Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Белки и их роль во взаимоотношениях хозяин-патоген. 11
1.1.1. Индуцирование устойчивости растений неспецифическими элиситорами .
1.1.2. Индукция устойчивости растения продуктами R-генов 14 (специфических элиситоров) .
1.2. Индуцированная устойчивость растений к болезням 16
1.3. Применение веществ белковой природы для защиты растений от
16 патогенов и вредителей
1.3.1. Белки-токсины бактериального происхождения. 17
1.3.2. Растительные белки 18
1.4. Трансгенные растения, устойчивые к вирусам 20
1.5. Изменение метаболизма растительных тканей, как способ повышения устойчивости растений к патогенам .
1.6. Пептидил-пролил-цис/транс-изомеразы. 22
1.6.1. ППИ-азы растений.. 24
1.6.2. ППИ-азы паразитических организмов. 25
1.6.3. Влияние ППИ-аз хозяина на развитие патогенов 26
1.6.4. Использование ППИ-аз для подавления развития патогенов 28
Глава 2. Материалы и методы з
2.1. Материалы 29
2.2. Методы 33
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение 50
3.1. Определение количества MF3 в клетках P. fluorescens (197) 50
3.2. Создание штамма E.coli - суперпродуцента MF3 51
3.3. Исследование фитотоксичности MF3 53
3.4. Изучение влияния MF3 на вирусные патогены растений
3.4.1. Вирус табачной мозаики 55
3.4.2. Y- вирус картофеля 63
3.5. Изучение влияния MF3 на грибные патогены растений 65
3.5.1. Alternaria longipes 65
3.5.2. Возбудители корневых гнилей злаковых 68
3.6. Изучение возможности использования хитозанов для улучшения проникновения MF3 в растительные ткани
3.6.1. Изучение способности MF3 в смеси с хитозанами индуцировать устойчивость пшеницы к патогенному грибу Stagonospora nodorum..
3.6.2. Изучение способности MF3 в смеси с хитозанами индуцировать устойчивость растений белокочанной капусты к вирусу мозаики турнепса 3.7.
Анализ нуклеотидной последовательности гена и аминокислотной последовательности белка MF3 .
3.7.1. Поиск и изучение элиситорного центра MF3 белка – ППИ-азы FKBP-типа, выделенного из P. fluorescens
3.8. Изучение трансгенных растений, несущих ген MF3 белка 84
3.8.1. Молекулярный анализ трансгенных растений 84
3.8.2.
Оценка устойчивости трансгенных растений рапса и цветной капусты к фитопатогенам
Заключение 91
Выводы 92
Список опубликованных работ по теме диссертации 93
Список использованной литературы
- Индуцирование устойчивости растений неспецифическими элиситорами
- Изменение метаболизма растительных тканей, как способ повышения устойчивости растений к патогенам
- Изучение влияния MF3 на вирусные патогены растений
- Поиск и изучение элиситорного центра MF3 белка – ППИ-азы FKBP-типа, выделенного из P. fluorescens
Введение к работе
1 1. 1.1. Актуальность темы.
Болезни растений, вызываемые патогенными грибами, бактериями и вирусами продолжают наносить серьезный ущерб сельскому хозяйству, несмотря на его интенсивное развитие Современные направления в защите растений от болезней включают в себя методы биологического контроля и индуцированной устойчивости растений к патогенам
Бактерия Pseudomonas fluorescens способна индуцировать устойчивость растений к патогенным грибам и нематодам (Siddiqui and Shaukat, 2002) В процессе исследования защитных свойств Р fluorescens во ВНИИ Фитопатологии было показано, что одним из факторов, позволяющим данной бактерии защищать растения от патогенов, является низкомолекулярный (16,9 кДа) термостабильный белок, названный Микробным Фактором 3 (MF3) Вьщеленный белок индуцировал устойчивость листьев табака к вирусу табачной мозаики Ген, кодирующий MF3 белок, был клонирован и секвенирован (Dzhavakhia et al, 2005) Для того, чтобы наиболее полно раскрыть механизмы действия данного белка было решено провести его всестороннее изучение как в качестве возможного биопестицида, так и при применении гена т/3 для создания трансгенных растений цветной капусты и рапса
1.2. Цели и задачи исследований.
Целью наших исследований было изучение защитного действия MF3 Другой целью данной работы был анализ первичной структуры MF3 -белка и идентификация аминокислотной последовательности, ответственной за индуцирующую активность Кроме того, была поставлена цель выяснить способен ли белок обеспечивать устойчивость трансгенных растений, в которых экспрессируется ген т/3 Задачи исследований 1. Создание штамма Е coh - суперпродуцента МРЗ-белка,
Оценка способности MF3 защищать растения от вирусных и грибных патогенов,
Изучение способности хитозана образовывать комплекс с MF3 и способствовать его проникновению внутрь растительных тканей;
Изучение структуры MF3 и определение его фрагмента, достаточного для индуцирования устойчивости,
Оценка способности синтетического пептида MF3-29aK индуцировать устойчивость растений в системе табак - ВТМ
6 Анализ устойчивости к фитопатогенам трансгенных растений, в которых экспрессируется ген т/3
1.3. Научная новизна исследований.
Впервые была обнаружена гомология между аминокислотной последовательностью MF3 белка и пептидил-пролил-г/мс/трйнс-изомеразами FKBP-типа Впервые показано, что белок, относящийся к этому семейству, способен индуцировать устойчивость растений к вирусным и грибным патогенам.
Впервые показана способность MF3 образовывать комплекс с хитозаном, в результате чего усиливается защитный эффект данного белка в таких системах растение-хозяин - патоген, как белокочанная капуста - вирус мозаики турнепса, пшеница - Stagonospora nodorum
Впервые показано, что MF3 имеет активный центр - пептид IIPGLEKALE GKAVGDDLEVAVEPEDAYG (MF3 - 29 ак), определяющий защитные функции данного белка Показано, что синтезированный химическим путем MF3 - 29ак обладает способностью вызывать устойчивость табака к ВТМ
Впервые показано, что растения рапса, экспрессирующие ген т/3, обладают повышенной, по сравнению с нетрансгенными растениями, устойчивостью к вирусу мозаики турнепса и грибу Plasmodiophora brassicae.
1.4. Практическая значимость работы.
Показано, что MF3 белок способен защищать растения от вирусных и грибных патогенов Данные результаты могут служить предпосылкой для создания средств защиты растений на основе MF3.
Создан штамм Е coli - суперпродуцент MF3 с продуктивностью 200 мг белка/л Этот штамм может быть использован в качестве источника MF3 в случае применения данного белка как средства для защиты растений Разработана простая схема выделения и очистки MF3
З При создании препаративных форм биопестицидов на основе белка может быть использован хитозан, образующий комплекс с MF3 и усиливающий защитный эффект последнего. Кроме того, установлено, что применение хитозана совместно с белком позволяет расширить круг защищаемых растений
4. Поскольку установлено, что фрагмент MF3 (пептид MF3-29 ак) способен защищать растения табака от ВТМ, для разработки биопестицидов и для создания трансгенных растений можно использовать как целый белок, так и его индуцирующую часть
5 Повышенная устойчивость трансгенных растений рапса к вирусу мозаики турнепса и к грибному патогену PI brassicae делает растения, несущие ген т/3 перспективными для использования в дальнейшей селекции сортов с широким спектром устойчивости к вирусным и грибным патогенам
6. Структура МРЗ-белка и его защитные функции были защищены международным патентом Dzhavakhia V, Fihpov A., Skryabin К, Voinova Т, Kouznetsova М, Shulga О , Shumihna D, Kromina К, Pndaimikov M, Battchikova N., Korpela T Proteins inducing multiple resistance of plants to phytopathogens and pests Patent PCT WO2005/061533 Al, дата публикации 2005-07-07
1.5. Апробация работы и публикации.
Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях и конгрессах
Шестая международная конференция Европейского хитинового общества, проходившая в Познани (Польша) с 31 августа по 3 сентября 2004 г,
Международная конференция «Наука - Бизнес - Образование, Биотехнология - Биомедицина - Окружающая среда», проходившая в Пущино 10-13 мая в 2005 г,
Десятый МНТЦ/Корея семинар «Industrial applications of Russia's new bio-technologies», проходивший в Мокло (Корея) 14-15 марта 2006 г,
Восьмой конгресс "New achievements in biological control of plant diseases", проходивший в Быдгощи (Польша) 25-26 апреля 2006 г,
Восьмая международная конференция «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана», проходившая в Казани 12-17 июня 2006 г,
Третья международная конференция «Наука и Бизнес», проходившая в Пущино 19-21 июня 2006 г,
Всероссийская научно-практическая конференция «Индуцированный иммунитет сельскохозяйственных культур — важное направление в защите растений», проходившая в Голицыне 15-16 ноября 2006 г,
Объединенное международное совещание «PR-Proteins and Induced Resistance against Pathogens and Insects», проходивший в Дорне (Голландия) 10-14 мая 2007 г
По материалам диссертации опубликовано 12 работ и получен один международный патент
1.6, Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы Материал изложен на 109 страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц и 20 рисунков Список литературы включает 122 работы
Индуцирование устойчивости растений неспецифическими элиситорами
Одними из первых стали использовать бактериальные белки, оказывающие токсическое действие на фитопатогены. Самыми широко используемыми токсинами, пожалуй, можно назвать эндотоксины из Bacillus thuringiensis (Bt). Данные белки связываются со специфическими рецепторами эпителиальных клеток кишечника насекомых и формируют поры в мембранах клеток, что может приводить либо к нарушению клеточного гомеостаза, либо к лизису клеток и разрушению эпителия кишечника насекомых (de Maagd et al., 2001).
Гены, кодирующие Bt токсины, широко используют для получения трансгенных растений, устойчивых к насекомым. Первыми были получены растения табака, устойчивые к табачному бражнику Manduca sexta (Vaeck et al., 1987). Сейчас созданы трансгенные растения многих видов сельскохозяйственных культур, со вставкой bt генов. В 2005 году в различных странах на 17,8 млн. гектарах выращивали трансгенную Bt кукурузу и на 8,5 млн. гектарах трансгенный Bt хлопок (James, 2005).
Токсины из бактерий Photorhabdus и Xenorhabdus. Бактерии Photorhabdus и Xenorhabdus живут в симбиозе с энтомопатогенными нематодами (Forst and Clarke, 2002). Данные бактерии играют очень важную роль в патогенезе нематод. Комплекс токсинов Toxin complexes (Tc s) и Photorhabdus insect-related (Pir) токсины обладают активностью против некоторых видов насекомых. Tc s обладают высоким молекулярным весом, состоят из нескольких субъединиц (Waterfield et al., 2001). Гены токсинов (TcdA из P. luminescens штамма W14) были использованы для получения трансгенных растений арбидопсиса. Личинки первого возраста моли Manduca sexta погибали после скармливания им растений, экспрессирующих токсины (Liu et al., 2003). Но применение трансгенных растений, экспрессирующих бактериальные токсины, имеет ряд недостатков. Прежде всего, уже имеются данные о приобретении насекомыми устойчивости к Bt токсину (Tabashnik, 2001; Jayaraman et al., 2005).
Кроме того, широко обсуждается вопрос безопасности для человека трансгенных растений, экспрессирующих бактериальные белки-токсины (Vazquez-Padron et al., 1999, 2000). С этой точки зрения использование антипатогенных белков из съедобных растений выглядит очень перспективным, поскольку большинство из них не представляют опасности для здоровья.
Лучше всех среди фитотоксинов изучен рицин, синтезируемый в клещевине: его ген клонирован и установлена нуклеотидная последовательность. Однако высокая токсичность рицина для млекопитающих ограничивает генноинженерные работы с ним только техническими культурами, не используемыми в пищу человека и на корм животным. Токсин, вырабатываемый фитолаккой американской, эффективен против вирусов и безвреден для животных (Кузьмина, 2006). Механизм его действия заключается в инактивации собственных растительных рибосом при проникновении в клетки различного рода патогенов, в том числе фитовирусов. Пораженные клетки некротизируются, предотвращая размножение патогена и его распространение по растению.
Из других растительных белков, защищающих растение от патогенов и вредителей, наиболее известны лектины, белки, инактивирующие рибосомы (RIPs) первого и второго типов, ингибиторы протеолитических ферментов и гликогидролазы. Другими белками, вовлечёнными в комплекс механизмов защиты, являются арселины, хитиназы, канатоксин и модифицированные формы запасных белков (Carlinia and Grossi-de-Sa, 2002).
Ингибиторы протеаз. Многие насекомые, особенно чешуекрылые зависят от сериновых протеаз (трипсина, химотрипсина), являющихся их основными пищеварительными ферментами. Трансгенные растения табака, экспрессирующие ген ингибитора трипсина, меньше поражались Helicoverpa virescens за счёт увеличения смертности и угнетения роста питающихся личинок (Hilder et al. 1987). Аналогичные результаты были получены и на кукурузе по отношению к H. zea (Hoffman et al. 1992). Ингибиторы амилаз, выделенные из пшеницы (WAAI) и бобов (BAAI), были охарактеризованы и их гены используются для получения трансгенных растений. Смертность личинок бабочек, питающихся на растениях табака, экспрессирующих ген WAAI составляла 30 - 40% (Carbonero et al. 1993). Запасные белки. 2S альбумины - смесь низкомолекулярных запасных белков богатых глютамином со схожими физико-химическими свойствами, присутствующие в семенах как у однодольных, так и у двудольных растений (Youle and Huang, 1981). 2S альбумины из семян редиски ингибируют рост грибов и бактерий. Показано, что они нарушают проницаемость мембран фитопатогенов (Terras et al., 1996). Выделенные из семян мальвы 2S альбумины CW-1 и CW-4 обладают сильным фунгицидным действием по отношению к Fusarium graminearum (CW-1) и Phytophthora infestans (CW-4) (Wang and Bunkers, 2000).
Трансгенные растения табака, экспресирующие ген запасного белка LJAMP1 семян пустырника (Leonurus japonicus Houtt), показали высокую степень устойчивости к грибному патогену Alternaria alternata и к патогенной бактерии Ralstonia solanacearum (Yang et al, 2007).
Изменение метаболизма растительных тканей, как способ повышения устойчивости растений к патогенам
Оценку осуществляли по методике, описанной в ГОСТ Р 50459-92. Для опыта использовали семена ячменя и пшеницы, естественно инфицированные возбудителями корневых гнилей. Семена пшеницы сорта Энита или ячменя сорта Зазерский инкубировали в растворах c концентрацией MF3 0,1, 1, 10 и 100 мкг/мл в течение трёх часов (200 семян на вариант). Контролем служили семена, обработанные водой. По 50 семян из каждого варианта раскладывали на 4 полоски фильтровальной бумаги. Скатывали полоски в рулон и помещали рулоны в стаканы с дистиллированной водой, налитой на 2 см ниже уровня нахождения семян.
Проростки пшеницы и ячменя выращивали в климатической камере при 22С (день) и 16С (ночь), 60% относительной влажности и 16-часовом световом периоде в течение 11 суток.
Спустя 10 дней от начала эксперимента, рулоны разворачивали и проводили замеры длины корней и листьев. Оценивали число зараженных проростков и степень поражения корней и корневой шейки фузариозной и гельминтоспориозной гнилями.
Трансгенные растения рапса сорта Westar и цветной капусты сорта Korso со вставкой mf3 гена и гена nptII в качестве маркёрного, были получены Кроминой К. А. и Будишевской А.А. в Институте декоративных культур (Кведлинбург, Германия). Для проведения анализа трансгенные растения, имеющие вставку гена, высаживали в сосуды с землёй, выращивали до цветения и проводили самоопыление. Полученные семена Т1 высевали в сосуды с землёй. В качестве контроля использовали семена нетрансгенных растений. Для выделения ДНК использовали высечки из первого листа растения.
Метод выделения растительной геномной ДНК. Выделение растительной геномной ДНК проводили по протоколу Edwards (1991) с изменениями по Дорохову и Клоке (1997). 40 мг листьев помещали в 1,5 мл пробирку. Добавляли 400 мкл экстракционного буфера (200 мM Трис-HСl, pH 7,5; 250 мМ NaCl; 25 мМ ЭДТА; 0,5% ДСН). Гомогенизировали ткань в пробирке пестиком. Затем помещали пробирки на 15 минут на водяную баню при температуре 65 С, за это время дважды перемешивали содержимое пробирок переворачиванием. Через 15 минут добавляли 200 мкл 5 М ацетата калия и слегка взбалтывали. Пробирки инкубировали во льду в течение 10 минут. Разрушенную ткань осаждали центрифугированием при 13400 об/мин в микроцентрифуге «MiniSpin» (Eppendorf) в течение 20 минут. Надосадочную жидкость в объеме 500 мкл переносили в новые пробирки и добавляли 500 мкл изопропанола. ДНК осаждали центрифугированием при 13400 об/мин в течение 10 минут в той же центрифуге. Осадок промывали 1 мл 65% этанола и центрифугировали в течение 10 минут при 13400 об/мин. Осадок подсушивали на воздухе и растворяли в 50 мкл деионизированной воды. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре «Ultrospec» 3100 фирмы «Amersham Pharmacia biotech» при длине волны 260 нм. Чистоту ДНК определяли по соотношению значений, получаемых при длинах волн 260 и 280 нм. Метод полимеразной цепной реакции. Для проведения одной реакции использовали 100 нг ДНК, 5 пикомоль каждого из праймеров (табл.3), 200 мкМ смесь каждого из четырех dNTPs, 1 ед. акт. Taq-полимеразы, 1,75 мМ MgCl в 1х ПЦР буфере. Общий объем реакции составлял 12,5 мкл. Во избежание испарения во время реакции сверху помещали минеральное масло в количестве 25 мкл. Реакция осуществляли в амплификаторе “Терцик” (производство фирмы «ДНК-технология», Россия) с использованием профиля: 94С - 4 минуты; 56С - 1 минута, 72С - 2 минуты, 94С - 1 минута,: 33 цикла; 56С - 1 минута, 72С - 10 минут в заключение. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле в трис-боратном буфере, содержавшем 0,89М Трис; 0,089М борную кислоту; 0,002М ЭДТА, (Sambrook efor/., 1989). Таблица 3. Олигонуклеотиды для ПЦР
Название гена Олигонуклеотид Последовательность т/3 + Pml 5 -GGT TTA CCT GCA AGG TGC AGG - 3 - Pm2 5 -ATG AGC GAT TTC TTC CTG GCT -3 nptll npt II a 5 -CGC AGG TTC TCC GGC CGC TTG GGT GG- 3 npt II b 5 -AGC AGC CAG TCC CTT CCG CTT CAG - 3 Метод гибридизации по Саузерну. Растительную ДНК подвергали рестрикции с эндонуклеазой Hind III в буфере R+ в течение ночи при температуре 37 С. Состав реакционной смеси: ДНК-30 мкг, R+ буфер-40мкл, Hind III (50 ед/мкл)– 3,6 мкл. Объём смеси доводили дионизированной водой до 400 мкл. Далее к 100 мкл смеси добавляли 2мкл РНКазы (1мг/мл) и 30 мин инкубировали при 37 С. Реакцию останавливали прогреванием смеси при 80С в течение 20 минут. После чего пробирку помещали в лёд.
Далее к 100 мкл смеси добавляли 10 мкл 5М NaCl , 220 мкл 98% охлаждённого этанола и помещали на 2 часа в морозилку. ДНК осаждали центрифугированием при 4 С, 13000 об/мин в течении 15 мин. Осадок дважды промывали 70% этанолом. ДНК высушивали под вакуумом и растворяли в 17 мкл ТЕ буфера.
ДНК (16 мкл) далее наносили в 1,2% агарозный гель в трис-боратном буфере и проводили электрофорез. После электрофореза ДНК окрашивали бромистым этидием.
Гель обрабатывали 0,25 М HCl 5 мин. Отмывали 2 раза дистиллированной водой. Денатурировали дважды по 15 мин в 0,5 М NaOH с 1,5M NaCl, отмывали водой 2-3 раза; нейтрализовали дважды по 15 мин в 0,5 M Трис с 3 M NaCl. Отмывали водой дважды. Перенос осуществляли в 20 Х SSC, на мембрану Immobilon-N (Millipore, USA) в течение ночи под гнётом. Мембрану обрабатывали ультрафиолетовым светом 50 сек. в дозе 0,5 mJ (0,5 mw/cm2), отмывали водой и помещали в бокс, содержащий гибридизационный буфер с меткой на mf3 ген, на ночь при температуре 42С и постоянном вращении. Буфер для гибридизации включал 5хSSC, 2% блокирующий реагент, 0,1 N- саркозил, 0,02% ДСН. В качестве метки на mf3 ген использовали зонды, меченные DIG, полученные методом ПЦР. После гибридизации мембрану промывали в 2x SSC, 0,1 % ДСН два раза при комнатной температуре. Затем дважды по 15 мин инкубировали в 0,1 х SSC , 0,1% ДСН при 68 С. После отмывки была проведена детекция: в буфере 1 (0,1 M Трис-HCl, pH 7,5 с 0,15 мM NaCl)-1 мин, далее-45 мин в том же буфере 1, но с добавлением блокирующего реагента, после чего мембрану помещали в Anti-DIG раствор на 30 мин, отмывали буфером 1 с добавлением Tween 20 (до 0,3%). После чего мембрану инкубировали в буфере 2 (0,1 M Трис – HCl pH 9.5 , 0,1 M NaCl) в течение 5 мин дважды. Далее мембрану помещали между двух пластиковых листов и наносили по краю буфер 2 с добавлением CDP-Star (20мкл в 2 мл). Пластик спаивали и инкубировали мембрану 5 мин при комнатной температуре и 15 мин при 37 С. Мембрану в темноте накладывали на фотопластину и оставляли на ночь. После чего изображение на фото-пластине проявляли и закрепляли.
Изучение влияния MF3 на вирусные патогены растений
Испытания защитных свойств MF3 на некрозообразующем сорте табака показали, что количество образуемых некрозов после инокуляции ВТМ зависит от концентрации белка, а вызванная обработкой устойчивость сохраняется, по крайней мере, в течение трёх недель и носит системный характер. Сорт табака Xanthy NN является устойчивым к ВТМ и для того, чтобы подтвердить защитное действие MF3, последующие испытания были проведены с использованием сорта табака Samsun nn, восприимчивого к ВТМ. Вирус после заражения растений этого сорта распространяется по растению и через некоторое время на листьях появляются симптомы в виде мозаичных светлых и тёмных участков. Учёт накопления ВТМ в растительном соке проводили методом ИФА. В первый день опыта растения опрыскивали растворами с различным содержанием MF3 (0, 10, 50 и 100 мкг/мл). Один нижний лист, изолированный во время опрыскивания, на следующий день инокулировали ВТМ. Такая постановка опыта позволила разграничить белок и вирус не только по времени, но и пространственно, что снизило возможность контактного действия. В предыдущих опытах обработку растений MF3 белком проводили лишь натиранием с помощью карборунда, в данном же эксперименте дополнительно изучали возможность MF3 оказывать защитное воздействие на растение при нанесении его методом опрыскивания. Ранее считалось, что рецепторы, воспринимающие сигнал от белковых элиситоров, находятся только внутри растительных клеток, а поскольку транспорт белков через неповреждённую клеточную стенку затруднён, обработку MF3 проводили только совместно с лёгким повреждением поверхности листьев. Но исследования Shiraishi и его коллег показали, что рецепторы могут находиться и на внешних мембранах клетки, что белок может, не проникая в клетку, передать сигнал и индуцировать защитные реакции (Shiraishi et al., 2001).
Обработанные MF3 и инокулированные растения помещали в камеру искусственного климата. Накопление ВТМ в соке растений определяли через каждые 5-10 дней. Контрольные растения, обработанные водой, накапливали высокое количество вирусных частиц в соке уже спустя 2 недели после инокуляции. В то же время на растениях, обработанных даже низкими концентрациями белка (10 мкг/мл), развитие болезни значительно задерживалось (рис. 8). Рисунок 8. Влияние обработки растений табака растворами MF3 на развитие ВТМ.
После того, как было обнаружено, что MF3 способен защищать растения табака от ВТМ, было изучено его влияние на вирусы, относящиеся к другой таксономической группе. В качестве объекта исследований был выбран Y вирус картофеля (YВК). YВК вызывает такие болезни, как полосчатая мозаика, стрик и морщинистая мозаика. Поскольку вирус поражает не только картофель, но и другие паслёновые, в том числе и табак, испытания активности MF3 против YВК были проведены на растениях табака сорта Xanthy NN.
Схема опыта была сходна с методикой, использованной в опытах на растениях табака Samsun nn и ВТМ. Верхние листья пяти растений табака были обработаны опрыскиванием растворами белка с концентрациями 0, 10, 50 и 100 мкг/мл. Инокулирование растений проводили, натирая суспензией вируса с карборундом нижний, необработанный MF3, лист каждого растения. На 12 день после начала опыта часть инокулированного листа отрезали и анализировали количество вирусных частиц в растительном соке с помощью ИФА. Содержание вируса в соке контрольных растений было высоким, в то время как в листьях опытных растений, обработанных белком, YВК накапливался в существенно меньших количествах (рис. 9).
Влияние предобработки верхних листьев табака раствором MF3 на развитие YВК на нижних, инокулированных, листьях. В данном опыте оценивали также динамику накопления YВК и его распространение в растении. Для этого анализировали пробы, приготовленные из листьев, находящихся выше инокулированных через разные сроки после заражения последних (рис. 10).
Высокое содержание вируса было отмечено в соке трёх из пяти контрольных растений на 15 день. В двух других контрольных растениях содержание вируса было несколько ниже, но к 21-ому дню все контрольные растения были сильно поражены YВК. В то же время, на растениях, обработанных MF3, наблюдалась существенная задержка в развитии болезни, если растения были обработаны раствором с концентрацией 10 мкг/мл и полное отсутствие вируса при опрыскивании раствором с содержанием белка 100 мкг/мл. В растениях, обработанных раствором с концентрацией MF3 50 мкг/мл, очень слабое накопление вируса было отмечено только к 21 дню эксперимента и после этого срока количество вируса в соке растений не увеличивалось. Таким образом, применение MF3 препятствовало накоплению и распространению YВК в растении. Как и в случае с ВТМ обработка MF3 вызывала системную устойчивость табака к YВК
Поиск и изучение элиситорного центра MF3 белка – ППИ-азы FKBP-типа, выделенного из P. fluorescens
Присутствие целевого гена в геноме растения еще не гарантирует, что данный ген будет экспрессироваться. Поэтому следующим этапом работ стал анализ уровня синтеза целевого белка в растениях, который проводили при помощи ИФА с антителами к MF3. Высечки из листьев растений взвешивали и растирали пестиком. Для осаждения растительных тканей проводили центрифугирование, надосадочную жидкость использовали для проведения анализа. Было показано (таб. 15), что уровень экспрессии гена белка в растениях рапса и цветной капусты составляет от 0 до 37 пг MF3 на мг сырой растительной ткани.
Как было показано выше, MF3 белок индуцирует в растениях устойчивость к болезням. Причём устойчивость возникает как к вирусным, так и грибным патогенам. Применение белковых индукторов устойчивости в качестве биопестицидов всегда связано с вероятностью неконтролируемого снижения их эффективности, например по причине быстрого разрушения белков протеазами. Внедрение mf3 гена в растения обеспечило синтез белка самим растением, что обычно позволяет избежать влияния факторов внешней среды. Следующей задачей стало исследование устойчивости трансгенных растений, обусловленной синтезом MF3 белка.
Проростки рапса, выросшие из семян, полученных от самоопыления трансгенных растений, анализировали на наличие mf3 гена с помощью ПЦР. Растения, содержащие целевой ген, анализировали на уровень экспрессии mf3. Вирусом инокулировали нижний лист трансгенных растений, кроме того, проводили заражение и растений, у которых ген mf3 не был обнаружен; данные растения служили контролем развития вирусной инфекции. Анализ содержания вируса в соке листьев показал, что потомство 4 трансгенных растений рапса более устойчиво к развитию ВМТ. Спустя 2 недели после инокуляции все растения линий Т1-1а3 и Т1-Т25/12 были достоверно меньше поражены вирусом. К 20-му дню эксперимента у некоторых растений вышеуказанных линий было зафиксировано увеличение содержания вируса, но по-прежнему, большая часть трансгеных растений не была поражена ВМТ. В растениях линий Т1-1а7 и Т1-Т25/3 накопление вируса происходило существенно менее интенсивно по сравнению с контрольными растениями. Задержка в накоплении вируса составляла около недели (табл.16).
Следует отметить, что зависимости между количеством MF3 в соке растений и уровнем устойчивости к вирусу обнаружить не удалось. Кроме того, не всегда более высокий уровень экспрессии обеспечивал высокую степень устойчивости. Так, растения у которых содержание белка различалось в 8 раз обладали одинаковой устойчивостью к ВМТ. Возможно, для приобретения устойчивости растениям рапса достаточно довольно небольших количеств MF3.
Для определения влияния экспрессии гена MF3-белка в растениях на уровень их устойчивости к Pl. brassicae так же как и в предыдущем опыте использовали трансгенные проростки семенного потомства трансформированных растений в качестве опытных, а нетрансгенные проростки в качестве контроля. Проростки анализировали на развитие болезни через 50 дней после инокуляции.
Для каждого семенного потомства был рассчитан процент поражённых растений по отношению к контролю. Было показано, что лишь растения рапса линии Т25/9 интенсивно поражались Pl. brassicae, развитие болезни на корнях остальных растений было существенно ниже (P 0,10), чем у контрольных растений (рис. 20).
Растения цветной капусты, полученные из семян линии Т32/7, оказались восприимчивы к Pl. brassicae, лишь 3 растения из 20 не поражались этим патогеном (рис. 20). Устойчивость трансгенных растений рапса и цветной капусты к Pl. brassicae. 1а/7, Т25/8, Т25/12, 1а/3, Т25/3, Т25/9- линии трансгенного рапса сорта Westar. Т32/7- линия трансгенной цветной капусты. Из всего вышесказанного можно сделать вывод о том, что mf3 ген нормально экспрессируется в растениях рапса и цветной капусты. Наличие белка не отражается на росте и развитии трансгенных растений.
Вместе с тем, большинство растений рапса, экспрессирующих MF3 белок, в меньшей степени поражаются ВМТ и Pl. brassicae, что делает их, несомненно, привлекательными для использования в дальнейшей селекции сортов, устойчивых к вирусным и грибным патогенам. Семенное потомство трансгенной цветной капусты не показало повышенного уровня устойчивости к Pl. brassicae, что, впрочем, может быть связано c недостаточным количеством испытуемых линий.
