Введение к работе
Актуальность темы. Микроорганизмы Yersinia pseudotuberculosis (возбудители псевдотуберкулеза), в соответствии с классификацией «Bergy`s manual…1984-1989», включены в род Yersinia. Генотип патогенных штаммов Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica содержит хромосомные и плазмидные детерминанты, называемые «плазмидой вирулентности иерсиний» – «plasmidasociated with Yersinia virulence» (рYV) (Езепчук Ю.В., 1977; Полоцкий Ю.Е., 1981; Пашин А.Ю. и соавт., 1984; Дайтер А.Б. и соавт., 1987; Тимченко Н.Ф., 1989; 2004; Ценева Г.Я., 1997; Балахонов С.В., 1988; Исачкова Л.М. и соавт., 1993; Мавзютов А.Р., 2001., Шурыгина И.А., 2004; Светоч Т.Э., 2012; Kaneuchi C., 1989; Hayashidani H., 1994; Singh S., 1994; Brubaker R.R., 1983; Kapperud G. et al., 1987; Robins-BrowneR.M. et al., 1993; China B. et al., 1994; Cornelis G. et al., 1994; Czernomysy-Furowicz, D. 1996; Bonci M. et al. 2009; Okwori A. et al., 2007; Thisted Lambertz S. et al., 2008; Long C. et al., 2010; Price et al., 2012).
Псевдотуберкулез у птиц (куры, индейки, фазаны, серые куропатки, утки, голуби, канарейки) протекает остро, подостро, хронически, латентно (Душук Р.В., 1989; Конопаткин А.А. и соавт., 1993; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Скородумов Д.И. и соавт., 2005; Бессарабов Б.Ф. и соавт., 2007). При исследовании 1200 проб патматериала птицы было выделено 184 культуры микроорганизмов, из числа которых 2,1 % составили Y. pseudotuberculosis. Указанные бактерии были выделены с поверхности и из тушек птицы, яиц и продуктов, приготовленных из мяса птицы, а также с упаковочной тары (Каландадзе Е. П., 1991; Зон М.Г., 2001; Bonci M. et al., 2009). При бессимптомной персистенции иерсиний в организме бактерионосителей может происходить контаминация пищевого сырья, что обусловливает социальную значимость профилактических мероприятий в начале «пищевой цепи» (в птицеводстве и перерабатывающей промышленности) (Санитарные правила. 3.1.094-96; Ветеринарные правила 13.3.1318-96).
При организации профилактических мероприятий и изыскании средств борьбы с инфекционными болезнями приоритетной задачей является раскрытие механизмов взаимодействия в системе «возбудитель-макроорганизм», с последующей практической реализацией полученных знаний для разработки эффективных методов диагностики. При индикации и идентификации Y. pseudotuberculosis следует учитывать, что культивирование иерсиний при температуре свыше 28 С вызывает диссоциацию однородной популяции на S и R-формы, при изменении формы и снижении метаболизма бактериальной клетки наблюдается переход популяции в «некультивируемое состояние», что существенно осложняет бактериологическую диагностику, характеризующуюся длительностью исследования до 14 суток (Ющенко Г.В., 1972; Литвин В.Ю., 1989; Пушкарева В.И., 1990; Ефремов B.C., 1995; Ленченко Е.М. и соавт., 1998; Каврук Л.С., 2000; Шумилов К.Н., Мельниченко Л.П., 2001; Астахова Т.С., 2002; Скляров О.Д., Кузьмина В.Б., 2002; Павлова И.Б. и соавт., 2007; Colwell., 1985; Kapperud G. et al., 1987; Robins-BrowneR.M. et al., 1993; China B. et al., 1994). Учитывая, недостаточную изученность патогенетических аспектов псевдотуберкулеза целесообразным является изучение влияния токсигенных бактерий Y.pseudotuberculosis на динамику развития патологических процессов в тканях и органах иммунной системы птиц, что и определило актуальность темы диссертационной работы.
Цель исследований: изучить диссеминацию микроорганизмов в ткани и органы, динамику морфологических изменений иммунной системы птиц при заражении токсигенными бактериями Yersinia pseudotuberculosis
Задачи исследований:
- изучить морфологические, культуральные, ферментативные свойства Y.pseudotuberculosis;
- изучить факторы патогенности S-R-форм колоний Y. pseudotuberculosis;
- изучить сравнительные характеристики дифференциально-диагностических сред для индикации и идентификации Y. pseudotuberculosis;
- изучить диссеминацию микроорганизмов Y. pseudotuberculosis в ткани и органы птиц;
- изучить динамику морфологических изменений иммунной системы птиц при заражении токсигенными бактериями Y. pseudotuberculosis
Научная новизна. Научно обосновано и экспериментально подтверждено применение схемы бактериологической диагностики псевдотуберкулеза с применением жидкой и плотной селективной среды «СIN-agar», специфичность среды для идентификации Y. pseudotuberculosis – 86,44 %. Установлено, что средний показатель адгезии S-форм – 4,49±0,24, R-форм – 1,37±0,1; индекс фагоцитоза S-форм – 31,16±0,16, R-форм – 59,22±1,24; токсигенность S-форм – 16,33±4,72, R-форм – 4,37±2,14. Установлено, что индекс дилатации (ИД) кишечника птиц через 24-32 ч при заражении токсигенными бактериями Y. pseudotuberculosis составляет 0,057±0,009–0,072±0,005, через 48-72 ч – 0,115±0,005–0,125±0,007. Динамика патологических процессов при псевдотуберкулезе птиц характеризуется гиперплазией селезенки, атрофией фабрициевой бурсы, сочетанием общей сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими изменениями в паренхиматозных органах, увеличением количества межэпителиальных лимфоцитов, скоплением плазматических клеток и экссудативно-инфильтративными процессами органов иммунной системы.
Практическая значимость работы. На основе изучения популяционной изменчивости микроорганизмов модифицирована методика микроскопического исследования S-R-форм колоний бактерий и разработаны «Методические рекомендации по подготовке препаратов для микроскопического исследования S-R-форм бактерий Y.enterocolitica», утвержденные секцией «Ветеринарная санитария, гигиена и экология» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 8 от 22 октября 2012 года). Результаты исследований используются в учебном процессе на ветеринарно-санитарном факультете ФГБОУ ВПО «МГУПП» по дисциплинам: «Цитология, гистология, эмбриология»; «Эпизоотология».
Апробация материалов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и одобрены на заседаниях кафедры «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «МГУПП» (Москва, 2009-2013 гг.); на VII, VIII Международной научной конференции студентов и молодых ученых «Живые системы и биологическая безопасность населения», «Экологически безопасные ресурсосберегающие технологии и переработки сельскохозяйственного сырья и производства продуктов питания» (М., 2008; М., 2009; М., 2010).
Основные положения, выносимые на защиту:
- результаты изучения популяционной изменчивости, факторов патогенности и фенотипических признаков Y.pseudotuberculosis, связанных с плазмидой вирулентности;
- результаты изучения сравнительных характеристик диагностических сред для индикации и идентификации Yersinia pseudotuberculosis;
- результаты изучения диссеминации микроорганизмов в ткани и органы птиц;
- результаты изучения динамики морфологических изменений иммунной системы птиц при заражении токсигенными бактериями Yersinia pseudotuberculosis
Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 3 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, библиографии, приложений. Работа изложена на 112 страницах компьютерного текста, содержит 10 таблиц, 12 рисунков. Библиографический список включает 190 источник, из них 90 иностранных авторов.
Работа выполнена с 2009 по 2013 гг. на кафедре «Инфекционные и паразитарные болезни» ФГБОУ ВПО «МГУПП». В опытах были использованы паспортизированные штаммы микроорганизмов: Yersinia pseudotuberculosis № 290; Yersinia enterocolitica О9 S- и R-формы №383; Escherichia coli О78 №320; Klebsiella pneumonia №24; Salmonella enteritidis № 5715; Staphylococcus aureus № 123, полученные из коллекции ФГБУ «ВГНКИ».
Сравнительное изучение дифференциально-диагностических свойств питательных сред проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по организации и проведению контроля качества питательных сред для ветеринарных лабораторий» (М., 2011). Бактериологические исследования проводили в соответствии с инструкцией «Эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация и проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий» (М., 30 октября 1990); «Методические указания по лабораторной диагностике иерсиниоза животных и обнаружению возбудителя болезни в мясном сырье, молоке и растительных кормах» (М., 3 октября, 2005). Идентификацию выделенных культур микроорганизмов проводили, в соответствии с классификационной системой «Bergy smanual…1984-1989», используя общепринятые методы исследований (Герхардт Ф. и соавт., 1984; Сидоров М.А. и соавт., 1995; Скородумов Д.И. и соавт., 2005). В экспериментах использовали питательные среды «Среда с бромтимоловым синим» (Оболенск), «Yersinia Selective Enrichment Broth», «Yersinia selective agar» («Merck»). Биохимические свойства микроорганизмов изучали с использованием сред Гиса, СИБ (Н. Новгородский НИИ экспериментальной микробиологии). При изучении факторов патогенности Y. pseudotuberculosis оценивали средний показатель адгезии (СПА); устойчивость к фагоцитозу; токсигенные свойства микроорганизмов (Вартанян Ю.П. и соавт., 1978; Романенкова Н.И. и соавт., 1980; Кондрахин И.П. и соавт., 1985; Брилис В.И. и соавт., 1986; Павлова И.Б., Ленченко Е.М., 1999). При изучении фенотипических признаков Y. pseudotuberculosis, связанных с наличием плазмиды вирулентности, оценивали зависимость бактериального роста от концентрации кальция в среде при 37 С, зависимость размеров колоний от температуры культивирования (Ценева Г.Я. и соавт., 1986). Патогенные свойства микроорганизмов оценивали с применением лабораторных моделей: куриные эмбрионы породы «Белый леггорн» (n=15); цыплята породы «Белый леггорн» (n=40); утята породы «Пекинская» (n=30); морские свинки породы «Self» (n=24), белые беспородные мыши (n=10), используя общепринятые методы исследований (Биргер М.О., 1973). Клиничекие принаки болезни, патологоанатомические изменения, гематологические и иммунологические показатели изучали общепринятыми методами (Автандилов Г.Г., 1972; Бессарабов Б.Ф., 1980; Жаров А. В., 1981; Федоров Ю.Н.,1989; Сидорчук А. А. и соавт., 2005; Макаров В. В. и соавт., 2009; Стрельников А.П., 2007; Селезнев С.Б., 2000; Сулейманов С.М., 2002). Гематологические и биохимические показатели крови и сыворотки крови птицы определяли на анализаторе «Chem Well 2900 (T)» (USA). Для гистологических исследований материал фиксировали 10,0 % формалином и заключали в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином; по Ван Гизону; Крантцу; Лейшману; гемосидерин – по Перлсу (Волкова О.В., Елецкий Ю.К., 1971). Результаты опытов подвергали статистической обработке общепринятыми методами (Ашмарин И.П., Воробьев Л.А., 1962; Садовский Н.В., 1975; Шмойлова Р.А., 2006).
