Введение к работе
Актуальность проблемы
Туляремия – зоонозная инфекция, имеющая природную очаговость. На территории Российской Федерации природные очаги туляремии распространенны повсеместно, поэтому наблюдаемый в настоящее время уровень заболеваемости (по данным ФГУЗ ФЦГиЭ Роспотребнадзора, в 2010 г. зарегистрировано 115 случаев туляремии, по сравнению с 2009 г. – 57 случаев) представляет несомненную проблему для Российского здравоохранения.
Возбудителем туляремии является микроорганизм Francisella tularensis. В современной классификации выделяют четыре подвида F. tularensis: subsp. tularensis, subsp. holarctica, subsp. mediaasiatica и subsp. novicida. Наиболее тяжелую форму заболевания вызывает F. tularensis subsp. tularensis, циркулирующий на территории Северной Америки (Ellis et al., 2002).
Для профилактики туляремии в РФ используется живая вакцина, которая формирует длительный напряженный иммунитет. Основным недостатком данной вакцины является ее некоторая реактогенность и нестабильность (Олсуфьев с соавт., 1960). Поэтому в настоящее время актуальной проблемой является создание нового поколения стабильных и менее реактогенных вакцинных туляремийных штаммов. Одним из способов стабилизации генома вакцинного туляремийного штамма представляется инактивирование элементов системы гомологичной рекомбинации.
Известно, что инактивирование гена recA у вакцинного штамма Mycobacterium bovis BCG приводило к стабилизации генома данного микроорганизма и не влияло на его протективные свойства (Keller et al., 2008). Инактивация генов recA и recBC в клетках Salmonella приводила к снижению вирулентности для мышей и замедленному росту в макрофагах (менее выраженному в случае recA мутантов) (Buchmeier et al., 1993). Наличие дефекта в гене recD у Salmonella, продуктом которого является белок RecD, обладающий АТФ-азной (Chen et al., 1997) и хеликазной (Taylor et al., 2003) активностями, также приводило к аттенуации бактерий Salmonella для мышей и снижению их пролиферации в макрофагах (Cano et al., 2002).
Ранее было показано наличие функционально-активного recA-подобного гена в геноме вакцинного штамма F. tularensis (Павлов с соавт., 1991) и в геноме F. tularensis subsp. novicida (Berg et al., 1992). При сравнительном анализе нуклеотидной последовательности геномов видов Francisella были обнаружены также recD-подобные гены (Larsson et al., 2005).
Учитывая вышеизложенные факты, изучение влияния recA- и recD-подобных генов F. tularensis на генетические и биологические свойства вакцинного штамма туляремийного микроба является на настоящий момент актуальной задачей, решение которой необходимо для создания нового поколения вакцинного штамма, а также для изучения эволюции туляремийного микроба.
Цель исследования: изучение влияния генов системы гомологичной рекомбинации recA и recD на биологические и иммунологические свойства вакцинного штамма F. tularensis.
Задачи исследования
-
Биоинформационный анализ генов системы гомологичной рекомбинации recA и recD у F. tularensis.
-
Получение вакцинного варианта штамма F. tularensis 15/10 с делетированным геном recA.
-
Получение продуцента E. coli Bl21(DE3), экспрессирующего рекомбинантный белок RecA F. tularensis, выделение и очистка белка RecA.
-
Получение антител к рекомбинантному белку RecA F. tularensis и анализ экспрессии белка RecA в клетках туляремийного микроба.
-
Получение вакцинного варианта штамма F. tularensis 15/10 с делетированным геном recD.
-
Изучение влияния генов recA и recD на свойства вакцинного штамма F. tularensis 15/10.
-
Выбор последовательностей нуклеотидов в гене recD для ПЦР-диагностики с гибридизационно-флуоресцентной детекцией подвидов F. tularensis; конструирование праймера, содержащего Chi-сайт E. coli, для дифференциации подвидов туляремийного микроба.
Научная новизна
Впервые получены варианты вакцинного штамма F. tularensis 15/10 с инактивированными генами системы гомологичной рекомбинации recA и recD. Показано, что при инактивации гена recA в геноме штамма F. tularensis 15/10 снижается вирулентность данного штамма, сохраняется его способность к персистенции в макрофагах и не ухудшаются вакцинные свойства. Установлено, что инактивация гена recD в геноме штамма F. tularensis 15/10 приводит к аттенуированию штамма, при сохранении его протективных свойств и значительном снижении способности к гомологичной рекомбинации. Впервые показано отсутствие индукции белка RecA в клетках штамма F. tularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты.
Практическая ценность работы
Созданы плазмиды pPVrecA, pPVrecD для аллельного обмена. Разработан алгоритм, позволяющий стабилизировать и аттенуировать вакцинный туляремийный штамм путем инактивации генов системы рекомбинации recA и recD. В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ (ГКПМКК-Оболенск) депонированы авторские штаммы F. tularensis subsp. holarctica 15/10recA (рег. номер 6622.) с делецией гена recA, и F. tularensis subsp. holarctica 15/10 recD (рег. номер В-6823) с делецией гена recD (Федеральный уровень внедрения). Результаты исследований послужили основой для составления двух патентов на изобретение: «Способ стабилизации вакцинного туляремийного штамма» № 2010141704 от 11.10.2010 (Оболенск, 2010, Федеральный уровень внедрения) и «Способ аттеннуации вакцинного туляремийного штамма» №2011131560 от 28.07.2011 (Оболенск, 2011, Федеральный уровень внедрения). Материалы диссертации используются в программе подготовки аспирантов ФБУН ГНЦ ПМБ (учрежденческий уровень внедрения).
Положения, выносимые на защиту
1. Делеция гена recA в геноме вакцинного штамма F. tularensis 15/10 приводит к снижению способности данного штамма к гомологичной рекомбинации. Инактивация гена recA сопровождается повышением чувствительности к ультрафиолетовому излучению. Полученный штамм F. tularensis 15/10recA сохраняет свои ростовые свойства и способность к размножению в макрофагах и не меняет свою устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки. Жизнеспособность лиофильно высушенной культуры F. tularensis 15/10recA не меняется в процессе ее хранения.
2. Антитела к рекомбинантному белку RecA распознают нативный белок RecA штамма F. tularensis 15/10. Количество белка RecA в клетках штамма F. tularensis 15/10 после воздействия УФ-облучения и налидиксовой кислоты не меняется.
3. Делеция гена recD в геноме штамма F. tularensis 15/10 приводит к подавлению гомологичной рекомбинации. Штамм F. tularensis 15/10recD не меняет свою устойчивость к бактерицидному действию нормальной кроличьей сыворотки, обладает пониженными ростовыми свойствами и замедленной способностью к размножению в макрофагах, по сравнению с исходным вакцинным туляремийным штаммом.
4. У штамма F. tularensis 15/10 с инактивированным геном recA на порядок снижена вирулентность для мышей, при сохранении его протективных свойств. Делеция гена recD у вакцинного туляремийного штамма приводит к его аттенуированию и сохранению протективных свойств.
5. Созданная система праймеров и зондов на основе вариабельной последовательности гена recD позволяет проводить дифференциацию подвидов туляремийного микроба методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Сконструированный праймер, содержащий Chi-последовательность E.coli, позволяет различать подвиды туляремийного микроба методом ПЦР.
Работа выполнена в лаборатории микробиологии туляремии (ЛМТ) ФБУН ГНЦ ПМБ по Государственным контрактам № 118-Д от 11.06.2009 г. и № 124-Д от 11.06.2009 г. в рамках Федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009–2013 гг.)».
Апробация работы
Материалы диссертации доложены и представлены на: научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г., 31 мая- 2 июня 2011 г.), III научно-практической школе-конференции «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 31 мая- 2 июня 2011 г.) и на третьем съезде военных врачей медико-профилактического профиля вооруженных сил Российской Федерации (Санкт-Петербург, 8-10 декабря 2010 г.) «Достижения науки и практики в обеспечении санитарно-эпидемиологического благополучия вооруженных сил Российской Федерации». Апробация диссертации состоялась на заседании межлабораторного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ 21 июня 2011 г.
Публикации
Основное содержание работы отражено в 9 научных публикациях, в том числе в 4 статьях журнала из списка изданий, рекомендованного ВАК, а также в двух принятых к рассмотрению заявках на патент Российской Федерации.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 20 работ отечественных и 151 работы зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 31 рисунками и 14 таблицами.
Похожие диссертации на Изучение молекулярно-биологических свойств вариантов вакцинного штамма Francisella tularensis с делетированными генами системы рекомбинации recA и recD
![Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс]](/i/i/4503/199818.png "Изучение биологических свойств рекомбинантных штаммов Salmonella Enteritidis, экспрессирующих НВс-антиген вируса В с эукариотического и прокариотического промоторов [Электронный ресурс] Донин Михаил Васильевич")
