Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Состояние исследований по изучаемому вопросу 9-43
1.1. Применение химических соединений в фито-вирусологии 9-25
1.2. Биохимические и физиологические особенности функционирования пэтосистемы хозяин-вирус 25-38
1.3. Стероидные гликозиды как факторы устойчивости и природные ингибиторы фитовирусов 38-43
Глава 2. Материалы и методы 44-66
2.1. Почвенно-климатическая и агротехническая типичность полевого эксперимента 44-48
2.2. Краткая характеристика материалов исследования 48
2.3. Методы изучения антивирусной активности стероидных гликозидов 48-58
2.4. Методы оценки влияния стероидных гликозидов на метаболизм растения при инфицировании вирусом 58-64
2.5. Химическая иммунизация семян как метод практического использования стероидных гликозидов 65-66
Глава 3. Изучение антивирусной активности стероидных гликозидов 67-90
3.1. Предварительная оценка антивирусных свойств стероидных гликозидов 67-73
3.2. Изучение механизма действия стероидных гликозидов 73-84
3.3. Ограничение репродукции ВТМ стероидными гликозидами в зараженном растении (in vivo ) 84-90
Глава 4. Метаболизм здоровых и зараженных вирусом растений, обработанных стероидными гликозидами.. 91-107
4.1. Изменения белкового состава листьев томатов, вызванные стероидными гликозидами 92-94
4.2. Действие стероидных гликозидов на активность рибонуклеази в зараженных и незэ-раженных растениях томата 94-101
4.3. Изменение ультраструктуры клеток растений, зараженных ВТМ, под действием стероидных гликозидов 102-107
Глава 5. Практическое применение стероидных гликозидов в качестве химических иммунизаторов для профилактики болезней томатов 108-123
5.1. Влияние стероидных гликозидов на физиологические свойства растений 110-112
5.2. Повышение общей устойчивости растений томатов под действием стероидных гликозидов 112-120
5.3. Действие стероидных гликозидов на урожайность томатов 120-123
Выводы 124-126
Литература 127-153
- Биохимические и физиологические особенности функционирования пэтосистемы хозяин-вирус
- Методы изучения антивирусной активности стероидных гликозидов
- Ограничение репродукции ВТМ стероидными гликозидами в зараженном растении (in vivo )
- Действие стероидных гликозидов на активность рибонуклеази в зараженных и незэ-раженных растениях томата
Введение к работе
Одной из важнейших задач, поставленных партией и правительством на ХШ съезде КПСС и последующих Пленумах Центрального Комитета КПСС, является успешное выполнение Продовольственной программы, цель которой - в возможно более короткие сроки надежно обеспечить население страны продуктами питания. Это не только первостепенная экономическая, но и актуальная социально-политическая задача (материалы ХХУІ съезда КПСС, 1981 г.; материалы Пленумов ЦК КПСС от 24 мая 1982 г. и от 14 июня 1983 г.).
Программа предусматривает крупные меры по улучшению снабжения населения плодоовощной продукцией и картофелем за счет дальнейшего увеличения производства и повышения их качества, а также резкого сокращения потерь продукции. Среднегодовое производство овощей и бахчевых культур в одиннадцатой пятилетке намечено довести до 33-34 млн. тонн и в двенадцатой пятилетке - до 37-38 млн. тонн. Значительно увеличить производство овощей в защищенном грунте (материалы ХШ съезда ЦК КПСС, 1981 г.). В реализации Продовольственной программы огромная роль принадлежит науке. Основная задача советских ученых - не допустить потерь урожая ценных продовольственных культур, возникающих при повреждении неблагоприятными факторами среды, вредителями и болезнями.
Итак, одним из актуальнейших вопросов современности является сокращение потерь ценной сельскохозяйственной продукции, вызываемых болезнями различного рода, в том числе и вирусными. Широкое распространение вирусных заболеваний на основных овощных и плодовых культурах приобретает все возрастающее экономическое значение. Так, например, вирус табачной мозаики (ВТМ) часто поражает томаты, вызывая мозаику, стрик и внутренний некроз плодов. Снижение уро-
5 жая от ВТМ составляет 10-65% (Авдеев Ю.И., Щербинин Б,М., 1978;
Rast А.Б.Т., 1967; Mezoly A.D., 1968; Macias W., 1971). В
условиях защищенного грунта мозаика и стрик представляют особую опасность, так как малейшие нарушения режима выращивания (например, резкие колебания температур в осенний и весенний периоды) способны привести к сильнейшим повреждениям растений. По данным Вердеревской Т.Д. (1959, 1961) и Вовк A.M. (1964) тепличные томаты поражаются мозаикой на 80-100%, стриком - на 5-40/5, причем потери урожая при этом достигают 10-20% от мозаики, и 50-60% от стрика. В условиях МССР мозаика томатов ежегодно проявляется в фазу цветения - начала плодообразования на районированных сортах, вызывая повреждения листьев на 0,4-72% (Балашова Н.Н., 1971). А так как Молдавия - основной поставщик свежих и консервированных томатов, то становится понятной актуальность защиты этой ценной культуры от возбудителей вирусных заболеваний.
В настоящее время разработаны и применяются разнообразные профилактические защитные мероприятия, но эффективность их обычно
невысока (Щербинин Б.М., 1977; Никитина М.А., 1971). Защита как
... , . v.
томатов, так и других овощных культур от фитовирусов осложняется целым рядом обстоятельств, а именно:
высокая степень агрессивности и вирулентности вирусов;
наличие большого количества природных резерваторов вирусной инфекции;
отношения синергизма между отдельными вирусами, усиливающие эффективность заражения;
характер паразитизма вирусов.
Назрела необходимость в более эффективных мерах по борьбе с возбудителями вирусных инфекций. Огромные резервы в этом плане заложены в способности самих растений сопротивляться вирусам -фитоиммунитете, который подобно иммунитету у животных, может быть
б ~
и приобретенным (Попкова К.В., 1979). Приобретенный фотоиммунитет - величина идеальная, абсолютная, которая практически недостижима. А вот приобретенная устойчивость - явление вполне реальное, возникающее у растений после перенесенного в легкой форме заболевания (естественная приобретенная устойчивость) или под действием каких-либо внешних факторов (индуцированная устойчивость). Впервые приобретенная устойчивость была достигнута при вакцинации томатов ослабленными штаммами вируса табачной мозаики. Теоретической основой для разработки вакцинации как метода защиты растений, послужили явления интерференции вирусов и перекрестной защиты (Власов Ю.И., Редько Т.А., Цыпленков А.Е., 1971; Власов Ю.И., Щербакова СВ., 1977). Отечественные вакцинные штаммы ВТМ - s -7 и Y -69, полученные соответственно в ВИЗР и Институте общей генетики АН СССР, выделены из производственных томатов и характеризуются высокой генетической активностью. Вакцинированные растения приобретают устойчивость к более агрессивным штаммам ВТМ через 7-Ю дней после введения вакцины. Она сохраняется на протяжении нескольких месяцев, то есть практически весь период вегетации. В настоящее время штамм v -69 применяют на 700 га площади производственных посадок томата защищенного грунта в совхозе-комбинате "Московский", ряде тепличных хозяйств Подмосковья, Киевской, Харьковской и Минской овощных фабриках, на Вильнюсском и Готвальдовском тепличных комбинатах. Штамм $-7 активно используют работники тепличных хозяйств Ленинградской области, Латвии, Кисловодска, Украины (Дубровская Е.М., 1982; Кузнецова И.Ф., 1980).
Индуцированная устойчивость может возникать у растений вслед' ствие обработки их определенными соединениями (Коваленко А.Г., Щербатенко И.О., Коган Э.М., 1980; Kassanis в., White R.P., 1977; Kassanis В., 1980).
Часто для этих целей применяют вещества, которые, как показали эксперименты in vitro обладают антивирусной активностью. Однако, к сожалению, многие ингибиторы фитовирусов наряду с антивирусным имеют и фитотоксический эффект. В результате этого при практическом использовании таких соединений антивирусное действие оказывается значительно слабее фитотоксичности, и вопроса об их применении на практике не возникает. Так, например, в Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН УССР испытано 700 различных веществ и среди них выявлено 165 ингибиторов, подавляющих ВТМ, вирус огуречной мозаики, вирус бронзовости
ТОМаТОВ, X, Y, S, Ж - ВИРУСЫ Картофеля В УСЛОВИЯХ in vitro
на 33-75% и более (Бобыръ А.Д., 1972). Однако почти все исследуемые ингибиторы проявляют фитотоксичность in vivo. Поэтому они не используются для практических целей.
Стероидные гликозиды, изучаемые нами, обладают биологической активностью. Они являются вторичными метаболитами и выполняют в растениях функцию биорегуляторов обмена веществ, входя в состав клеточных мембран (Кинтя П.К., Лазурьевский Г.В., 1979). Известно, что стероидные гликозиды могут быть факторами устойчивости в растениях при поражении их фитопатогенными микроорганизмами (<*-томатин - возможный ингибитор..., 1976; Балашова Н.Н., 1979). Следовательно, в потенциале они могут быть индукторами приобретенной фитоустойчивости (Дьяков Ю.Т., 1983). Кроме того, нами установлена антивирусная активность ряда стероидных гликозидов (Изучение антивирусной активности..., 1982; Балашова И.Т., 1984). Все перечисленные выше факты говорят о том, что стероидные гликозиды как факторы устойчивости и ингибиторы фитопатогенных вирусов вполне могли бы применяться в целях защиты растений. Однако следует согласиться с Бобырем А.Д., что химиопрофилактику и терапию вирусных болезней нельзя решать в отрыве от биохимических, физио-
логических и других процессов, протекающих в растении и определяющих репродукцию в нем вируса и токсичность ингибитора к растению-хозяину (1971). В связи с этим, целью данной работы явилось изучение антивирусной активности, характера действия и возможностей практического применения стероидных гликозидов, как индукторов устойчивости томатов к вирусу табачной мозаики. Впервые исследован по системе критериев характер действия соединений класса стероидных гликозидов на вирусе табачной мозаики. Показано комплексное воздействие этих веществ: они снижают инфекционность вируса in vitro без нарушения антигенных свойств и структуры частиц и изменяют метаболизм растения-хозяина, активизируя РНК-азу, индуцируя образование новых белков и стабилизируя ультраструктуру клетки. Практическая значимость данной работы обусловлена повышением общей устойчивости и урожайности томатов при обработке семян стероидными гликозидами.
На защиту автором выносятся следующие положения, составляющие задачи исследования:
Изучение антивирусной активности стероидных гликозидов по отношению к ВТМ в системах in vitro и in vivo. Установление зависимости антивирусных свойств от структуры стероидного соединения.
Исследование взаимодействия стероидного гликозида с вирусной частицей.
Выявление механизма функционирования стероидного гликозида в патосистеме томаты - ВТМ.
4-. Электронномикроскопический анализ характера действия стероидного гликозида на вирусную частицу и ультраструктуру растительной клетки.
5. Практическое испытание стероидных гликозидов как химических иммунизэторов с целью повышения общей устойчивости и урожайности растений.
- .9
Биохимические и физиологические особенности функционирования пэтосистемы хозяин-вирус
При заражении растения происходит изменение его физиологических и биохимических свойств - заболевание. Заболевшее растение представляет собой особую систему, свойства и функции которой Определяются взаимодействием хозяина И Паразита ( Robinson R.A., 1980).
Паразит стремится завоевать источник питания и жизни (в случае облигатного паразитизма); хозяин стремится противостоять разрушающему действию паразита. В результате этого возникает новая система с новыми свойствами, которые определяются , с одной стороны, вирулентностью патогена, а с другой стороны - защитной реакцией хозяина (Вавилов Н.И., 1935). Различный уровень вирулентности возбудителя обычно обеспечивается существованием определенного набора штаммов с широким спектром вирулентности (Власов Ю.Й., 1977). Механизм защиты хозяина гораздо сложнее, что объясняется более высоким уровнем его организации по сравнению с паразитом. Существует достаточно сведений, позволяющих судить о защитных реакциях хозяина в ответ на вторжение патогена.
Существование у растений определенного механизма защиты от заражения вирусами доказывается наличием устойчивых и сверхчувствительных сортов, которые либо не допускают инициации инфекционного процесса (в первом случае), либо ограничивают его развитие (в последнем случае). Однако характер действия этого механизма в зараженном растении до сих пор еще остается загадкой.
Первоначально было высказано предположение, что в зараженных клетках растения происходит синтез веществ, обладающих защитными свойствами ( Loebenstein G., 1962). Присутствие вируса в растении рассматривалось как явление, необходимое для включения защитного механизма и успешного функционирования его при последующем заражении тем же вирусом или его штаммами. Препарат, обладающий антивирусными свойствами, содержится и в тканях сверхчувствительных растений, окружающих ЗОНу некроза ( Ross А.P., 1961; Kassa nis в., 1981),и в тканях устойчивых растений (Князев В.А., 1971; липсиц Д.В., 1971; Sela I., Applebaum Sh.W., 1962).
Он обуславливает системную устойчивость сверхчувствительных растений к повторному заражению, причем устойчивость эта является вирусспецифической ( Ross А.P., 1981). Sela I., Applebaum.Sh.W. (1962), используя гидратированный кальций-фосфатный гель, выделили этот Препарат из листьев Mcotiana glutinosa L. Через 2 ДНЯ после заражения их ВТМ и назвали его "антивирусным фактором". Вирусиндуцированный антивирусный фактор (АВФ) был выделен и из растений томатов, пораженных ВТМ (Катин И.А., Елисеева В.Н., 1980). Причем установлено, что АВФ локализуется в пост-рибосо-мальной и митохогдриальной фракциях (Катин И.А., 1982). В дальнейшем удалось выделить антивирусный фактор в активной форме и установить его химическую природу. АВФ, связанный с конканавали-ном А, является частично восприимчивым к альфа-глюкозидазе. Он восприимчив к протеиназе только тогда, когда инкубируется в условиях, подходящих для протеолизиса гликопротеинов. Щелочная фосфатаза влияет на электролитическую подвижность АВФ, но не аннулирует его антивирусной активности. АВФ не восприимчив, к ДНК-азе, бета-глюкозидазе и панкреатической липазе. АВФ, по-видимому, является фосфогликопротеином с молекулярным весом около 22000, содержащим 80% белка И 9% углеводов ( Mozes R. , Antignus Y., Sela I., 1978).
В последующих публикациях появились сообщения о том, что АВФ не инактивирует вирусныв частицы in vitro; но способен ограничивать размножение вируса в листьях, зараженных РНК ВТМ. Изучение динамики синтеза вируса в различных вариантах позволило прийти к заключению, что АВФ ингибирует не проникновение и депротеини-зацию вирусных частиц в клетке, а процессы репликации ВТМ, происходящие не ранее, чем через 2 часа после инокуляции (Коваленко А.Г., 1983).
Методы изучения антивирусной активности стероидных гликозидов
Выдвигая предположение об антивирусной активности стероид ных гликозидов, мы основывались на выводах разрозненных публика ций о противовирусных свойствах сапонинов и тритерпеновых глико зидов, содержащихся В СОКе растений семейства Araliaceae (ИНГИ биторы ВТМ в соке растений..., 1974; Ингибиругощее действие три терпеновых гликозидов..., 1978). Однако о действии стероидных гликозидов і на фитовирусы пока мало что известно (Кинтя П.К., Лазурьевский Г.В., 1979). Поэтому, прежде чем изучать стероидные гликозиды как возможные средства защиты растений от вирусных инфекций, предстояло установить, обладают ли они антивирусной активностью. Предварительные эксперименты по изучению противовирусных свойств стероидных гликозидов были проведены на вирусе табачной мозаики (ВТМ). Использовали как инфекционный сок, полученный из листьев томатов, зараженных ВТМ, так и препарат очищенного вируса. Активность стероидного гликозида определяется тем, как он изменяет количество вирусных частиц в опытном варианте по сравнению с контрольным. В случае уменьшения этого показателя можно говорить об антивирусной активности исследуемого соединения.
Поэтому основным этапом изучения противовирусной активности стероидных гликозидов является количественная оценка содержания вирусных частиц в исследуемом образце. Известно 3 главных метода определения количественного содержания вируса: 1) определение инфекционности; 2) серология; 3) действие физических и химических факторов на вирус (Мэтьюз Р., 1973). Метод определения инфекционности был выбран в качестве основного метода исследования антивирусных свойств стероидных гликозидов, т.к. согласно сообщениям некоторых авторов, он наиболее достоверно отражает истинное количество вирусных частиц в препарате (Мэтьюз Р., 1973; Гиббс А., Харрисон Б., 1976). Точность этого метода близка к точности электронного микроскопирования ( ciark А. P., Adams A.N., 1977). В 1929 году Holmes P.O. показал, что местные некротические поражения, Образующиеся на ЛИСТЬЯХ Nicotiana glutinosa L. в результате механической инокуляции ВТМ,можно использовать для оценки относительной инфекционности вируса. С тех пор этот метод получил широкое распространение, благодаря своей простоте и достаточной достоверности. Однако при определении инфекционности необходимо, по мнению некоторых авторов (Мэтьюз Р., 1973), учитывать: 1) колебания в числе местных поражений, образуемых стандартным инокулюмом вируса на разных листьях; 2) разведение вирусного инокулима; 3) необходимость статистической обработки результатов для получения надежной сравнительной оценки инфекционности образцов. В соответствии с этими требованиями при анализе инфекционности различных образцов инокулюма, использовали широко известный метод половинок, при котором стандартным и опытным инокулюмом инокулируют разные половинки одного и того же листа и. giuinosa L. При этом выбирали хорошо развитые листья среднего яруса в количестве 30 штук (по 6 листьев на пяти растениях). Разведение инокулюма и в опытном, и в стандартном образцах всегда было 1:2. статиотическую Обработку данных проводили по Kleczkowski А. (1955) и сравнивали с показателем степени ингибирования (verma v.s., Raychandhuri s.p., Khan A.M., 1970).
В ходе предварительных экспериментов установлено, что существенное снижение инфекционности вирусных частиц на 5%-ном уровне значимости наблюдается в том случае, когда степень снижения инфекционности, вычисленная по Verma v.s. et ai., больше, либо равна 20%. I. Навески стероидных гликозидов, сделанные на аналитических весах, обрабатывали растворителем (метанол + дистиллированная вода, в соотношении 1:1, I мл). 2. Добавляли инфекционный сок или препарат очищенного вируса до получения в смеси нужной концентрации гликозида (исследуемые концентрации 0,005% и 0,08%). 3. Полученная смесь инкубировалась 24 часа в холодильнике Calex при температуре -1-3С. 4. Смесью натирали листья индикатора N. giutinosa L. по схеме: левая половинка листа от черешка - контроль, правая -опыт. В качестве контроля использовали смесь растворителя с дистиллированной водой в такой же пропорции, как с инфекционным соком или препаратом очищенного вируса. Повторность опыта 30-ти кратная. 5. Через 6 дней проводили подсчет некрозов на обеих половинках ЛИСТа. Данные Обрабатывали ПО Kieczkowski А. (1955) И Verma v.s. et ai. (1970). Инфекционный сок получали из листьев томатов восприимчивого сорта Тепличный 200, зараженного ВТМ штаммом О (ПО классификации Cirulli М. , Alexander L. 1.,1966) МЄХаниЧЄСКИМ способом. Препарат очищенного вируса готовили по методике З.Клемента, З.Кирай, Ф.Шоймопш, Й.Вереша (Методы фитопатологии, 1974) с небольшими изменениями.
Ограничение репродукции ВТМ стероидными гликозидами в зараженном растении (in vivo )
Как было отмечено в обзоре литературы, при заражении растения паразитом возникает новая биологическая общность - пэтосисте-ма, свойства и функции которой определяются особенностями взаимодействия хозяина и паразита. Применяя новый препарат, мы стремимся направить его действие в благоприятную для нас сторону - нормального функционирования организма хозяина и подавления функций паразита. Для этого не обязательно полностью или частично уничтожать паразитическую особь, достаточно ограничить ее функции. Необходимо помнить, что патосистема - это подсистема экосистемы (Robinson R.A,,I980). В свете этой теории паразитический организм представляет собой неблагоприятный для растения биологический фактор внешней среды. Задача фитопаголога заключается в том, чтобы помочь растению адаптироваться к этому фактору и нормально функционировать даже в его присутствии. На практике это означает снижение степени поражений растений тем или иным заболеванием, сокращение потерь сельскохозяйственной продукции от вирусных болезней, что, в конечном итоге, приводит к получению высоких и стабильных урожаев. В связи с этим при разработке новых антивирусных средств нужно исходить не столько из того, как действуют они на вирусные частицы, сколько из эффективности их действия в снижении поражаемости растений-хозяев.
Основным критерием при оценке эффективности ингибитора должна стать степень ингибирования развития болезни в зараженном растении ( in vivo). Определение степени ингибирования in vivo является завершающим этапом научных разработок нового антивирусного препарата перед тем, как рекомендовать его производству. Работу in vivo проводили на сеянцах томатов, зараженных ВТМ, которые обрабатывали стероидными гликозидами. Затем определяли инфекционность сока, полученного из листьев этих растений. Данные биологического Тестирования Обрабатывали ПО Kleczkowski А. (1955) (для определения достоверности и существенности ингибирую- Результаты эксперимента, приведенные в табл. 3.7, убедительно показывают, что все испытанные гликозиды, кроме мелангозидов, обладают антивирусной активностью in vivo. Степень ингибировэния репродукции вируса изменяется во времени. Почти у всех гликозидов она снижается, но у прототомзтина, бешарнарозида и дигитонина - повышается.
Разные значения степени ингибирования и разная длительность функционирования объясняются, по-видимому, различным химическим строением стероидных гликозидов. На примере вирусов человека и животных показано, что антивирусная активность фенил-гли- зависит ОТ ИХ Структуры ( Arita Н. , Sugita к. , 1978). С помощью логико-структурного анализа было установлено, что биологическая (антимикробная, фунгицидная, антиоксидантная и мембранная) активность стероидных гликозидов также определяется особенностями их химического строения. Существенную роль при этом играют: 1) количество Сахаров в полисахаридной цепи; 2) порядок их связывания с генинной частью молекулы; 3) стереохимические особенности згликона; 4) количество гидроксильных групп в нем. Наиболее активными являются соединения, которые содержат в своем составе более четырех Сахаров. Связь через с3 у них осуществляется за счет галактозы, к которой последовательно присоединяются 2 молекулы глюкозы, а к ним ксилоза или рамноза. Обычно такие соединения относятся к спиростаноловому ряду (Корреляция между строением..., 1983). Поэтому исследование ингибирующего действия стероидных гликозидов in vivo проводилось параллельно с изучением их структуры.
Действие стероидных гликозидов на активность рибонуклеази в зараженных и незэ-раженных растениях томата
Рибонуклеаза представляет собой фермент фосфодиэтеразу, который расщепляет межнуклеотидные связи РНК. При поражении растений вирусными заболеваниями активность РНК-азы в листьях увеличивается (Влияние кинетина на активность РНК-эзы,/Р?4 Reddi к. к. , Mauser L.J. , 1965). Рибонуклеаза действует как на РНК хозяина, так и на РНК вируса (Торопковэ О.А., 1982). Поэтому некоторые авторы считают, что увеличение активности РНК-азы может быть направлено на разрушение нуклеиновой кислоты вируса, и, следовательно, служить защитной реакцией растения (Влияние кинетина на активность РНК-азы..., 1976). Повышение степени активности РНК-азы может быть вызвано синтезом фермента в поврежденных тканях усиление РНК-азной активности в листьях больных растений при заражении ВТМ и ХВК (Пантюхина В.А„, Рейфман В.Г., Руцкова В.Р., 1973; Пантюхина В.А., Рейфман В.Г., 1974). В дальнейшем было установлено, что рост активности РНК-азы в инфицированных вирусом листьях является неспецифической ответной реакцией растения на внедрение патогена (Пантюхина В.А., Рейфман В.Г., Кэзэчковэ Л.А., 1977). При механическом заражении увеличение активности фермента в первый период обусловлено, несомненно, освобождением его из связанного состояния, вызываемого повреждением тканей; в последующем - это ответная реакция на поражение вирусом (Пантюхина В.А., Рейфман В.Г., Кэзачкова Л.А., 1980).
Исследование влияния фитогормонов на рибонуклеазную активность выявило, что кинетин, например, в низких концентрациях снижает активность фермента, и, наряду с этим увеличивает инфекцион-ность сока больных листьев (Влияние кинетина на активность РНК-азы..., 1976), а гибберелин повышает активность РНК-азы и это сохраняется продолжительное время. Повышение содержания нуклеаз в клетке, индуцированное гиббереллином, по-видимому, в какой-то мере оказывает свое действие на деполимеризацию нуклеиновой кислоты вируса в момент ее освобождения из белковой оболочки, вследствие чего концентрация вируса ХВК в листьях картофеля, обработанных гиббереллином до их заражения, была незначительной (Ееребчук Л.К., Олевинская З.М., 1980).
Изучение активности ключевого фермента, участвующего в метаболизме нуклеиновых кислот, явилось важным этапом нашей работы. Задача состояла в том, чтобы выяснить, каким образом стероидные гликозиды изменяют активность РНК-азы при заражении восприимчивого сорта томатов ВТМ. Исследование проводили в динамике, с учетом времени, в течение которого происходит репликация вируса. Для оценки характера действия 2-х факторов на активность фермента вводится 3 контроля:
Модельный препарат - пурпуреэгитозид-использовзли в низкой концентрации (0,005%). Повторность опыта была 3-х кратная. Цифровые данные, полученные при работе с РНК-азой, обрабатывали по Доспехову Б.А. (1979). Наряду с изучением активности фермента, проводили исследование инфекционности сока, полученного из листьев тех же растений. В ходе исследования применяли биотест, используя
В Качестве ИНДИКатора Nicotiana glutinosa L., ЛИСТЬЯ КОТОРОЙ ИНО кулировэли по изложенной выше схеме (см. стр.52). В качестве контроля использовали сок из листьев растений, инокулированных ВТМ, но не обработанных СГ. Степень ингибирования вычисляли по формуле Verma V.S. , Raychandhuri S.P. , Khan A.M. (1970). Результаты опыта по изучению защитных реакций восприимчивого растения в ответ на заражение приведены ниже (табл. 4.1 и 4.2). возрастает примерно в одинаковой степени. Наибольшая активность РНК-азы отмечена у вариантов, когда обработка гликозидом проводится за 24 часа до инокуляции, сразу или через час после инокуляции втм.
