татарстан в 1993 г. Гаффаровым Х.З., Спиридоновым Г.Н. и Елисеевой Ф.В. Штамм отнесен к сем. Coronaviridae, роду Coronavirus, виду Coronavirus calves. Штамм репродуцируется на перевиваемой культуре клеток почки эмбриона коровы (линия МДВК), имеет инфекционную активность 105,0 ТЦД50/см3 в лиофилизированном и 105,8 ТЦД50/см3 в нативном материалах, обладает высокой антигенной активностью в РН и РТГА, имеет группоспецифический и видоспецифический антигены. Штамм производственный и предложен для изготовления вакцины.
Штамм депонирован 28 ноября 2000 г. Регистрационная ссылка (номер) – штамм «СМ-1-ВНИВИ-ДЕП» возбудителя коронавирусной диареи телят во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123002, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ).
Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу и трипсину, стабилен в среде с рН 5,0-7,0. Штамм «СM-1» при пероральном заражении нативной вирусной 103 суспензией в дозе 15 см3 через 24-36 ч вызывает у новорожденных телят диарею с выделением жидких фекалий с примесью слизи и крови. Коронавирусный антиген больше всего накапливается в тонком отделе кишечника и фекалиях.
Штамм «СM-1» в лиофилизированном состоянии сохраняется в течение одного года при температуре - 20-300С.
Штамм «ТКА-ВИЭВ-В2» – герпесвируса крупного рогатого скота типа 1 возбудитель инфекционного ринотрахеита (ИРТ), получен из Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ВГНКИ). Штамм «ТКА-ВИЭВ-В2» репродуцируется на перевиваемой культуре клеток трахеи эмбриона коровы (линия ТR). На 2-3 сут культивирования инфекционный титр достигает 106,8-107,0 ТЦД50/см3. Обладает высокими иммуногенными свойствами. В лиофилизированном состоянии сохраняется в течение 16 месяцев при температуре – 20-300С.
Эпителиотропный энтеротоксигенный штамм «ПЗ-3» Escherichiae coli – возбудителя эшерихиозной диареи выделен Спиридоновым Г.Н и Гаффаровым Х.З. в 1992 г. из тонкого отдела кишечника больного новорожденного теленка из колхоза «Приволжье» Зеленодольского района Республики Татарстан. По морфологическим, тинкториальным, ферментативным и антигенным свойствам штамм отнесен к сем. Enterobacteriaceae, роду Escherichiae, виду Escherichiae coli; имеет высокую антигенную активность в РА, имеет группоспецифический и видоспецифический антигены, синтезирует адгезивный антиген А20, инфекционная активность на белых мышах 106,0 м.к.ЛД50 в лиофилизированном и 105,0 м.к. ЛД50 в нативном материалах. Штамм «ПЗ-3» представляет собой мелкие, полиморфные, грамотрицательные палочки. В МПБ вызывает диффузное помутнение, на МПА образовывает слабовыпуклые полупрозрачные сероватые колонии; ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу, лактозу, маннит, сорбит и ряд других углеводов; образует индол; лизин- и орнитинположительный.
Оценка безвредности, стерильности и специфической активности гипериммунной сыворотки
Каждую серию сывороток проверяли на стерильность согласно ГОСТ 28085 «Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности», на безвредность – согласно ГОСТ 9380067-00008064. Испытания проводили на 10 белых мышах живой массой 14-16 г, которым вводили полиспецифическую сыворотку подкожно в дозе 0,5 см3 в область лопаток, а также на 5 поросятах живой массой 1,2-1,5 кг, которым вводили сыворотку внутримышечно в дозе 10 см3.
Проверку активности сыворотки проводили на 20 белых мышах массой 15-18 г, из которых 10 ввели подкожно 0,5 см3 препарата, а другие 10 – служили контролем. Через 24 ч после введения сыворотки всех животных заражали внутрибрюшинно подтитрованной летальной дозой эшерихий, продуцирующих адгезивные антигены К88, К99 и 987Р. По истечении трех суток в первой группе животных, которым ввели полиспецифическую сыворотку, выжили все мыши, тогда как в контрольной группе, где сыворотка не применялась, все животные пали.
В результате проведенных исследований установлено, что во всех случаях испытуемая серия сыворотки была стерильна, безвредна и обладала высокой иммуногенной активностью.
Определение оптимальной лечебной и профилактической дозы гипериммунной сыворотки при рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи поросят Для определения оптимальной лечебной дозы полиспецифической сыворотки опыты проводили в одном из свиноводческих хозяйств Республики Татарстан, стационарно неблагополучном по рота-, коронавирусному гастроэнтериту и эшерихиозной диареи поросят. С этой 161 целью были сформированы несколько групп новорожденных поросят, которым вводили гипериммунную сыворотку с лечебной целью в различных дозах (таблица 35). Таблица 35 - Результаты применения различных доз гипериммунной сыворотки с лечебной целью Группа Кол-во Доза Выздоровело Пало Сохран жив-х, гол сыворот-ки, см3 кол-во % кол-во % ность, % опытная 12 10 9 75 4 33,3 66,7 15 11 91,7 2 8,3 91,7 20 11 91,7 2 8,3 91,7 контрольная 12 - 8 66,7 5 41,7 58,3 Данные таблицы 35 свидетельствуют о том, что полиспецифическая гипериммунная сыворотка оказывает выраженное лечебное действие при смешанных вирусно-бактериальных инфекциях. Так, применение ее в дозах 15 и 20 см3 позволило вылечить 91,7% больных поросят. Применение противоэшерихиозной сыворотки в сочетании с антибиотиками (стрептомицин, тетрациклин) позволило вылечить и сохранить лишь 58,3% поросят, что в 1,6 раза ниже, чем в опытной группе. При применении гипериммунной сыворотки в дозе 20 см3 у некоторых поросят через 30-40 мин после введения наблюдалось возбуждение, дрожь, рвота. Таким образом, оптимальной лечебной дозой сыворотки для новорожденных поросят признана 15 см3.
Для определения оптимальной профилактической дозы полиспецифической сыворотки опыты проводили на новорожденных поросятах, разделенных на 2 группы. Животных опытной группы (48 гол.) разделили на 4 подгруппы по 12 голов в каждой, которым в первый день после рождения вводили гипериммунную сыворотку с профилактической целью в различных дозах (таблица 36). Поросятам контрольной группы сыворотку не вводили. За животными ввелось клиническое наблюдение в течение 45 дней.
Данные таблицы 36 свидетельствуют о том, что гипериммунная сыворотка обладает выраженными профилактическими свойствами по отношению к рота-, коронавирусам и эшерихиям коли. Так, в группе поросят, обработанной гипериммунной сывороткой в дозе 5 см3, заболело 33,3%, пало 16,7% поросят; в группе поросят, обработанной сывороткой в дозе 7 см3, заболело 16,7%, пало 8,3% поросят, тогда как в контрольной группе заболело 83,3%, пало 33,3% поросят. Сохранность новорожденных поросят в группах, где применялась гипериммунная сыворотка в дозах 7 и 10 см3, составила 91,7%, против 66,7% в контрольной группе, т.е. применение сыворотки с профилактической целью позволяло повысить сохранность новорожденных поросят на 25%. При увеличении дозы сыворотки до 10 см3 достоверного повышения ее эффективности не наблюдается, а при дозе 3 см3 – желаемый эффект не достигается. Таким образом, оптимальной дозой сыворотки для профилактики рота-, коронавирусной и эшерихиозной диареи новорожденных поросят является 7 см3.
Испытание лечебно-профилактической эффективности полиспецифической гипериммунной сыворотки в производственных условиях
Производственное испытание опытных серий полиспецифической гипериммунной сыворотки проводили в 4-х свиноводческих хозяйствах (ООО «Агрофирма «Вамин-Аксу», ООО «Сосна», СХПК «Кама» Республики неблагополучных по рота-, коронавирусному гастроэнтериту и эшерихиозной диареи поросят. Предварительно в этих хозяйствах была изучена этиологическая струтура желудочно-кишечных заболеваний новорожденных поросят. Наиболее высокая заболеваемость и гибель поросят была установлена в ООО «Сосна». В данном хозяйстве заболевали до 100% поросят на 2-3 день жизни, летальность которых составляла 80%, а в некоторых пометах - 100%. Клинически заболевание проявлялось угнетением общего состояния, малоподвижностью, снижением аппетита, диареей, обезвоживанием организма. При бактериологическом и вирусологическом исследованиях патологического материала от больных и павших поросят были обнаружены антигены рота-, коронавирусов и выделены патогенные культуры энтеротоксигенных штаммов эшерихий, обуславливающие вышеуказанные признаки и изменения.
Разработка технологии изготовления, методов контроля и применения ассоциированной вакцины против инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота на основе антигенов бактерий Moraxella bovis и герпесвируса типа 1
В заключении можно констатировать, что положительные результаты производственного испытания асоциированных вакцин и полиспецифических гипериммунных сывороток против рота-, корона-, герпесвирусной и эшерихиозной диареи новорожденных телят и поросят позволяют рекомендовать их к внедрению в ветеринарную практику с лечебно-профилактической целью при смешанных формах инфекционной диареи.
В последние годы в РФ получило широкое распостранение инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота, вызываемый бактериями Moraxella bovis. Болезнь наносит скотоводческим хозяйствам значительный экономический ущерб за счет выбраковки животных, потери племенной ценности, снижения удоев и прироста массы тела, затрат на проведение лечебных и оздоровительных мероприятий. Частота его проявления наиболее высока среди молодняка крупного рогатого скота на откормочных площадках с высокой плотностью поголовья, где заболевание охватывает от 25 до 90% поголовья.
Нами проведены исследования эпизоотологических и этиологических аспектов инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота в хозяйствах Среднего Поволжья и Предуралья. Установлено, что заболевание широко распространено в скотоводческих хозяйствах этих регионов.
Заболевание начинается обычно весной, показатели заболеваемости достигают максимума в июле-августе и к концу октября постепенно уменьшается. В период пика болезни заболеваемость среди телят 2-6-месячного возраста достигает до 85%, у откормочного поголовья – до 22% и среди дойного стада она колеблется в пределах 8-10%. В период зимне-стойлового содержания заболеваемость составляет не более 5-10%. При бактерилогическом исследовании смывов из пораженных глаз животных нами выделены гемолитические штаммы бактерий Moraxella bovis, а в сыворотке крови у многих животных обнаружены специфические антитела к вирусу инфекционного ринотрахеита – герпесвирусу типа 1. В отдельных хозяйствах инфекционный процесс часто осложнялся сопутствующей условно-патогенной микрофлорой: стафилококками, кишечной палочкой, протеем, сенной палочкой и др. В неблагополучных по ИКК хозяйствах проводилась работа по выделению возбудителя болезни. С этой целью от больных животных с помощью стерильных тампонов были собраны серозно-гнойные истечения с поверхности глазного яблока, конъюнктивальных мешков и из пространства под третьим веком, а также пробы крови для серологических исследований. Лабораторные исследования включали в себя бактериологические методы – микроскопические исследования образцов патологического материала, посев их на специальные плотные и жидкие среды для изолирования возбудителя болезни, а также исследования для исключения кератоконъюнктивита инвазионного (телязиоз) характера. В результате были выделены гемолитические штаммы бактерий Moraxella bovis - возбудителя ИКК крупного рогатого скота. Проводили изучение морфологических, культурально-биохимических, серологических и биологических свойств выделенных изолятов. В результате многократного пассажа на кровяном агаре и селекции по S-форме нами был получен штамм бактерий Moraxella bovis сходный с референтными штаммами бактерий Moraxella bovis (АТСС 217 10900, АТСС 17947 и АТСС 17948), полученными из Американской национальной коллекции микроорганизмов. Провели депонирование этого штамма в лаборатории по изучению штаммов возбудителей особо опасных болезней ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» под регистрационным номером "Г97-ВНИВИ" как штамм, предназначенный для изготовления вакцин и диагностикумов. На штамм получили Патент РФ на изобретение №2145353 (приоритет от 15.09.1998).
В последние годы установлено, что инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота может быть вызван другими представителями рода Moraxella, в частности бактериями Moraxella bovoculi [294, 317]. Инфекционный кератоконъюнктивит крупного рогатого скота, вызванный бактериями Moraxella bovoculi, мы наблюдали в хозяйстве, принадлежащем совхозу-техникуму Чистопольского района Республики Татарстан. Клинические признаки болезни были сходны с таковыми при поражении с бактериями Moraxella bovis. При бактериологическом исследовании нами впервые в РФ выделен из конъюнктивального мешка глаза больного с признаками острого кератоконъюнктивита теленка 7 мес возраста гемолитические штаммы бактерий, идентифицированные в дальнейшем как бактерии Moraxella bovoculi. Результаты изучения морфологических, культурально-биохимических, серологических и биологических свойств выделеного штамма позволили депонировать его Всероссийской государственной коллекции штаммов микрооранизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве (Россия, 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ФГБУ «ВГНКИ») под регистрационным номером: «Штамм Moraxella bovoculi «СХ-Ч6 № -ДЕП» инфекционного кератоконъюнктивита крупного рогатого скота» от 20 марта 2013 г. На штамм получен Патент РФ на изобретение. Штамм признан производственным и предназначен для изготовления вакцины против ИКК КРС и диагностикумов.
