Введение к работе
Актуальность проблемы.
Инфекция мочевыводящих путей (ИМП) - это одно из наиболее распространенных урологических заболеваний На сегодняшний день кишечная палочка определена как один из основных этиологических факторов заболеваний мочевыводящего тракта В 70-90% случаев Escherichia coh является причиной цистита, уретрита и пиелонефрита
Колонизация слизистой хозяина патогенными микроорганизмами является обязательным этапом для возникновения и развития заболевания Определяющим фактором успешной колонизации, первым этапом в возникновении инфекционного процесса считается прикрепление бактерий к эпителиальной поверхности, те адгезия патогенных микроорганизмов к клеткам-мишеням
Адгезия кишечной палочки осуществляется в первую очередь благодаря пилям первого типа, или фимбриям, несущим специфический белок, адгезии FimH, способный узнавать структуру маннозных рецепторов эпителиальной ткани и осуществлять с ними взаимодействие
Способность адгезинов избирательно взаимодействовать с теми, или иными рецепторами, определяет тканевой тропизм патогенных вариантов кишечной палочки Разные структурные варианты FimH демонстрируют сходный высокий уровень тропизма к триманнозным (ЗМ), но различный тропизм к мономаннозным (1М) рецепторам Высокий уровень сродства к 1М-рецепторам ассоциируется с уропатогенными штаммами Е colt Изменение адгезивного фенотипа связано с возникновением точечных мутаций в различных участках fimH, это так называемые патоадапгивные мутации Бьшо замечено, что в fimH имеются определенные нуклеотидные позиции, в которых вышеуказанные мутации происходят чаще, чем в других участках, подобный феномен был назван "горячие точки" (hot spot) Изучение эволюционной динамики Е coh с высокоадгезивным 1М фенотипом, закономерностей их адаптации к той или иной экологической нише (кишечник или мочевой тракт) очень важно для понимания путей энтеробактериальной патогенной диссеминации, и поисков путей к ее предотвращению
Для обеспечения адгезии к клеткам-мишеням пили должны быть функционально полноценными и представлены на поверхности бактерии в достаточном количестве В данной работе изучалось влияние изменения уровня экспрессии различных генов ^ш-кластера на способность бактерии формировать функционально полноценные фимбрии, а также проверялась гипотеза о возможной роли субъединиц FimH пилинового (ПД) и лектинового (ДД) доменов в процессе биогенеза фимбрий
E coh имеет и другие факторы адгезии, кроме фимбрий первого типа, способствующие колонизации бактерией мочевыводящего тракта Среди них Dr фимбрий, взаимодействующие с DAF (decay-accelerating factor), присутствующим на поверхности ряда эпителиальных клеток (Medof, 1987), и коллагеном IV типа В связи с этим представляется интересным проследить возможные патоадаптивные изменения, происходящие параллельно в двух различных адгезивных органеллах, способствующих развитию заболеваний мочевыводящего тракта (Connell, 1996 Seran, 2005)
Цель и задачи исследования.
Целью настоящих исследований являлось изучение биогенеза пилей первого типа, изучение популяционной динамики К coh внутри пациента в течение заболевания в различных экологических нишах, изучение патоадаптивной эволюции Е colt под влиянием направленного отбора, конверсии комменсальных штаммов кишечной палочки в потенциально патогенные путем набора точечных мутаций, меняющих адгезивный фенотип штаммов
Для достижения вышеуказанных целей последовательно решались следующие задачи определить влияние уровня экспрессии белков fim-оперона на формирование пилей первого типа, определить минимальную структурную единицу FimH, необходимую для биогенеза пилей первого типа, провести филогенетические исследования в выборке E.coh, изолированных от пациентов с инфекцией мочевыводящего тракта, а также генетический и функциональный анализ адгезина FimH, на примере пациента ТОР 17 проанализировать роль патоадаптивных мутаций в развитии инфекций мочевых путей, в группе штаммов Ecoh, имеющих Dr фимбрий и пили первого типа, проследить патоадаптивную эволюцию обоих адгезинов
Научная новизна.
Впервые изучено влияние уровня экспрессии отдельных компонентов fim-оперона на количество функциональных пилей на поверхности бактерии, для чет были созданы конструкты, содержащие fitriH. или весь ^їтя-оперон в различных экспрессионных системах Было показано, что значительное увеличение количества функциональных пилей на поверхности клетки достигается только при увеличении экспрессии всех компонентов fim-оперона, селективное увеличение продукции FimH не существенно влияло на экспрессию функциональных фимбрий
Впервые проверялась гипотеза о роли лектинового домена (ЛД) в инициации сборки пилей Было показано, что для биогенеза пилей не достаточно только ПД, являющегося связующим звеном между адгезином и собственно фимбрией, необходимы обе субьединицы FimH - ЛД и ПД
Впервые был найден пример патоадаптивной эволюции адгезина FimH в
пределах одного пациента и прослежена популяционная динамика Е coh на протяжении развития мочевой инфекции от острого цистита, асимптоматической бактериурии, к хроническому циститу, в различных экологических нишах (мочевой тракт и кишечник) Подтвердилась гипотеза о том, что патоадаптивные мутации, дающие преимущество колонизации мутантному штамму относительно исходного варианта в новой экологической нише, в то же самое время способствуют элиминации мутантного штамма из первичного, естественного биоценоза Было показано, что чем более выражен новый признак у мутанта, тем меньше у него возможность удержаться в организме хозяина
Впервые была прослежена патоадаптивная эволюция, происходящая параллельно в двух адгезивных органеллах - пилях первого типа и Dr фимбриях
Практическая значимость.
Понимание механизмов патоадаптации бактерий к условиям новой экологической ниши помогает отличать потенциально патогенных Е coh от комменсальных вариантов и дает ключ к созданию медицинстких препаратов, селективно направленных против патогенных штаммов бактерий
Изучение популяционной динамики бактерий в различных экологических нишах в течение заболевания даст возможность выявить источник потогенных бактерий, оценить вероятность их персистенции в очаге инфекции или повторного заражения, и прогнозировать переход заболевания в хроническую форму
Известно, что механизм сборки фимбрий с участием шаперона и ушера, посредством которого осуществляется биогенез пилей первого типа Е СОІІ, используется большим количеством патогенных бактерий для формирования более тридцати видов различных адгезивных органелл (Soto, 1999) Пили первого типа являются типовой моделью для изучения данного механизма
Положения, выносимые на защиту.
Селективное увеличение продукции FimH не приводит к значимому увеличению уровня экспрессии функциональных пилей, для увеличения количества функциональных пилей на поверхности клетки необходим высокий vnoBgHb экспрессии всех генов^"г-оперона
ЛД необходим для инициации биогенеза пилей
Штаммы Ecoh с высоко адгезивным 1М фенотипом могут селектироваться в ходе колонизации одного пациента и быстро элиминироваться из циркуляции, что определяется особенностями взаимодействия FimH с рецепторами в условиях потока жидкости
Большинство штаммов, имеющих DrE фимбрий, принадлежат к
одной клональной группе, внутри которой наблюдается очень быстрая патоадаптация адгезина
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на семинарах кафедры микробиологии Ун-та шт Вашингтон (Сиэтл, 2004 - 2006 гг) и кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН (Москва, 2005 г)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи
Объем и структура работы. Диссертация изложена на стр
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего^ /источника Работа иллюстрирована а рисунками и Ч таблицами
В работе использовали штаммы Е coh VB## (Beskhlebnaya, 2006), ELT###, KB18, KBC235 (Klemm, 1985 Blomfield, 1991 Sokurenko, 1994), дикие штаммы, полученных из коллекции Е Сокуренко (Seattle, WA, USA), а также клинические изоляты, предоставленные М Сох (Seattle, WA, USA) Использованы мультикопийные плазмиды (15-20 копий на клетку) pGB##, pFU, pPKL9, pPKLlH (Sokurenko, 1994), pACYC177, pACYC184, и монокопийная плазмида pBeloBAC## (1 копия на клетку) (коллекция Е Сокуренко, Seattle, WA, USA)
Исследование адгезивной активности бактерий осуществляли с помощью методов агрегации дрожжей, агглютинации эритроцитов морской свинки в статических и динамических условиях, радионуклеотидного метода оценки адгезии в статических условиях, исследования адгезии к уроэпителиальным клеткам (Sokurenko, 1992,1994, 1995), метода исследования адгезии в камере непрерывного потока (Finger , 1996, Marchese , 1999), модели инфекции мочевого тракта in vivo (на мышах) (Mobley , 1993)
Филогенетический анализ штаммов и генотипирование осуществлялись с помощью МЛСТ (Multi Locus Sequence Typing) и ПФГЭ (Pulsed Field Gel Electrophoresis)
Выделение плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора mini-QlA-GENE (Германия-США), рестрикцию, лигирование, трансформацию ДНК проводили по стандартным методикам (Sambrook J, Е F Fritsch and Т Maniatis, 1989), очистку плазмидной ДНК осуществляли с помощью набора GENECLEAN Kit II (США) Электропорацию ДНК производили с использованием прибора Gene Pulser (BioRAD, США)
