Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема нозокомиальных инфекций (НИ) является одной из важнейших для современного здравоохранения и с каждым годом приобретает всё большую медицинскую и социальную значимость. Во многих странах наблюдается рост инфекционной заболеваемости в стационарах лечебных учреждений, что существенным образом связано с распространением штаммов микроорганизмов, устойчивых к различным антибактериальным препаратам.
Одним из возбудителей НИ является представитель группы неферменти-рующих грамотрицательных аэробных бактерий - Acinetobacter baumannii, играющий важную роль в инфекционной патологии у пациентов, находящихся на стационарном лечении. В отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ), а также в ожоговых отделениях^, baumannii часто становится причиной развития госпитальных пневмоний, раневых инфекций (в том числе у больных с термическими поражениями), менингитов (при нейрохирургических вмешательствах и травмах спинного мозга), эндокардитов, перитонитов, абсцессов мозга и лёгких, урологических катетерных инфекций, постхирургических осложнений, бактериемии и септицемии (Metan et ah, 2007; Rizos et al, 2007; Peleg et al, 2008; Towner, 2009).
Клиническая значимость A. baumannii существенно выросла за последние 20 лет. В первую очередь это связано с тем, что для данного микроорганизма характерны механизмы резистентности, обеспечивающие устойчивость к подавляющему большинству антимикробных препаратов (Van Looveren et al, 2004; Peleg et al, 2008; Zavascki et al, 2010). Другими клинически значимыми особенностями A. baumannii являются: устойчивость к дезинфицирующим средствам, высушиванию, ультрафиолетовому облучению, толерантность к детергентам (Wendt et al, 1997; Webster et al, 1998; Towner, 2009). Высокая выживаемость на объектах внешней среды и способность персистировать в течение продолжительного периода в условиях больничного окружения увеличивает риск передачи этого микроба через медицинский персонал или предметы обихода (Catalano et al, 1999; de Oliveira & Damasceno, 2010).
На основании вышесказанного весьма актуальным является своевременное выявление A. baumannii, быстрая идентификация данного микроорганизма и, что особенно важно, поиск новых антибактериальных средств против инфекций, вызванных A. baumannii. Одним из возможных путей решения последней проблемы может быть применение литических фагов. К настоящему времени накоплено множество данных об эффективном использовании бактериофагов для лечения бактериальных инфекций, в том числе госпитальных, вызванных, например, P. aeruginosa или S. aureus (Merabishvili et al, 2009; Kutter et al, 2010). Однако ни в нашей стране, ни за рубежом нет препаратов бактериофагов для контроля внутрибольничных А. Ьаитаппіі-шіфєкцті.
Это связано, в первую очередь, с отсутствием коллекций перспективных фагов, которые могли бы быть использованы для разработки лечебных препа-
ратов, а также с узким спектром антибактериальной активности известных ли-тических фагов, инфицирующих A baumannii.
Цель исследования - выделение, молекулярно-генетическая характеристика и изучение биологических свойств вирулентного бактериофага, специфически инфицирующего и лизирующего широкий спектр клинических штаммов A. baumannii.
Задачи исследования:
-
Создание коллекции и молекулярно-генетическая характеристика клинических штаммов A. baumannii.
-
Поиск бактериофагов, лизирующих бактерии рода Acinetobacter, в образцах клинического материала и пробах из окружающей среды.
-
Определение таксономического положения и изучение биологических свойств бактериофага, обладающего широким спектром литического действия по отношению к клиническим штаммам A. baumannii.
-
Визуализация специфического взаимодействия бактериофага с бактериальной клеткой и характеристика различных стадий инфекционного процесса с помощью атомно-силовой микроскопии.
-
Изучение генома бактериофага с широким спектром литического действия.
Научная новизна.
Впервые выделен литический бактериофаг АР22 семейства Myoviridae, инфицирующий широкий круг клинических штаммов A. baumannii (приоритет защищен патентом РФ № 2439151). Бактериофаг обладает выраженной видо-специфичностью, высокой скоростью адсорбции при взаимодействии с бактериальной клеткой и высокой урожайностью.
Впервые для бактериофагов, лизирующих A. baumannii, проведена визуализация специфического взаимодействия в системе «литический бактериофаг -бактериальная клетка» и изучены различные стадии инфекционного процесса методом атомно-силовой микроскопии.
Впервые определена полная нуклеотидная последовательность ДНК и получены данные о структуре генома бактериофага семейства Myoviridae, лизирующего бактерии A. baumannii.
Практическая ценность работы.
Создана коллекция, включающая 130 идентифицированных и генетически типированных антибиотикоустойчивых штаммов A. baumannii, выделенных от больных крупных стационаров Европейской части России и Южного Урала в 2005-2010 гг.
Депонированы в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ-Оболенск») ФБУН ГНЦ ПМБ под номерами В-7125 - В-7134 десять штаммов A. baumannii - представителей разных генетических групп (Федеральный уровень внедрения).
Депонирован в «ГКПМ-Оболенск» под номером Ph42 охраноспособный бактериофаг АР22 (Федеральный уровень внедрения). Результаты изучения ли-тических свойств и геномного анализа бактериофага АР22 позволяют рекомендовать его для разработки лечебных препаратов против А Ьаитаппіі-шіфєкцті,
а также использовать для идентификации А. Ьаитаппіі при бактериологическом анализе клинического материала.
Размещена в Европейской базе данных EMBL под номером НЕ806280 и базе данных GenBank под номером NC017984 полная нуклеотидная последовательность ДНК бактериофага АР22 (международный уровень внедрения).
Результаты диссертационной работы использованы в лаборатории молекулярной биоинженерии ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН для клонирования, экспрессии и изучения пространственной структуры белка фибрилл и белка выростов хвостового отростка фага.
Положения, выносимые на защиту
-
На протяжении нескольких лет (с 2005 по 2010 гг.) в стационарах крупных городов России (Москва, Санкт-Петербург, Нижний Новгород, Челябинск) циркулируют две доминирующие генетически однородные группы бактерий А. Ьаитаппіі, объединяющие 82 % клинических штаммов.
-
Бактериофаг АР22 принадлежит к семейству Myoviridae, является видо-специфическим, обладает широким спектром литической активности по отношению к клиническим штаммам А. Ьаитаппіі, высокой скоростью адсорбции при взаимодействии с бактериальной клеткой и высокой урожайностью.
3. Геном бактериофага АР22 представлен двунитевой ДНК размером
46387 п.н., содержит 89 потенциальных генов, среди которых идентифицирова
ны гены, кодирующие структурные протеины, ферменты, ответственные за ли
зис бактериальной клетки-хозяина и компоненты системы репликации ДНК.
4. Атомно-силовая микроскопия является эффективным методом визуали
зации специфического взаимодействия литического фага АР22 с бактериальной
клеткой, а также изучения особенностей структуры данного бактериофага, бак
териальных клеток А. Ьаитаппіі и формируемых ими клеточных агрегатов.
Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов отдела молекулярной микробиологии ФБУН ГНЦ ПМБ в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные исследования и разработки с целью обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия и снижения инфекционной заболеваемости в Российской Федерации» (на 2011-2015 гг.); Гос. регистрационный № 01201172662 (тема№ 045 «Разработкаи исследование новых дезинфектантов, антимикробных и инсектицидных препаратов»).
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена лично автором; результаты, описанные в отдельных главах получены в сотрудничестве с к.б.н. Воложанцевым Н. В., к.б.н. Жиленковым Е. Л., Мякининой В. П., к.б.н. Красильниковой В. М., к.б.н. Богуном А. Г., к.ф-м.н. Дубровиным Е. В., к.б.н. Платоновым М. Е., д.б.н. Игнатовым С. Г. и д.в.н. проф. Светочем Э. А.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены, доложены и обсуждены на восьми российских и международных конференциях: школе-конференции молодых учёных и специалистов научно-исследовательских организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Биобезопасность в современ-
ном мире», Оболенск, 2009 г. (Ill место на конкурсе устных докладов); the 12th SAC Seminar «Combating Global Infections», Иркутск, 2009 г.; XII Международном конгрессе МАКМАХ по антимикробной терапии, Москва, 2010 г. (I место на конкурсе постерных докладов); «Microbial Viruses: Genomics, Evolution and Applications in Ecology, Biotechnology and Medicine», Белфаст, Великобритания, 2011 г. (I место на конкурсе постерных докладов); E-MRS 2011 Spring Meeting, Ницца, Франция, 2011 г.; 19th Biennial Evergreen International Phage Biology Meeting, Олимпия, США, 2011 г. (II место на конкурсе постерных докладов); II Международном Конгрессе по внутрибольничным инфекциям, Москва, 2011 г.; the EMBO conference «Viruses of Microbes», Брюссель, Бельгия, 2012 г.
План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ от 29 января 2009 г. (протокол № 1) с изменениями, утверждёнными на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ от 1 ноября 2012 г. (протокол № 9). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного семинара ГНЦ ПМБ (протокол № 25 от 26 октября 2012 г.).
Публикации. Основное содержание работы отражено в 12 научных публикациях, в том числе в 3 статьях в рецензируемых журналах из перечня ВАК и в одном патенте РФ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 159 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, две главы результатов исследований, обсуждение результатов, выводы и указатель литературы, включающий 26 работ отечественных и 260 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 20 рисунками и 8 таблицами.
