Введение к работе
Актуальность проблемы. Картофель - одна из важнейших сельскохозяйственных культур. Болезни и вредители приводят к потере значительной части урожая, что наносит.большие убытки сельскому хозяйству. Введение в хозяйственную практику возделывания генетически однородных культур на больших площадях нарушает естественный баланс эволюции паразита и хозяина и приводит к возникновению массовых эпифитотий/ Вследствие этого весьма актуальной является проблема создания устойчивых к болезням и вредителям форм картофеля.
Генетическая инженерия - метод, осуществляющий перенос конкретных генов от одних организмов к другим. Он позволяет устранить репродуктивный барьер при переносе генсв между отдаленными видами. Преимущество генетической трансформации перед другими методами заключается в возможности вводить один или небольшую группу генов в растения, не нарушая других ценных признаков сорта. Процедуры генной инженерии включают в себя выявление и выделение полезного гена, клонирование выбор подходящего генетического вектора и встраивание в него этого гена, выбср оптимального метода трансформации, обусловленного как особенностями вектора, так и реципиента, выяснения эффективности экспрессии и влияние встроенного гена на растение и взаимодействующие с ним организмы.
Генетическая трансформация с помощью ssp. Agrobacterium -наиболее простой и эффективный способ введения чужеродной ДНК в клетки растения, не требующий сложного оборудования, так как в данном случае используются естественные природные векторы -бактерии рода Agrobacterium. Разработаны и разрабатываются новые методы трансгеноза. Конструируются самые разнообразные векторы для переноса полезных генов в растения, ведется поиск генов, кодирующих последовательности, вызывающие устойчивость к грибам, бактериям, л насекомым.
В настоящее время существуют векторные конструкции, несущие гены, обеспечивающие устойчивость растений к болезням и вредителям. Это конструкции с геном гамма-эндотоксина из Bacillus thuringiensis, обеспечивающие устойчивость растений чешуекрылым, бетта-эндотоксина, обеспечивающие устойчивость к жесткокрылым вредителям, в том числе и к колорадскому жуку. Недавно были открыты небольшие (30-50 аминокислотных остатков) пептиды широкого фунгицидного и антибактериального действия. Выделенные из семян различных культурных растений. Эти белки
ингибируют рост грибов гораздо эффективнее, чем антигрибные хитин-байндирующие белки и при этом не токсичны для клеток млекопитающих (Broekaert et al., 1992). Методом ПЦР синтезированы гены предшественника фунгицидного пептида амаранта и зрелого пептида, определена их нуклеотидная последовательность (Лунин и др., 1996).
Одновременно исследователями ведутся поиски новых векторов для трансформации растений. Так , например, Шаденкозым и соавторами была создана новая оригинальная конструкция агробактериального вектора 3850 LGV ph22 kneo', в котором правая граница Т-ДНК BR и белок vlrD2, отвечающий за перенос Т-ДНК, заменены на опт и белок гаоЬА плазмиды широкого круга хозяев RSF1010. В эту конструкцию был встроен ген устойчивости к биотическим стрессам Ас77 под контролем 35s промотора (Шаденков И др. 1996).
Для создания форм и сортов картофеля, устойчивых к вредителям и болезням методами генетической инженерии, представляется исключительно важным изучение и отработка эффективных и быстрых методов трансформации картофеля. Поиск новых эффективных векторов, в частности изучение эффективности трансформации различных видов и форм растений в том числе и картофеля. Изучение возможности и эффективности трансформации картофеля штаммами , несущими бинарный вектор рН22Кпео, содержащий orlT-mob-систему плазмиды широкого круга хозяев RSF1010, 3850LGVpH22kneo в рамках поиска новых эффективных векторов для трансформации. Получение и изучение трансгенных растений картофеля, несущих гены устойчивости к болезням и вредителям, в том числе дельта-эндотоксинов и генов устойчивости к биотическим стрессам, обеспечивающими устойчивость к широкому кругу фитопатогенных грибов и бактерий. Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось изучение и отработка методов быстрого и эффективного получения трансгенных растений картофеля, несущих бинарный вектор рН22Кпео, и гены Ас77 устойчивости к биотическим стрессам.
В задачи работы входило:
1. Сравнительная характеристика регенерационной способности
сортов и линий картофеля, поиск сортов и линий с высоким
регенерационным потенциалом.
2. Отработка оптимальных методов трансформации эксплантов
используемых сортов и линий картофеля.
-
Оценка эффективности трансформации сортов и линий картофеля штаммами Agrobacterlum turaefaciens и Agrobacterium rhizogenes, несущими различные векторные конструкции.
-
Подтверждение трансгенной природы полученных регенерантов.
-
Оценка полученных трансгенных растений на устойчивость к фитофторозу.
Научная новизна и значимость работы. В работе исследованы и оптимизированы различные методы трансформации для сортов картофеля северо-западной зоны Изора и Лорх, сорта Адретта и дигаплоидной линии 59 (из коллекции института генетики устойчивости Германии): кокультивирования сегментов стебля, листовых дисков и сегментов микрсклубней с агробактериями, трансформации меристематической ткани пазушных почек и прединкубации эксплантов в растворах стимуляторов роста. Для используемых в работе сортов и линий выделены и модифицированы наиболее быстрые и эффективные методы: трансформация меристематической ткани пазушных почек и прединкубации в растворах стимуляторов роста.
Исследованы штаммы Agrobacterlum, несущие бинарный вектор рН22Кпео, содержащий oriT-mob-систему плазмиды широкого круга хозяев RSF1010, 3850LGVpH22kneo и 3850LGVpH22Ac77. Полученные трансформанты эксплантов картофеля дигаплоидной линии 59 и сорта Изора показали, что эта векторная конструкция способна успешно встраиваться в геном картофеля.
Практическая ценность работы. В результате проведенных экспериментов отработаны и модифицированы методики прединкубации и трансформации меристематической ткани пазушных почек картофеля, позволяющие значительно ускорить получение трансгенных растений: трансгенные побеги получали уже через 1 месяц после трансформации, которые через 2 месяца укоренялись и могли развиваться самостоятельно.
Получены и поддерживаются трансгенные линии картофеля, которые можно использовать для дальнейших исследований.
Апробация работы. Результаты работы были.представлены на Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, декабрь 1995); на научной конференции, посвященной актуальным проблемам биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии (Москва, октябрь 1996); на отчетной сессии ученого
совета ВИЗР (Санкт-Петербург, март 1997).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатные работы.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 12Е страницах машинописного текста, состоит из введения, семи глав, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована схемами, 21 таблицами и И фотографиями. Список литературы включает 110 наименований, из них 13 на русском языке.
