Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
I ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 14
1.1 Биологические особенности вида Xanthomonas campestris 14
Возбудители листовой пятнистости 16
Возбудитель сосудистого бактериоза Xanthomonas 17 campestris pv. campestris
1.2 Эволюция и систематика культурных видов рода 37
Brassica
Эволюция вида Brassica oleracea L. 38
Эволюция вида Brassica г ара L. 43
Эволюция видов Я nigra, B.juncea, В. napus и 46 В. carinata
Использование генетических ресурсов семейства 48 капустных для селекции на устойчивость к болезням
1.3. Взаимоотношение растений и фитопатогенных бактерий 54
II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 61
Штаммы фитопатогенов 61
Сорта растений и агротехника 71
III МЕТОДЫ ОЦЕНКИ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К 73
СОСУДИСТОМУ БАКТЕРИОЗУ И БАКТЕРИАЛЬНОЙ
ЛИСТОВОЙ ПЯТНИСТОСТИ
Инокуляция и системы оценки 73
Влияние метода хранения бактерий на 75 воспроизводимость результатов инокуляции растений
Влияние питательной среды на патогенность Хсс 11
Воспроизводимость оценки реакции растений 80
Количественная изменчивость реакции растений Brassica 85 к возбудителю сосудистого бактериоза
Оценка устойчивости растений к листовой пятнистости 90
Многовариантный метод оценки устойчивости 91 капустных растений на устойчивость к сосудистому бактериозу
РАЗНООБРАЗИЕ ПОПУЛЯЦИИ XANTHOMONAS CAMPESTRIS 94
Разнообразие биохимических признаков Xanthomonas sp. 94
Активность экзоферментов X. campestris pv. campestris 100
Полиморфизм спектра общих водорастворимых белков 103 X campestris pv. campestris
Серологические признаки Xanthomonas campestris pv. 107 campestris
Характеристика антигенных признаков Xanthomonas 114 campestris методом Вестерн-блот гибридизации
Генетические признаки Xanthomonas campestris pv. 118 campestris
4.6.1 Генетическое разнообразие X campestris pv. 118
campestris и взаимоотношение с другими видами
Xanthomonas по последовательности гена 16S
рРНК и 16S-23S ITS региона
4.6.2 Полиморфизм популяции Xanthomonas campestris, 131
выделенный AFLP и DIR-ПЦР маркерами
Разработка и тестирование специфичных праймеров для 149 мультиплексной диагностики Xanthomonas campestris
Плазмидный состав X. campestris pv. campestris 163
4.9 Ген авирулентности Xanihomonas campestris pv. 163
campestris гомологичный локусу avrBs2
ВЗАИМООТНОШЕНИЯ МЕЖДУ БАКТЕРИЯМИ ВИДА 175
XANTHOMONAS CAMPESTRIS И КРЕСТОЦВЕТНЫМИ РАСТЕНИЯМИ
5.1 Спектр поражаемых растений, разнообразие симптомов 175
вызываемых болезней и патогенности представителей
рода Xanthomonas
5.2 Взаимоотношение растений Brassica и бактерий 179
Xanthomonas campestris
5.2.1 Особенности поражения растений-хозяев 179
бактериями Xanthomonas campestris pv. campestris
Расовый состав популяций Xanthomonas campestris pv. 185 campestris
Появление расы 0(6) в результате спонтанной мутации 202 изолята расы 1 Xanthomonas campesrtis pv. campestris
РАЗНООБРАЗИЕ РАСОВО-СПЕЦИФИЧЕСКОЙ И 206
НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К XANTHOMONAS CAMPESTRIS У РАСТЕНИЙ РОДА BRASSICA
Устойчивость растений с геномом АА (ААСС) (Brassica 206 гора & В. парт)
RAPD-маркеры, сцепленные с локусом устойчивости к 216 расе 4
Устойчивость растений В. oleracea (СС геном) 221
Расово-специфичная реакция устойчивости у 221 В. oleracea
Стеблевая устойчивость к сосудистому 232 бактериозу капустных у В. oleracea
6.3.3 Полигенное наследование устойчивости к 242
сосудистому бактериозу и листовой пятнистости
у брокколи
6.3.4 Значение расово-специфичной реакции для 247
полевой устойчивости В. oleracea к сосудистому
бактериозу
6.4 Устойчивость дикорастущих и полукультурных растений 253
сем. Капустные
ВЫВОДЫ 260
РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗОДСТВУ 264
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 265
ПРИЛОЖЕНИЯ 305
Введение к работе
Среднемировые ежегодные потери растениеводства от болезней составляют 11% (FAO, 1997), и усиление устойчивости растений к фитопатогенам является одной из важнейших задач сельскохозяйственного производства. Крестоцветные растения (семейство Капустных или Brassicaceae) составляют значительную часть возделываемых овощных, масличных, кормовых и технических культур во всем мире. Например, в России, Китае и Японии они находятся на 1-2 месте по валовому сбору овощей, в Индии, Канаде, Германии и Великобритании - на первом месте среди масличных. Сосудистый бактериоз и листовая пятнистость крестоцветных, вызываемые видом Xanthomonas campestris, приводят к большим экономическим потерям при выращивании этих растений во всем мире (Williams, 1980). X. campestris является типовым представителем бактерий рода Xanthomonas, и разнообразие взаимоотношений этого патогена с крестоцветными растениями отражает большую часть многообразия патогенных отношений других ксантомонад с многочисленными растениями-хозяевами. Эффективная система защитных мероприятий должна основываться на выращивании устойчивых сортов, диагностике зараженности семян, агротехнических мероприятиях, направленных на подавление возбудителя в местах его сохранения (растительные остатки и дикорастущие и сорные крестоцветные растения). Несмотря на то, что научную селекцию на устойчивость к сосудистому бактериозу ведут уже более 50 лет, стабильных результатов не достигнуто, вероятно, из-за игнорирования фактов неоднородности популяции патогена по признаку вирулентности и расово-специфичной реакции устойчивости растений.
Вследствие концентрации производства гибридных семян капустных культур в регионах мира, имеющих благоприятный климат для развития сосудистого бактериоза происходит широкое распространение с партиями
семян высоко агрессивных клональных групп бактерий, что делает задачу совершенствования диагностики семенной инфекции актуальной.
Данная работа посвящена исследованию генетического полиморфизма X. campestris, устойчивости капустных растений, и расовым взаимоотношениям в системе X. campestris - Brassicaceae, с целью разработки методов диагностики и селекции на устойчивость к сосудистому бактериозу.
1. Цель исследования
Разработать направления в системе защитных мероприятий и методы
селекции капустных культур на устойчивость к сосудистому бактериозу и
листовой пятнистости на основе этиологии фитопатогена X. campestris pv.
campestris и взаимоотношений с растением-хозяином на генетическом
уровне.
Задачи исследования:
1. Создать и охарактеризовать по комплексу признаков коллекцию
фитопатогена X. campestris, включающую штаммы, выделенные с
культурных, дикорастущих и сорных растений из различных стран и эколого-
географических зон.
2. Усовершенствовать систему растений-дифференциаторов, и определить
расовую структуру популяции X. campestris pv. campestris.
3. Разработать метод оценки расово-специфичной и неспецифичной
устойчивости к сосудистому бактериозу на одном растении.
4. Провести оценку расово-специфичной устойчивости видов семейства
Brassicaceae, и закономерности географического распределения различных
типов устойчивости.
5. По возможности идентифицировать гены расово-специфичной
устойчивости растений к сосудистому бактериозу и установить характер их
наследования.
6. Определить вклад различных типов устойчивости и экологических
факторов в развитие заболевания в поле.
7. На основе изучения генетического разнообразия популяции X. campestris
pv. campestris разработать методы молекулярной диагностики патогена.
2. На защиту выносятся следующие положения
1. Особенности взаимодействия фитопатогена X campestris pv. campestris с капустными (Brassicaceae) растениями:
а) популяция фитопатогена неоднородна по признаку вирулентности и
представлена физиологическими расами,
б) гены устойчивости крестоцветных растений к X. campestris pv. campestris в
основном расово-специфичны,
в) в семействе Brassicaceae имеются видовые особенности распределения
расово-специфичных генов устойчивости к сосудистому бактериозу,
г) неспецифичная устойчивость к сосудистому бактериозу у В. oleracea
локализована в ксилеме стебля;
д) распределение генов устойчивости в популяциях видов В. oleracea и В.
гара характеризуется географическими закономерностями.
2. Географические закономерности распределения физиологических и
генетических признаков X. campestris pv. campestris.
Методика оценки устойчивости растений, обеспечивающая выявление расово-специфичного и неспецифичного типов устойчивости.
Методика диагностики X. campestris при помощи мультиплексного ПЦР анализа с оригинальными праймерами.
3. Научная новизна
Впервые проведена комплексная оценка физиологических (фенотипических) и генетических признаков 470 штаммов X campestris, собранных в России, Великобритании, Японии, Венгрии, США, Германии, и других странах.
Найдены 5 новых растений-дифференциаторов, и впервые определен расовый состав X campestris в указанных странах.
Впервые определены 6 генов расово-специфичной устойчивости к сосудистому бактериозу. Обнаружен ген авирулентности avrRxcl/З у X campestris, распознаваемый двумя разными расово-специфичными генами
устойчивости растений Rxcl Rxc3. Показана корреляция между симптомами сосудистого бактериоза/листовой пятнистости и отсутствием/наличием локуса awBs3. Показана зависимость расового состава популяции X campestris от присутствия гена Хсс2109 - гомолога гена AvrPphC Pseudomonas syringae.
Впервые установлено, что крестоцветные растения с геномом А (В. гара, В. napus) имеют расово-специфичные доминантные гены R2, R3 и Rxc4. Найдены молекулярные маркеры для гена устойчивости Rxc4. Установлено, что устойчивость растений с геномом В {В. nigra, В. carinata, В. juncea) контролируется расово-специфичным доминантным геном Rb (Rxcl), а с геномом С - расово-специфичными доминантным геном Rl(Rxc3) и рецессивным геном г5. Впервые обнаружен новый тип неспецифичной устойчивости, проявляющийся в сосудистой системе стебля и контролируемый доминантным геном Rs (Resistance in Stem) у растений В. oleracea.
На основе изучения генетического полиморфизма штаммов X. campestris pv. campestris создана мультиплексная система ПЦР-маркеров для диагностики возбудителя. Впервые показана полифелитичность рода Xanthomonas по последовательности гена 16SpPHK, 4. Практическая ценность
Результаты исследований служат основой для селекции растений, направленной на долговременную устойчивость к бактериозам. Они использованы в «Методических рекомендациях по методам лабораторной оценки белокочанной капусты на устойчивость к болезням» (М РАСХН, 1994) и «Компендиуме по защите растений» (CABI, Кембридж, 2003).
Разработана методика одновременной оценки устойчивости по нескольким генам устойчивости к сосудистому бактериозу и получены устойчивые линии, объединяющие несколько генов устойчивости в одном генотипе. Источники и доноры устойчивости переданы для селекционной
работы на Селекционную станцию им. Н.Н. Тимофеева РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева.
Коллекция фитопатогенных ксантомонад передана во Всероссийскую коллекцию фитопатогенных бактерий (ВНИИФ).
Набор линий-дифференциаторов для тестирования рас X campestris используется для научной и учебной работы во ВНИИ фитопатологии РАСХН, Селекционной станции им. Н.Н. Тимофеева РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева, и Центре «Биоинженерия» РАН.
Типовые штаммы различных рас X campestris pv. campestris переданы для создания инфекционных фонов в РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева. 5. Апробация работы
Материалы диссертации доложены на конференции «Экологические проблемы защиты растений» (Ленинград 1990), Республиканской конференции, посвященной 60-летию образования Казахского СХИ, (Алма-Ата, 1990), научной конференции «Бактериальные болезни картофеля овощей и методы борьбы с ними» (ВНИИФ 1993), Координационном совещании "Совершенствование контроля фитосанитарного состояния сельскохозяйственных культур с целью предотвращения вспышек массового развития болезней" (Москва, 1994), Всероссийском съезде по защите растений "Защита растений в условиях реформирования агропром. комплекса: экономика, эффективность, экологичность» (СПб, 1995), 9-й Международной конференции по фитопатогенным бактериям (Мадрас, Индия, 1996), 3-м Международном конгрессе по опылению растений (Лефбридж, Канада, 1996), 2-м Симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования" (Пущино, 1997), Симпозиуме Международного общества садоводства и овощеводства по капустным (Реннес, Франция, 1997), Конференции Японского общества садоводства и овощеводства (Токио, 1997), 7-м международном конгрессе по фитопатологии в Эдинбурге (Великобритания, 1998), 6-м Симпозиуме
Ашерслебена по устойчивости растений (Ашерслебен, Германия, 1998), Национальном симпозиуме по по черезвычайным ситуациям в растениеводстве (Варанаши, Индия, 1998), 7-м международном конгрессе по фитопатологии (Великобритания, 1998), IV съезде Общества физиологов растений России (Москва, 1999), Конференции «Оптимизация селекционного процесса на основе генетических методов» (Украина, 1999), Юбилейной конференции Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева (Москва, 2000), Школе-конференции «Горизонты физ,-химической биологии» (Пущино, 2000), 2-й Международной конференции по геному сельскохозяйственных микроорганизмов (Сан Диего, США, 2001); 6-й Международной конференции по патоварам Pseudomonas syringae и родственным патогенам (Италия, 2002), Конференции американского фитопатологического общества (Мичиган, США, 2002), Конференции американского фитопатологического общества (Сев. Каролина, 2003); 11-м Международном симпозиуме по молекулярному взаимодействию микроорганизмов и растений (Ст. Петербург, 2003); Всероссийском Съезде общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова. (Москва, 2004), 7-й конференции Европейского фонда фитопатологии и Британского общества фитопатологии (Великобритания, 2004), 57-м Международном симпозиуме по защите растений (Бельгия, 2005), Конференции американского фитопатологического общества (Мериленд, 2005), 11-м Международном объединенном симпозиуме по микробиологии (Сан-Франциско, США, 2005). Автор признателен всем коллегам, предоставившим материалы, методическую помощь и принимавших участие в обсуждении результатов исследований: А.Н. Самохвалову, Ю.Б. Рогачеву, И.М. Колесникову, Н.Н. Балашевой, Г.Ф. Монахос, Ф.С. Джалилову, СВ. Цыганковой, Е.С. Булыгиной, Б.Б. Кузнецову, И. Агарковой, А. Сечлер, Н. Шаад, М. Эванс, Д. Тейлор, С. Роберте, Я. Кугинуки, К. Хида, и М. Хираи.
6. Публикации
По материалам работы опубликовано 45 статей в отечественных и зарубежных научных журналах и сборниках, и 36 публикаций по материалам конференций (из 112 опубликованных работ в целом), в т. ч. в журналах «Биологические науки», «Сельскохозяйственная биология», «Генетика», "Phytopathology", "European Journal of Phytopathology", "Canadian Journal of Botany", "Japanese Agricultural Research Quaterly", "Acta Phytopathologica and Enthomologica Hungarica", "Crop Protection Compendium" (CABI), сборниках научных трудов ВНИИССОК, материалах российских и зарубежных научных конференций. Опубликованы также 50 тезисов.
