Содержание к диссертации
Введение
2 Обзор литературы . 11
2.1Общие представления о хламидиях, вызываемых ими заболеваниях, биологические и физические свойства хламидий 11
2.2.Специфическая профилактика хламидиоза 27
2.3 Адъюванты и их применение в составе противохламидийных вакцин 32
2.4 Диагностика хламидиоза . 38
3. Собственные исследования 45
3.1 Материалы и методы исследований 45
3.1.1 Материалы исследований 45
3.1.2 Методы исследований 46
4 Результаты собственных исследований . 52
4.1 Изучение эффективности применения коммерческого адъюванта в составе «Вакцины против хламидиоза рогатого скота инактивированной эмульсионной»52
4.1.1Изготовление антигена для экспериментальныхсерий вакцины . 54
4.1.2Изготовление эмульсий и проверка качества вакцины на основе коммерческого адъюванта 55
4.1.3Изучение антигенной активности вакцин на основе коммерческого адъюванта 57
4.1.4Изучение иммуногенности вакцин на основе коммерческогоадъюванта 60
4.2Усовершенствование масло-ланолинового адъюванта
4.2.1Конструирование вакцины против хламидиоза рогатого скота на основе усовершенствованного адъюванта
4.2.2 Изучение стерильности, стабильности и вязкости эмульсий на основе усовершенствованного адъюванта и сравнение коммерческими аналогами
4.2.3Изучение антигенной активности и иммуногенности вакцины против хламидиоза рогатого скота на основе усовершенствованного адъюванта на лабораторных животных
4.2.4 Изучение эффективности вакцины против хламидиоза рогатого скота, изготовленной с использованием усовершенствованного адъюванта на овцах .
4.2.5Производственные испытания усовершенствованной вакцины против хламидиоза рогатого скота инактивированной эмульсионной
4.3 Разработка«Набора препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» 82
4.3.1 Испытание предложенного специфического хламидийного 83 антигена для диагностики хламидиоза КРС в ИФА
4.3.2 Подбор компонентов тест-системы и отработка режимов постановки ИФА .
4.3.3 Испытание специфичности и активности «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» .93
4.3.4Лабораторное испытание «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА»
4.3.5 Производственное испытание «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» 102
5 Заключение 104
6 Практические предложения 105
7 Список сокращений 107
8 Список использованной литературы 130
9 Список иллюстративного материала
10 Приложения 132
- Общие представления о хламидиях, вызываемых ими заболеваниях, биологические и физические свойства хламидий
- Изучение эффективности применения коммерческого адъюванта в составе «Вакцины против хламидиоза рогатого скота инактивированной эмульсионной»
- стерильности, стабильности и вязкости эмульсий на основе усовершенствованного адъюванта и сравнение коммерческими аналогами
- Производственное испытание «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА»
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Хламидиоз сельскохозяйственных животных - это большая группа болезней, объединенных этиологически, но в большинстве своем различающихся по характеру течения инфекционного процесса и формам его клинического проявления. Полиморфность возбудителя хламидиоза и отсутствие строгой органотропности определяет отсутствие конкретного симптомокомплекса заболевания, ввиду чего клиника хламидиозов чрезвычайно разнообразна (Самуйленко А.Я., Неминущая Л.А., Литвинова Е.О. Ветеринарные аспекты обеспечения продовольственной безопасности России // Ветеринария. 2012. №3. С.9-12). Хламидиозы характеризуются абортами маточного поголовья, рождением нежизнеспособного или слабого молодняка с симптомами пневмонии, полиартритов, энтеритов, энцефаломелитов и конъюнктивитов. Иногда, при генерализованной форме, хламидии поражают все системы и органы, нередко приводя к летальному исходу.
Хламидиозы относятся к зооантропонозам с выраженной природной очаговостью (Курбанов И.А., Авзалов Ф.З., Лабутина Л.Ф. Диагностика, меры борьбы и профилактика хламидийных абортов крупного рогатого скота / Казань, 1982. 29с.; Гаффаров Х.З. Инфекционные болезни рогатого скота хламидийной, микоплазменной и вирусной этиологии, разработка диагностических и лечебно-профилактических препаратов: автореф. дис. … докт. вет. наук: 16.00.03 / Гаффаров Харис Зарипович. Казань, 1986. 45с.; Хамадеев Р.Х., Хусаинов Ф.М. Хламидиоз крупного рогатого скота // Ветеринария. 1990. - №2. С.48-50).
Постановка диагноза на хламидиоз требует обязательного использования лабораторных методов исследования. (Колычев Н.М., Кисленко В.Н., Госманов Р.Г. [и др.]. Руководство по микробилогии и иммунологии / Новосибирск, Арта 2010. 129с.).
Одним из важных этапов в лабораторной диагностике хламидиоза занимают ретроспективные методы, позволяющие обнаруживать антитела в сыворотках крови больных животных. (Шафикова Р.А., Гаффаров А.З. Выявление антител к возбудителю хламидиозного аборта овец в РЭМА // Актуал. вопр. инф. патол. в промыш. животн.: КВИ. Казань, 1987. - С.35-40; Иванов А.В., Плотникова Э.М., Низамов Р.Н. [и др.]. Биологическая безопасность: молекулярно-клеточные аспекты диагностики зооантропонозов / - М.: Планида, 2012. 288 с.).
Серологические методы являются наиболее доступными средствами проведения мониторинга хозяйств на хламидиоз, из них в ветеринарии, на сегодняшний день, основным остается реакция связывания комплемента (РСК) с группоспецифическим хламидийным антигеном. Но, к сожалению, этот метод имеет ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью, длительностью получения ответа и т.п.
Наиболее перспективным диагностическим тестом является иммуноферментный анализ (ИФА). Разработанный в 70-е годы прошлого столетия, сегодня он получил широкое распространение в ветеринарной и медицинской диагностике. По чувствительности иммуноферментный анализ в 5-10 раз, а по специфичности в 2-3 раза превосходит РСК (Домейка М.А., Ришкявичене В.П., Люткивячене В.И. Некоторые методические особенности проведения иммуноферментного анализа для изучения хламидиозов крупного рогатого скота // Ферментативные препараты в ветеринарии и животноводстве: тезисы докладов науч. - практ. конф., 28-29 сентября 1989. С.32-33; Обухов И.П., Груздев К.Н., Панин А.Н. Использование полимеразной цепной реакции в практических ветеринарных лабораториях // Ветеринария. 1997. №2. С.24-27). Его практическое применение для ретроспективной диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных в нашей стране во многом сдерживается отсутствием доступных отечественных тест-систем. Проблема в том, что для проведения ИФА требуются антигены с высокой степенью очистки, однако из-за дорогостоящей технологии они в промышленных масштабах не выпускаются.
Вакцинопрофилактика до настоящего времени остается основным методом борьбы с хламидиозом и его профилактики. (Еремец В.И., Самуйленко А.Я., Еремец Н.К. Совершенствование и стандартизация технологических процессов, методов контроля и управления качеством противовирусных вакцин // Ветеринарный врач. 2011. №3. С.4-7). Использование только антибиотиков с профилактической и лечебной целью экономически не оправданно и не эффективно (Евстифеев В.В., Иванов А.В., Хусаинов Ф.М. Специфическая профилактика хламидиоза животных. Матер. междунар. конф. «Актуальные пробл. здоровья скота, завозимого в Россию в рамках нацпроекта «Развитие агропромышл. комплекса» Казань. 2008. С. 240-242).
Для этих целей отечественными и зарубежными авторами (Хамадеев Р.Х., Хусаинов Ф. М., Беклешова А.Ю. Оценка иммуногенной активности вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота // Матер. Всесоюзн. науч.- конф. М.: 1991. С.44; Караваев Ю.Д. Семенова И.Н., Калугина И.А. [и др.]. Эффективность новых методов и средств специфической профилактики и лечения хламидиоза и некробактериоза животных // Международный аграрный журнал. Казань. 1998. №4. С.46-50), разработан целый ряд вакцинных препаратов. Всех их объединяет использование в своем составе масляных адъювантов, что обусловлено, характерной для возбудителя хламидиоза низкой иммуногенностью. Однако, побочные реакции, получаемые при использовании масляных адъювантов, заставляют исследователей изыскивать наиболее эффективные из них, которые бы при стимулировании высокого иммунного ответа не вызывали местных осложнений у привитых животных.
На сегодняшний день имеется большой выбор новых коммерческих готовых адъювантных продуктов, а также адъювантов на стадии разработки и испытаний, предназначенных для разных видов животных, направленных на инициацию различных типов иммунного ответа, сочетающих в себе различные уровни показателей эффективности и безопасности. Поэтому исследования по включению различных типов адъювантов в состав инактивированных вакцин весьма актуальны, их проводят большинство европейских фирм, занимающихся производством биопрепаратов для ветеринарии (Кукушкин С.А., Байбиков Т.З., Каньшина А.В. Грипп свиней (эпизоотология, диагностика, меры борьбы и профилактики) // Ветеринария. 2009. №9. С.3-7).
Таким образом, в настоящее время вопросы усовершенствования средств диагностики и специфической профилактики хламидиоза рогатого скота являются актуальной задачей, требуют изучения и изыскания новых, более эффективных биологических препаратов и внедрения их в ветеринарную практику.
Степень разработанности проблемы. В центре внимания научного поиска остается проблема усовершенствования технологии изготовления и применения инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза рогатого скота на основе адъювантов, позволяющих повысить иммуногенную активность вакцины путем установления оптимальной концентрации хламидийнонго антигена, обладающей умеренной реактогенностью и обеспечивающей формирование напряженного противохламидийного иммунитета у животных.
Ранее в секторе по производству биологических биопрепаратов по изучению хламидийных инфекций ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» была разработана технология получения инактивированных эмульсионных вакцин против хламидиоза. Применение этих вакцин позволяло оздоравливать хозяйства от хламидиозной инфекции. Но, к сожалению, применение этих препаратов на практике выявило ряд их недостатков, что было связано с высокой степенью вязкости таких вакцин и, как следствие, их высокой реактогенностью.
Дальнейшее использование таких вакцин требовало их усовершенствования, изыскания новых подходов к их конструированию.
В предыдущие годы в нашем Центре метод ИФА использовали для диагностики хламидиоза овец Шафикова Р.А. и др. (1988). При этом исследователи использовали групповой антиген хламидий, который применялся ранее для РСК, но не обладал достаточной специфичностью для ИФА, в результате чего было трудно дифференцировать положительные результаты из-за наличия «фона» в отрицательных образцах. Также была предпринята попытка использования корпускулярного антигена хламидий. Это несколько повысило специфичность реакции, но усложнило получение антигена.
Ранее в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» был усовершенствован способ изготовления специфического антигена хламидий, который позволял получать препараты с более высокой специфичностью и чувствительностью, чем коммерческий антиген, применяемый в РСК (Патент на изобретение №2485972 «Способ получения антигена для ретроспективной диагностики хламидиозов животных»). Этот антиген показал хорошие результаты в РСК, но в ИФА его использование не изучалось.
Цели и задачи исследований. Целью исследований явилось усовершенствование и разработка средств лабораторной диагностики и специфической профилактики хламидиозов сельскохозяйственных животных.
В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
1. Сконструировать вакцины против хламидиоза КРС на основе различных масляных адъювантов и изыскать наиболее оптимальный, который позволит получать вакцины с высокой иммуногенностью при низкой реактогенности.
2. Изучить антигенные и иммуногенные свойства усовершенствованной вакцины на лабораторных животных и эффективность её применения в неблагополучных хозяйствах для профилактики хламидиоза крупного рогатого скота.
3. Испытать предложенный хламидийный антиген для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА, отработать методику постановки реакции.
4. Создать набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота в ИФА и испытать его специфичность и активность в лабораторных и производственных условиях.
Научная новизна работы. Усовершенствована технология изготовления адъюванта в составе «Вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной» в результате чего понижены вязкость и реактогенность биопрепарата, но сохранена его высокая иммуногенность.
Для диагностики хламидиоза животных методом иммуноферментного анализа испытан новый хламидийный антиген и на его основе создана тест-система, которая обладает высокой специфичностью и активностью.
Теоретическая и практическая значимость. В результате проведенных исследований усовершенствована технология изготовления вакцины для специфической профилактики хламидиоза рогатого скота, которая позволяет добиться эпизоотической стабильности в неблагополучных по хламидиозу хозяйствах не вызывая осложнений у привитых животных.
Разработан и предложен для ветеринарных лабораторий «Набор препаратов для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом ИФА». Результаты проведенных исследований вошли в нормативную документацию.
Методология и методы исследований.
Работа выполнена в 2010-2014 гг. в секторе по производству лечебных средств ФГБУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» в соответствии с тематическим планом НИР (№ госрегистрации 01200202602).
В работе использовали следующие материалы:
1763 проб сыворотки крови крупного рогатого скота и овец.
2 штамма хламидий вида Chl. psittaci:
«250»- возбудителя аборта коров
«Ростиново-70» - возбудителя аборта овец
Штаммы депонированы в ВГНКИ и стандартизированы согласно СТО 00492374-004-2008.
Лабораторные животные: 168 морских свинок массой 350-400 г; 810 белых мышей массой 18-20 г.; 10000 куриных эмбрионов 6-7 дневного возраста; 10 овец массой 40-45 кг; свыше 10000 крупного рогатого скота.
Исследования проводились с использованием следующих методов:
1) Клинических - определение температуры тела, числа ударов пульса и дыхательных движений в минуту; изменение массы тела, визуальный осмотр кожи, волосяного покрова, слизистых оболочек.
2) Морфологических - взятие крови у опытных и контрольных животных осуществляли путем: пункции сердца - морские свинки, из яремной вены - овцы, 1-6 месячные телята, коровы.
3) Бактериологических - методом посева на питательные среды агар-Сабуро, среды Китта-Тароцци, МПБ и МППБ под вазелиновым маслом в отношении бактерий и грибков. В посевах не должно быть признаков роста бактериальной и грибковой микрофлоры.
Для морфологической идентификации хламидий в инфицированных куриных эмбрионах готовили из кусочков желточных мешков мазки-отпечатки и окрашивали их модифицированным методом Стемпа.
4) Диагностических – специфические хламидийные антитела выявляли двумя методами: в РСК и в ИФА. РСК ставили по общепринятой методике используя «Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиоза сельскохозяйственных животных» производства ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».
Непрямой вариант ИФА ставили согласно общепринятой методике. Учет результатов реакции проводили инструментально на спектрофотометре модели Bio-Rad Model 680, при длине волны 490. При этом использовали количественный метод.
5) Метода определения вязкости - кинематическую вязкость вакцин устанавливали при помощи вискозиметра ВПЖ-2 путем пропускания определенного объема эмульсии через капилляр с диаметром 2,37 мм под собственной силой тяжести засекая промежуток времени.
6) Математических - обработку экспериментально полученного цифрового материала проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стъюденту на персональном компьютере с использованием программного пакета Microsoft Excel 2007.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
. Изучение эффективности коммерческого адъюванта в составе вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота.
-
. Усовершенствование адъюванта и конструирование на его основе вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота.
-
. Испытание вакцины на основе усовершенствованного адъюванта в лабораторных и производственных условиях.
-
. Изучение возможности использования хламидийного антигена изготовленного по новой технологии для диагностики хламидиоза крупного рогатого скота методом ИФА, отработка методики постановки теста, разработка диагностического набора и его испытание в лабораторных и производственных условиях.
Степень достоверности и апробация результатов. Основные результаты диссертации представлены и доложены на ежегодных отчетных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2010-2013 гг.; Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК» (Казань, 2012); Международной научно-практической конференции «Биотехнологии в решении экологических проблем природы, общества и человека в Евразии: взгляд молодых ученых и специалистов» (Казань, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, в том числе 2 - в изданиях, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки Российской Федерации.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 132 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, списка использованной литературы, списка иллюстрированного материала, библиографического списка и приложений. Работа содержит 16 таблиц, иллюстрирована 2 рисунками. Список использованной литературы включает 214 библиографических источников, в том числе 92 на иностранном языке и 3 ссылки на интернет - сайт.
Общие представления о хламидиях, вызываемых ими заболеваниях, биологические и физические свойства хламидий
Хламидии длительное время имели различные названия. На ранних этапах исследований нечеткость таксономической классификации возникла на уровне определения группы, к которой необходимо отнести данный микроорганизм. В 1966 году американский ученый Page выделил группу возбудителей ПЛТ в новый порядок, определяющего как Chlamydiales. Название это является изменением первоначального номенклатурного термина Chlamydozoon (Chlamys- мантия, zoon - животное) данного Провачеком и Гельберштедтером в 1907 году.
Другие авторы обозначили хламидии как крупные «атипичные» вирусы из группы пситтакоза - лимфогранулемы - трахомы (ПЛТ), орнитоза-лимфогранулемы - трахомы (ОЛТ) и другие. Однако углубленное изучение биологии хламидий позволило четко дифференцировать их от вирусов и отнести к бактериям (Moulder J.W.Metaboliccapabilitiesandofrickettsiaeandpsittacosisgroup // Int. J. Leprosy, 1965. V.33. P.494).В частности, в отличие от вирусов, хламидии имеют как РНК, так и ДНК, с геномом клетки в непосредственный контакт не вступают, развиваются в клетках с высокимa уровнем обмена веществ, выявляются в клетке в течение всего периода цикла развития, им присуще бинарное деление, характер энзиматической активности, чувствительность к ряду антибиотиков, наличие общего родоспецифического антигена (Зайцева О.В., Щербакова М.Ю., Самсыгина Г.А.«Новая» хламидийная инфекция //Лечащий врач. 2001. № 1.С.38-43). В 1971 году таксономический комитет американского общества микробиологов утвердил за рассматриваемой группой микроорганизмов название хламидии, а вызываемые ими заболевания стали называть хламидиозами.
По решению Международной Ассоциации микробиологических обществ в 1980 году эти микроорганизмы получили родовое название «Chlamydia». Возбудители хламидийных инфекций были отнесены к семейству Chlamydiaceae роду Chlamydia. Внутриродахламидиибылиразделенынадвавида: Chl. trachomatis и Chl. psittaci (Ouchi K., HasegawaK.Evaluation of a synthetic peptide based species specifie EIA kit for detection of antibodies to Chlamydia trachomatis with clinical specimens // KansenshogakuZasshi 1988. V.72. №3. P.249-257;Эйделынтейн И.А. Современная классификация хламидий //Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. Т.1. №1. 1999. С.5-11). ВидChl. trachomatisвключаетпатогенныедлячеловекаштаммыхламидий, вызывающиетрахому -конъюнктивит (паратрахому) ивенерическуюлимфогранулему (PoffenrothL., CostertonJ.W., KordovaN.etal.UltrastructuralstudiesofChl. Psittaci 6BCstrains // Can. J. Microbiol. 1973. V.19. P.887-894; БашмаковМ.А., БочкаревЕ.Г., ГоворунВ.М.[и др.].Хламидиоз. Современные подходы к диагностике и лечению. М.:1999. С.61). Chl. psittaci объединял на уровне вида, штаммы возбудителей, ассоциируемые с орнитозом и пситтакозом, а также штаммы, выделенные от больных животных при различных хламидийных заболеваниях (Perez - Martinez J.A., Storz J.Chlamydialinfectionincattle.P.1. Mod.Vet. Pract. 1985. V.66. № 8. P.17-522; Беклешова А.Ю. Инфекционные болезни животных.М.: 1987. 304 с.). В качестве критериев разделения рода на виды были взяты: образование «компактных» (первый) и «диффузных» (второй) цитоплазматических включений; содержание (первый) или отсутствие (второй) гликогена во включениях; чувствительность (первый) или резистентность (второй) к сульфаниламидам (Schachter J.,GrossmanM.Chlamydialinfections // Ann. Med. 1981. №32. P.45-61; Шендеров Б.А. Микробиологическая токсикология: реальность, проблемы и перспективы. Антибиотики и микроэкология человека и животных: Труды. М.:1988. С.3-7). В 1992 году род разделен на 4 вида: Chl. trachomatis, Chl. psittaci, Chl. pneumonia, Chl. pecorum. Вид Chlamydia trachomatis встречается только у человека, в нем выявлены 18 антигенных вариантов - это возбудители трахомы, венерической лимфогранулемы и урогенитальных хламидиозов у человека (CaldwellH.D., KromhoutJ., SchachterJ.PurificationandpartialcharacterizationofthemajoroutermembraneproteinofCh i. trachomatis // Infect. Immunol. 1981. №31. P.1161-1176). Вид Chlamydia psittaci часто регистрируется у птиц, в значительной степени распространен среди животных, поражает человека вызывает атипичную пневмонию, артрит, пиелонефрит. Включает не менее 13 сероваров. Вид Chlamydia pneumonia вызывает острые респираторные заболевания, «мягкую» и атипичную пневмонию у человека. Определен единственный серовар. Вид Chlamydia pecorum - возбудители хламидиозов у животных. Аборты, полиартриты, энцефалиты, кератоконъюнктивиты, энтериты, маститы (Хамадеев Р.Х. Возбудители хламидиозов сельскохозяйственных животных и патогенность их для человека. ЖМЭИ. 1977. №1. С.99-101; Караваев Ю.Д., Налетов Н.И., Калугина И. Хламидиозы - меры борьбы и профилактики // Ветеринарная газета. 1993. №26. С.4; PetersenE.E. Chlamydieninfektionen // MTA. 1996. V.11. №5. P.354, 356-358, 360, 362; Бурова А.А. Основные свойства возбудителя хламидиоза и его роль в развитии инфекций урогенитального тракта. Журнал микробиологии. 1999. №4. С.107-111).Роль этого видав патогенезе заболеваний человека неизвестна(Сопраненко Л.Г. Результаты идентификации штаммов орнитоза, выделенных в Таджикистане. Вопр. вирусологии. 1975. Т.5. С.537-539; Бортничук В.А., Иванченко Г.А.,Электронно - микроскопическое исследование хламидий, выделенных от свиней, в клетках желточного мешка куриных эмбрионов. Микробиологический журнал. 1984. Т.46. №1. С.56-61; Шапошников О.К. Руководство. Венерические болезни. М.:1991. С.545;Серов В.Н., Краснопольский В.И., Делекторский В.В. Хламидиоз (клиника, диагностика, лечение). Методические рекомендации М.:1996. С.22).
Развитие молекулярной биологии привело к открытию новых микроорганизмов с характерным для хламидий циклом развития. Определение генома уже известных видов хламидий способствовало пересмотру их номенклатуры, согласно современным подходам геносистематики для описания бактериальных таксонов на уровне видов, родов и семейств. Классификация хламидий и хламидиоподобных микроорганизмов основана на наличие более 95% гомологии нуклеотидной последовательности генов 16SpРНК и 23S pРНК для всех представителей рода и более 90% - семейства. Ранее неклассифицированные микроорганизмы, имеющие сходный с хламидиями цикл развития, были выделены в четыре дополнительных семейства в составе порядка Chlamydiales -Chlamydiaceae, Parachlamydiaceae, Simkaniaceae, Waddliaceae
Исследователи, (Gafford L.G., Randal C.C.J. Molecular Biol., 1967. №26. P.303).НаиболеерадикальныеизмененияпроизошливсистематикесемействаChlamy diaceae, вкоторомвнастоящеевремявыделенодварода: - ChlamydiaиChlamydophila (КузминА.В. Патоморфологияипатогенезхламидиозасвиней: aвтореф. дис. …канд. вет. наук: 16.00.03 / КузьминАлександрВладимирович.- Саранск, 1999. 18с.).РодChlamydiaвключаеттривида: Chlamydiatrachomatis, Chlamydiamuridarum, Chlamydiasuis. Chl. muridarumиChl. suis, вошедших в род Chlamydia, проявляют большее генетическое и фенотипическое сходство с Chl. trachomatis по сравнению с другими представителями семейства Chlamydiaceae. Хламидии принадлежат к числу наиболее распространенных возбудителей заболеваний животных. Хламидии являются облигатными внутриклеточными микроорганизмами, то есть они способны размножаться только внутриклеточно. По структуре близки к классическим бактериям, но не обладают метаболическими механизмами, необходимыми для самостоятельного размножения.Несмотря на то, что хламидии обладают всеми клеточными механизмами синтеза ДНК, РНК и белков, они зависят от клетки хозяина в отношении снабжения их нуклеотидами, аминокислотами, ферментами для синтеза АТФ (Hatch T.P.UtilizationofL cellnucleosidetriphosphatesbyChlamydiapsittaciforribonucleicacidsynthesis.J. Bacteriol., 1975. V.122. P.393-400; Tood W.J., Doughri A.M., Storz J. Ultrastructural changes in host cellular organelles in the course of chlamydial developmental cycle //Zentralbl. Bakteriol.[Orig.A] 236. 1976. P.359-373).
Изучение эффективности применения коммерческого адъюванта в составе «Вакцины против хламидиоза рогатого скота инактивированной эмульсионной»
Ранеев секторе по производству биологических биопрепаратов по изучению хламидийных инфекций ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» была разработана технология получения инактивированных эмульсионных вакцин против хламидиоза (патент РФ №2301682 06.2007) в составе которых применяется масло-ланолиновый адъювант (МЛА). На основе этой технологии были созданы и внедрены в ветеринарную практику «Вакцина против хламидиоза рогатого скота инактивированная эмульсионная» (Регистрационный № ПВР-1-1.8/02340), «Вакцина против хламидиоза свиней инактивированная эмульсионная» (Регистрационный № ПВР-1-1.8/02339)и «Ассоциированная вакцина против ПГ-3, ИРТ и хламидиоза КРС инактивированная эмульсионная» (Регистрационный № ПВР-1-4.8/02246). Эти вакцины показали свою высокую эффективность на производстве при оздоровлении хозяйств от хламидийной инфекции рогатого скота и свиней. Так применение этих вакцин позволяло в течение нескольких лет оздоровить хозяйства от хламидиозной инфекции. При этом заболеваемость и гибель молодняка сокращалась в 3-4 раза, аборты и мертворождения снижались до минимума.
Но, к сожалению, применение этих препаратов на практике выявило ряд их недостатков, что было связано с высокой степенью вязкости таких вакцин и, как следствие, их высокой реактогенностью. И хотя эти противохламидийные вакцины обладали высокой эффективностью при профилактике заболеваний вызываемых возбудителем хламидиоза, побочные эффекты от их применения в виде гранулем и стерильных абсцессов, особенно остро выражающиеся у крупного и мелкого рогатого скота, затрудняли и ограничивали их применение в ветеринарии.
Дальнейшее использование таких вакцин в ветеринарной практике требовало их усовершенствования, изыскания новых подходов к их конструированию.
Давно доподлинно известно, что для хламидиозной инфекции характерна недостаточная иммуногенность возбудителя, что препятствует выработке антител в необходимом количестве и способствует продолжительному персистированию хламидий в организме животных, создавая хронические очаги инфекции. Эта особенность возбудителя хламидиоза обуславливает необходимость применения адъювантов в составе противохламидийных вакцин. И наиболее эффективны вакцины в виде эмульсий вода в масле. Поэтому нами было решено не отходить от этой формы, а изыскать новый масляныйадъювант, который будет обладать наименьшей реактогенностью и по возможности не сказываться на антигенных и иммуногенных свойствах вакцин.
Наиболее широко при конструировании эмульсионных вакцин типа «вода в масле» для рогатого скота и свиней применяется готовый коммерческий адъювант МontanideISA 70 производства фирмы Seppic «Франция». В отличие от МЛА который образует эмульсию с водной антигенной средой в равных соотношениях (1:1) он эмульгируется в соотношении 7 частей адъюванта к 3 частям воды (антигена), тем самым обладая меньшей вязкостью и реактогенностью.
Исходя из этого можно было предположить, что введение в состав вакцины адъюванта МontanideISA 70 позволит создать вакцину, которая будет обладать высокой иммуногенностью, и при этом, низкой реактогенностью. Нами были проведены исследования по конструированию вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота на основе коммерческого адъювантаМontanideISA 70. Для проведения опытов по оценке свойств экспериментальной вакцины в качестве стандартного образца нами была использована «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» (ТУ 9384 55 002-00492374-2009) изготовленная с экспериментальной в одно и тоже время из аналогичных материалов в аналогичных условиях, с той лишь разницей, что в ней был применен масло-ланолиновый адъювант и варьировалась концентрация хламидийного антигена.
Для приготовления антигенной части вакцины, согласно разработанной нами ранее технологии, был использован штамм хламидий: «250» - возбудитель аборта коров. Штамм депонирован в «ВГНКИ» и стандартизирован согласно СТО 00492374-004-2008.
Биомасса для изготовления антигена была выращена в желточной и аллантоисной оболочках развивающихся эмбрионов кур, инактивирована формалином, очищена дифференциальным центрифугированием и адсорбирована на алюмокалиевых квасцах. Особенностью адъювантаISA-70 в отличие от масло-ланолинового адъюванта, примененного при изготовлении противохламидийной вакцины является его пропорция смешивания масляной части адъюванта с водной средой антигена при изготовлении эмульсии. Так, МЛА связывается с антигеном в равных частях (1:1), а МontanideISA 70 образует эмульсию при соотношении с антигеном 7:3, т.е. на 7 частей адъюванта добавляется только 3 части антигена. Исходя из этого, следовало увеличить концентрацию антигена пропорционально, как если бы в вакцине было равное количество антигена и адъюванта. Стандартизацию антигена проводили на фотоэлектрокалориметре КФК-2М. Измеряли оптическую мутность антигена при длине волны 480 нм.Для технологии изготовления эмульсионных вакцин на основе масло-ланолинового адъюванта оптимальной концентрацией антигена считается, когда его оптическая мутность равна 1,5 ед. при микроскопической оценке в 4 креста. Следовательно, чтобы получить такую же концентрацию антигена в конечном продукте эмульсии его количество в водной среде надо увеличить до показателя оптической плотности 2,5 ед. Что нами и было учтено при конструировании экспериментальных серий вакцин на основе адъюванта МontanideISA 70.
Водную часть и адъювант при изготовлении вакцин смешивали в аналогичных условиях механическим способом при частоте вращения вала мешалки 3000-4000 об/мин в течение 3-5 мин при комнатной температуре и разливали в стерильные стеклянные флаконы объемом 50 см3.
Качество вакцин проверяли согласно ТУ 9384-002-00492374-2009 утвержденных в установленном порядке. Вакцины проверялись по внешнему виду, стабильности, стерильности, безвредности и антигенной активности.
Стабильность эмульсии проверяли путем е замораживания при - 400С и дальнейшего оттаивания при + 370С. Стабильность и внешний вид оценивали визуально.
Изучение внешнего вида и стабильности эмульсии вакцины изготовленной на основе коммерческого адъюванта говорило о более жидкой е консистенции перед контрольной вакциной, изготовленной на основе МЛА. В остальном существенной разницы между двумя вакцинами не наблюдалось. Было установлено, что оба образца удовлетворяют предъявляемым требованиям. Вакцины представляют собой эмульсию белого цвета. Разрушения эмульсии после охлаждения и нагрева не происходило. В обоих случаях наблюдалось допустимое незначительное отслоение (0,5-1% от объема) масла вверху флакона, которое равномерно распределялось при встряхивании биопрепарата.
Стерильность препаратов определяли в соответствии с ГОСТ 28085 путем их высева на МППБ под вазелиновым маслом, МПБ, Сабуро-агар, среду Китт-Тароцци споследующем помещением в термостат при + 370С и наблюдением в течение 10 дней.
При определении стерильности было установлено, что испытуемая и контрольная вакцины не давали роста бактериальной и грибной микрофлоры на питательных средах в течение срока наблюдений в таблице1
стерильности, стабильности и вязкости эмульсий на основе усовершенствованного адъюванта и сравнение коммерческими аналогами
Качество вакцин, как и в предыдущей серии опытов, проверяли согласно ТУ 9384-002-00492374-2009 утвержденных в установленном порядке. Вакцины проверялись по внешнему виду, стабильности и вязкости эмульсии, стерильности, безвредности и антигенной активности. Результаты этих исследований обобщены в таблице 6.
Стабильность эмульсии проверяли путем е замораживания при минус 400С и дальнейшего оттаивания при плюс 370С. Стабильность и внешний вид оценивали визуально.
Изучение внешнего вида и стабильности эмульсии трех образцов вакцин показало, что все они удовлетворяют предъявляемым требованиям. Вакцины представляют собой эмульсиюбелого цвета. Разрушения эмульсии во всех трех образцах после охлаждения и нагрева не происходило. В образце вакцины приготовленном на основе усовершенствованного адъювантанаблюдалось незначительное отслоение (0,5-1% от объема) масла вверху флакона, которое равномерно распределялось при встряхивании биопрепарата.
Ранее в Технических условиях (ТУ 9384-002-00492374-2009) «Вакцина против хламидиоза крупного рогатого скота инактивированная эмульсионная» контроль эмульсионной вакцины по вязкости не проводился. Исходя из результатов наших исследований мы внесли в ТУ изменения и дополнили методы испытания вакцины контролем вязкости эмульсии. За норматив был принят результат измерения вязкости образца вакцины на основе усовершенствованного адъюванта - 80 мм2/с, как наиболее оптимальный и соответствующий лучшим показателям реактогенности и антигенности.
Кинематическую вязкость вакцин устанавливали при помощи вискозиметра ВПЖ-2 путем пропускания определенного объема эмульсии через капилляр с диаметром2,37 мм под собственной силой тяжести засекая промежуток времени. Вязкость вычисляли по формуле V=g/9,807TK, где V -кинетическая вязкость мм2/с, g - ускорение свободного падения в месте измерения, К - постоянная вискозиметра, Т - время истечения жидкости. Вискозиметр заполнили испытуемой вакциной в соответствие с формой аппарата и помещали в баню. Наполненный вискозиметр выдерживали в бане до тех пор, пока она не прогреется до температуры испытания. Вискозиметры пока находились в рабочем состоянии из бани не вынимали, так как время нахождения в бане могло измениться в зависимости от температуры и кинематической вязкости. После того как образец достиг температурного равновесия, объем образца довели до требуемого уровня. Используя давление, установили высоту столбика образца в капилляре вискозиметра до уровня, находящего приблизительно 7 мм выше первой временной метки. При свободном истечении образца определили с точностью до 0,1 с. время, необходимое для перемещения мениска от первой до второй метки. При согласованных измерениях с установленной величиной рассчитали среднее арифметическое значение двух измерений времени истечения.
Определение вязкости вакцин показало значительные различия трех изучаемых образцов. Так, наибольшей вязкостью обладал образец, изготовленный на основе МЛА. Его вязкость составила 203 мм2/с. Вязкость вакцины на основе УА была значительно ниже и составляла 81 мм2/с. Наименьший показатель вязкости - 47 мм2/с был зафиксирован у биопрепарата, изготовленного на основе ISA-70.
Стерильность препаратов определяли в соответствии с ГОСТ 28085 путем их высева на МППБ под вазелиновым маслом, МПБ, Сабуро - агар, среду Китт -Тароцци последующем помещением в термостат при + 370С и наблюдением в течение 10 дней.
При определении стерильности было установлено, что все вакцины не давали роста бактериальной и грибной микрофлоры на питательных средах в течение срока наблюдений.
Безвредность определяли на белых мышах массой 18-20 г. путем внутрибрюшинного введениявакцин в дозе 0,2 см3 и дальнейшего наблюдения в течение 2-х недель. Использовали 60 белых мышей: по 15 на каждую вакцину и 15 контрольных. Испытание безвредности вакцин показало, что после вакцинации ухудшения состояния у мышей не наблюдалось. Выживаемость мышей, как в опытных, так и в контрольной группах была высокой (93-100%), что говорило о безвредности проверяемых биопрепаратов.
По аналогии с предыдущей серией опытов антигенную активность и местную реакцию на введение биопрепаратов проверяли на морских свинках. Каждой вакциной было иммунизировано по 6 морских свинок (18), четырех свинок не вакцинировали (контроль). Вакцины вводили внутримышечно с внутренней стороны бедра в дозе 0,5 см3 по 0,25 см3 с каждой стороны.
После вакцинации проводили ежедневную термометрию и клинический осмотр свинок.
Наблюдения, проводимые за вакцинированными и контрольными свинками в течение опыта, не выявляли клинических признаков ухудшения их состояния после прививки. Температурных реакций на введение вакцин также не наблюдали. На месте введения вакцины, изготовленной на основе УА, у морских свинок не наблюдалось выраженной местной реакции, что говорило об отсутствии или о крайне низкой местной реактогенности нового препарата. У морских свинок вакцинированных вакциной на основе ISA-70, реакции на месте введения также не возникало. Биопрепарат, в составе которого был использован МЛАпо-прежнему вызывал местную реакцию при внутримышечном введении морским свинкам.На месте его инокуляции наблюдалось уплотнение в виде округлого желвака расположенного в глубине мышцы. Полное рассасывание этого уплотнения происходило только через 2-4 месяца.
Для установления динамики антителообразования в течение 6 мес с 30 дневными интервалами сыворотки опытных и контрольных свинок исследовали в РСК.
Производственное испытание «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА»
Производственные испытания проводились на базе ФГУ «Татарская межрегиональная ветеринарная лаборатория» (г.Казань).
В течение 2010 - 2011 годов с применением экспериментальных серий «Наборов препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» было исследовано 1008 проб сывороток крови КРС из 4 не благополучных по хламидиозу животноводческих хозяйств РТ и других регионов РФ. Параллельно все сыворотки крови были исследованы в РСК. Результаты этих исследований обобщены в таблице 16.
В ходе проведенных производственных испытаний установлено, что из 1008 проб в РСК реагировало положительно 62 пробы (5,9%), а в ИФА - 142 (12,2%). Таким образом, в ИФА было выявлено в 2 раза больше положительных результатов, чем в РСК.
Следует отметить, что в сравнительных опытах результаты ИФА показали хорошую корреляцию с данными базовой реакции - РСК, хотя она и не была полной. Расхождения в результатах ИФА и РСК, по-видимому, связаны с разными классами иммуноглобулинов (антител) выявляемых этими реакциями.
Важно подчеркнуть, что интенсивность проявления титров антител в серологических тестах напрямую зависела от интенсивности проявления клинических признаков заболевания у животных в неблагополучных хозяйствах, т.е. в хозяйствах, где течение хламидиоза носило острый характер процент серопозитивности животных был значительно выше, чем в хозяйствах с латентной стадией течения хламидийной инфекции. В ряде случаев результаты серологических исследований подтверждены прямой РИФ и другими методами.
В настоящее время для мониторинга хозяйств на хламидиоз используется реакция связывания комплемента, которая имеет ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью, длительностью и сложностью проведения анализа.
Наиболее перспективным диагностическим тестом является иммуноферментный анализ. Но его применение для диагностики хламидиоза животных сдерживается отсутствием доступных отечественных тест-систем. В профилактике и ликвидации хламидиозов животных приоритетным остается применение вакцинных препаратов. Использование антибиотиков экономически не оправданно и далеко не всегда эффективно. Ранее в ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» была разработана технология получения вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота, но, к сожалению, е применение на практике выявило реактогенность, связанную с вязкостью препарата. Дальнейшее использование этой вакцины требовало усовершенствования и изыскания новых менее реактогенных адъювантов. С учетом изложенного, целью данной работы явилось разработка тест системы ИФА на основе нового антигена и усовершенствование вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота.
В результате проведенных исследований получены следующие выводы:
1.Применение коммерческого адъюванта ИЗА-70 в составе эмульсионной вакцины против хламидиоза КРС снижает е вязкость и реактогенность, но также значительно снижает антигенную активность и иммуногенность препарата, тем самым наблюдается прямая зависимость антигенности и иммуногенности от вязкости вакцины.
2. Усовершенствование масло-ланолинового адъюванта позволило значительно (в 3 раза) снизить вязкость и реактогенность эмульсионной вакцины против хламидиоза КРС, при этом максимально сохранить е антигенную активность и иммуногенность.
3. Экспериментальные серии вакцин на основе усовершенствованного масло-ланолинового адъюванта по стабильности, безвредности, стерильности, реактогенности, антигенной активности и иммуногенности соответствовали требованиям технических условий. Установлена оптимальная вязкость для эмульсионных инактивированных вакцин против хламидиоза КРС, равная 80 мм2/с.
4. Производственные испытания вакцины на основе усовершенствованного адъюванта показали, что введение препарата не вызывало осложнений у привитых животных и индуцировало выработку специфических антител в высоких титрах, а так же позволило добиться в хозяйстве эпизоотического благополучия поголовья по хламидиозу.
5. Установлено, что предлагаемый специфический хламидийный антиген позволяет диагностировать хламидиоз крупного рогатого скота методом ИФА.
6. Созданныйнаоснове испытанного антигена «Набор препаратов для диагностики хламидиоза КРС методом ИФА» обладает специфичностью, а также большей, по сравнению с РСК, активностью и чувствительностью.
