Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Цитология метанотрофных бактерий 7
1. Некоторые особенности биологии метанотрофных бактерий 7
а) Распространение: метанотрофов в природе . 7
б) Современная классификация метанотрофных бактерий II
в) Морфологические, физиологические и биохимические особенности метанотрофных бактерий 17
2. Ультраструктурная организация метанотрофов 29
а) Поверхностные структуры 29
б) Внутрицитоплазматические мембраны 36
ГЛАВА II. Объекты и методы исследования 56
1. Культивирование метанотрофных бактерий 56
2. Электронномикроскопические методы исследования 57
а) Метод ультратонких срезов 57
б) Негативное контрастирование 59
в) Электронномикроскопическая криофрактография . 60
г) Методика и техника оптической дифракции и реконструкции электронномикроскопических изображений 61
3. Методы дезинтеграции 63
4. Определение активностей ферментов и дыхательной активности клеток 64
ГЛАВА III . Ультраструктурная организация енутрицитошазматических мембран i типа 65
1. Методика заключения материала в агар 66
2. Морфометрический анализ внутрицитоплазматических мембран I типа 69
3. Особенности организации внутрицитоплазматических мембран метанотрофных бактерий, относящихся к I типу 73
4. Влияние условий культивирования на организацию мембранного аппарата I типа , 79
а) Периодическое культивирование 80
б) Непрерывное культивирование 92
5. Закономерности формирования внутрицитоплазматических мембран I типа 97
ГЛАВА ІV. Ультраструктушая организация внутрщйтоішазматических мембран п типа 104
1. Морфометрический анализ внутрицитоплазматических мембран П типа Ю4
2. Сравнительный анализ структуры и организации внутрицитоплазматических мембран П типа 106
3. Влияние условий культивирования на особенности организации внутрицитоплазматических мембран .Methylocystia echinoides Ill
4. Закономерности формирования внутрицитоплазмати ческих мембран П типа 121
ГЛАВА V. Поверхностные структуры метанотрофов и их организация 128
1. Общая ультраструктурная характеристика поверхностных образований метанотрофов 128
2. Структура капсул метанотрофов 136
3. Трубчатые ПОВерхНОСТНЫе Структуры Methylocystia echinoides 145
а) Тонкое строение и морфометрический анализ трубчатых ПОВерхнОСТНЫХ структур Methylocystiaechinoides 146
б) Получение фракций трубочек 154
в) Оптический анализ надмолекулярной организации трубчатых структур 155
ГЛАВА VІ. Цитохимические особенности метанотрофшх бактерий
1. Локализация полисахаридов в клетках метанотрофных бактерий 160
2. Локализация перекисьразлагащей активности в клетках метанотрофных бактерий 162
3. Выявление окислительных ферментов в клетках метанотрофных бактерий M.echinoides 168
ГЛАВА VII. Элекгронномикроскопический контроль чистоты популяций метанотрофов 172
Заключение 178
Выводы 184
Литература 187
- Распространение: метанотрофов в природе
- Ультраструктурная организация метанотрофов
- Электронномикроскопическая криофрактография
- Влияние условий культивирования на организацию мембранного аппарата I типа
Распространение: метанотрофов в природе
Микроорганизмы, утилизирующие метан были выделены из самых разнообразных природных субстратов (Hutton a. Zobeli, 1949; Dwor-kin a Poster, 1956; Leadbetter a. Poster, 1958; Whittenbury et al., 1970; Quayle, 1972; Whittenbury et al., 1976; Heyer, 1977; Colby et al., 1979; Hanson, 1980; Higgins et al., 1981).
Местообитание метанотрофов в естественных субстратах тесно связано с наличием в них метана. Прежде всего это газовые и нефтяные месторождения, а также зоны, где происходит анаэробное разложение органических веществ и образование метана (Wolfe, 1971). Такие процессы весьма распространены в природе. Некоторые представления о масштабах метанообразования дают данные ( Koyama , 1963), представленные в таблице I. Было подсчитано, что ежегодно в атмосферу поступает от I до 4x10 u г метана биологического ге-неза (Ehait, 1976). Количество метана небиологического генеза составляет 20 по отношению к метану, имеющему биологическое происхождение (Hanson, 1980). Метанотрофы играют важную роль в круговороте углерода (Cappenberg, 1972; Малашенко с соавт., 19756; Rudd and Hamilton, 1978; Hanson, 1980).
По данным ряда авторов (Могилевский, 1961; Керстен, 1964; Телегина, 1968), полученным на основе отбора образцов, микроорганизмы, утилизирующие газообразные углеводороды, встречаются, главным образом, в нефтегазоносных почвах и отсутствуют за их пределами. Однако метан- и пропан-окисляющие бактерии обнаруживаются как в почвах нефтяных месторождений, так и за их пределами (Dostalek, 1953). При этом метанотрофы преобладают, главным образом, в почвах газо Таблица I Масштабы метанообразования на земном шаре (Коуата, 1963)
Затопляемые почвы Пищеварение животных Каменный уголь Луга Лесаносных районов. По данным Малашенко Ю.Р. с соавт. (1971) метано-трофы наиболее часто встречаются в местах с повышенным содержанием метана (заболоченные почвы, лечебные грязи, почвы газоносных районов, воды угольных шахт), тогда как в почвах нефтяных месторождений преобладают микроорганизмы, утилизирующие газообразные гомологи метана С2-С4 углеводороды. В таблице 2 приведены некоторые данные о распространении метанотрофов в природе. Особенно широко распространены бактерии, окисляющие метан в почвах и морских осадках, где есть метан и кислород (Hutton a. zobeli , 1949).
Однако, несмотря на широкое распространение метанотрофов их .распределение, в природных субстратах весьма неравномерно. Так, например, количество метанотрофов в толще воды большинства водоемов невелико (100-2000 клеток/мл), в слоях же ила, непосред о ственно граничащих с водой, их число существенно возрастает (10 клеток/мл) (Whittenbury et ai., 1975). Показано также, что в исследованных образцах метанокисляющие бактерии составляли 1-8$ от общего числа бактерий, причем наибольшее их количество приходилось на конец лета и осень, наименьшее - на зимние месяцы. При этом покоящиеся формы (цисты и споры) составляли от 10 до 9С$ Таблица 2 Распространение микроорганизмов, окисляющих газообразные углеводороды, в различных естественных субстратах (Малашенко с соавт.,1971) всех клеток метанотрофов. Отмечено также доминирование метано-трофных микроорганизмов с сериновым циклом ассимиляции углерода метана (Whittenbury et ai., 1975). В образцах, взятых из различных природных источников, примерно 9С$ полученных обогатительных культур составляли уже известные виды метанокисляющих бактерий (Неуег, 1977).
Помимо специализированных на утилизации углерода метана ме-танотрофных бактерий в природе обнаруживаются окисляющие метан анаэробные бактерии, для которых он не является утилизируемым субстратом. Причем анаэробное окисление метана требует уникальной и невыявленной пока трансформации этого соединения (Quayle, 1972). Показано, что метан не сохраняется в отсутствии кислорода в морских осадках (Reeburgh a. Heggie, 1977). Метан также практически отсутствует в зонах с высоким содержанием сульфата. Его содержание увеличивается в более глубинных осадках, которые поч 10
ТИ лишены сульфата (Claypool a. Kaplan, 1974; Martens a. Berner, 1977; Reeburgh, 1976). На основании данных по распределению метана и сульфата в различных бескислородных морских осадках была выдвинута гипотеза, согласно которой такое распределение обусловлено анаэробным окислением метана (Reeburgh a, Heggie, 1977 ). В дальнейшем эта гипотеза была подтверждена экспериментами с радиоактивной меткой (Kosiur a, Warford, 1979; Reeburgh, 1979)» Было, в частности, показано, что большая часть метана, продуцируемого в осадках, потребляется при анаэробном окислении и небольшая часть (1-10$) выделяется в колонну воды (Reeburgh a, Heggie, 1977). Этот факт, кроме того, указывает на то, что количество метана, продуцируемого биологическими процессами практически намного выше, чем было подсчитано ранее, поскольку эти подсчеты были основаны на количестве метана, которое попадает в атмосферу. Однако исследования по окислению метана в морской и пресноводной среде показали, что лишь небольшая часть метана, продуцируемая в водных глубинах достигает столба воды или ее поверхности.
Примером анаэробных бактерий, осуществляющих окисление метана, могут быть Desulfovibrio desulfuricans, которые окисляют С-меченный метан до С -двуокиси углерода в присутствии лакта-та, как основного источника углерода (Davies a. Yarborough,1966) Однако ряду авторов не удалось выявить окисление метана сульфат-редуцирующими бактериями (Сорокин, 1957; Postgate, 1969). В пресноводных системах, по-видимому, преобладает аэробное окисление метана.
Ультраструктурная организация метанотрофов
К поверхностным структурам метанотрофных бактерий следует отнести: различным образом организованные капсулы, поверхностные субъединичные слои, сложноорганизованные поверхностные структуры, связанные с наружной мембраной клеточной стенки и, наконец, саму клеточную стенку.
Капсулы. Светооптическими методами исследования окрашенных тушью или нигрозином препаратов клеток было выявлено наличие у метанотрофов как микро-, так И макрокапсул (Whittenbury et al., 1970). Электронно-микроскопический анализ структуры капсул показал, что капсулярное вещество метанотрофов в большинстве случаев имело фибриллярное строение. У различных видов метанотрофных бактерий оно представлено фибриллами различной длины и плотности упаковки. Фибриллы капсул на ультратонких срезах клеток Methylo-sinus trichosporium (Whittenbury et al., 1970) значительно короче фибрилл капсул Methylococcus thermophilus, выявленных на не-гативноокрашенных препаратах клеток (Малашенко с соавт., 1978). У метанотрофных бактерий широко распространена способность к образованию внеклеточной слизи. Слизистый материал в виде плотного аморфного вещества тесно примыкающего к клеткам был выявлен на НегатИБНООКрашеННЫХ препаратах КЛетОК Methylomonas gracilis (Малашенко с соавт., 19786).На ультратонких срезах Methylosinus trichosporium было показано наличие на полюсах клеток тонких ос-миофильных фибрилл, иногда распространяющихся на значительные расстояния (Гальченко с соавт., 1975). В цитоплазме клеток вблизи от места прикрепления пучка фибрилл всегда находится вакуоль с непостоянной электронной плотностью (Малашенко с соавт., 1978). В препаратах замороженных и сколотых клеток м.trichosporium были выявлены структуры связывающие друг с другом от двух до четырех клеток (Weaver, Dugan, 1975). По мнению этих авторов выявленные ими межклеточные мостики могут быть аналогами структур, ответственных за образование розеток, описанных ранее (WMttenbury et al., 1970).
На ультратонких срезах клеток Methylomonas methanica не было обнаружено капсулярного материала (Гальченко с соавт., 1975),хотя светооптическими методами было показано наличие у организма этого вида макрокапсулы (WMttenbury et al., 1970). Наличие тонких фибриллярных поверхностных образований было показано на ультратонких срезах клеток Methylococcus capsulatus (Ribbons et al., 1970).
Существенными ультраструктурными различиями характеризуется организация поверхностных компонентов вегетативных и покоящихся форм клеток метанотрофных бактерий. Экзоспоры Methylosinus spo-rium и Methylosinus trichosporium отличаются более толстой капсулой по сравнению с вегетативными клетками (Whittenbury et al., 1970; Reed et al., 1980; Titus et al., 1982). Методами негативного контрастирования иплатино-углеродного напыления была выявлена фибриллярная организация капсул клеток м.trichosporium. Тонкие фибриллы радиально располагались вокруг экзоспоры. Экзоспоры Methylosinus sporium имели СХОДНЫЙ С М.trichosporium внешний вид, однако на негативноокрашенных препаратах отпочковавшихся экзоспор радиально расположенные фибриллы не были выявлены (Whittenbury et al., 1970). Значительные структурные перестройки претерпевают клетки метанотрофов при переходе в покоящуюся форму -цисту типа Azotobacter и "липидную" цисту. Эти изменения помимо внутриклеточной организации в значительной степени затрагивают оболочку клеток. Зрелые цисты характеризуются слоистой структурой оболочки, имеющей структурное сходство с оболочкой идет, образуемых клетками Azotobacter (Whittenbury et al., 1970). Стенка цисты у Azotobacter состоит из двух отчетливо выраженных слоев: внешний слой (экзина) представляет собой очень плотную и регидную структуру и внутренний более обширный слой (интина) с менее плотной и более гомогенной структурой (Socolofsky a. Wyas, 1961). Близкие по строению оболочки имеют цисты, образуемые всеми представителями рода Methylobacter (Whittenbury et al,, 1970). "Липидные" ЦИСТЫ, которые формируют бактерии рода Methylocystis и "незрелые" цисты типа Azotobacter, характерные для представителей родов Methyiomonas и Methylococcus также характеризуются более сложной организацией оболочки по сравнению с вегетативными формами клеток (Whittenbury et al., 1970). Поверхностные упорядоченные слои и другие поверхностные образования. Помимо широко распространенных среди метанотрофных бактерий фибриллярных капсул на поверхности клеток были описаны ряд уникальных структурных образований, связанных с наружной мембраной клеточной стенки. Так, на наружной поверхности клеток Methyiomonas albus были выявлены характерные чашевидные или бокаловидные образования диаметром 55 нм, расположенные с гексагональной симметрией (Wilkinson, 1971; Haubold, 1978; Jeffries a. Wilkinson, 1978). Бокаловидные структуры наблюдали также на поверхности фотосинтезирующих бактерий Chromatium buderi (Remsen et al., 1970); Chromatium okenii, Chromatium weissei (Hageage a. Gherna, 1971)» а также у Amoebobacter boeillosus (Cohen-Bazire et al., 1969). Чашевидные элементы на поверхности наружной мембраны Flexibacter polymorphus возможно пронизывают ее и проникают либо до промежуточного дополнительного слоя, локализованного между внешней и цитоплазматической мембранами, либо до цитоплазматичес-кой мембраны (Ridgway et al., 1975). Авторы предполагают, что "бокалы" F.polymorphus могут функционировать как макромолекуляр-ные поры для внеклеточного полимерного материала (аксиальных нитей "бокалов"), который способствует прикреплению клеток к субстрату, тем самым играя непрямую роль в скользящем движении бактерий.
На поверхности клеток метанотрофной бактерии, принадлежащей к роду Methylocystis (штамм 1С 493 s/5) обнаружены нерегулярно расположенные выросты в виде трубочек диаметром 70 нм и длиной 250 нм (Haubold, 1978). Стенки трубочек состоят из спирально закрученных фибрилл, диаметром 12 нм, имеющих глобулярное строение. Трубчатые поверхностные структуры были обнаружены также у целого ряда микроорганизмов и имели сходное строение. Так близкие по организации, но отличающиеся наличием конических расширений у основания и небольшим числом структуры (колючки ИЛИ "spine") были описаны для некоторых представителей Agrobacterium (Mool and Achrens, 1970), а также у морской псевдомонады Д7І (Мс Gregor-Shaw et al., 1973; Easterbrook et al., 1973). Ультраструктурная и надмолекулярная организация, а также свойства "колючек" ("spine") морской псевдомонады Д7І наиболее изучены. Стенка этих структур образована спирально уложенным тяжем, который, в свою очередь, образован последовательно связанными спаренными олигомерами (Easterbrook et al., 1976). Физиологическими условиями, контролирующими продуцирование этих структур являются температура роста или рН среды культивирования. Возрастание числа "колючек" (spine) наблюдали при увеличении температуры роста или рН среды, а также при снижении концентрации ионов Na+, Mg2+ и Са2+ в оптимальной ДЛЯ роста бактерий среде (Easterbrook a. Sperker, 1982). Наиболее близкие по структуре к трубочкам Methylocystis 1С 493 s/5 образования были описаны у двух штаммов одноклеточных циано-бактерий, принадлежащих К роду Synechococcus (Perkins et al., 1981). Они имели правильную цилиндрическую форму с диаметром пи 33 линдра 44,0-65,0 нм и протяженностью до 2,7 мкм. Все описанные трубчатые структуры были связаны лишь с наружной мембраной клеточной стенки бактерий, которая в случае псевдомонады Д7І не модифицирована в местах прикрепления "колючек" (spine) (Willison et al., 1977). Уникальной . разновидностью такого типа структур являются "спирали", обнаруженные в среде культивирования в свободном состоянии или в тесной связи с флагеллами ("спирали" по несколько единиц нанизаны на единственную флагеллу) азотфиксирую-ЩЄГО щтамма Azospirillum lipoferum (Nurmiaho-Lassila et al., 1981). "Спирали" образуются на расстоянии 80 нм от места прикрепления флагеллы, имеют диаметр от 40 до 55 нм и образованы спиральнозакрученной нитью диаметром 5 нм. Авторы предполагают, что "спирали" могут нести ответственность за структуру оболочки некоторых сложных флагелл.
Электронномикроскопическая криофрактография
Для осуществления безантифризной криофиксации с последующим препарированием материала в вакууме использовали ряд приспособлений, выполненных в виде приставки к лабораторной вакуумной установке JEE-4C (Фихте с соавт., 1973). Криофиксацию осуществляли в жидком фреоне-22, охлажденном жидким азотом до температуры —150С или в жидком пропане, охлажденном жидким азотом до температуры --160С. Последний обеспечивает более высокую скорость охлаждения препарата. Скол производили при достижении вакуума З ІСГ6 торр и температуры образца -Ю0С. Поверхности скола подвергали вакуумному травлению в течение 1-3 мин. Напыление производили платино-утлеродной смесью под углом 30 в течение 2-3 сек и чистым углеродом под утлом 90 в течение 5-6 сек. Реплики снимали на водопроводную воду и затем переносили на поверхность 4С$-ной хромовой кислоты для очистки от микробного материала. Затем, после предварительной промывки в дистиллированной воде, реплики монтировали на опорные сетки, покрытые формваровой подложкой.
Полученные ультратонкие срезы, негативно окрашенные препараты и реплики просматривали в электронном микроскопе JEM-ЮОВ при ускоряющем напряжении 80 кв в случае реплик и ультратонких срезов и 60 кв при цитохимических исследованиях неокрашенных срезов и негативно окрашенных препаратов. У вто шша отич с рй дифракции и єконстр2кцюі ект онно оскопических изображений
Оптическая дифракция с последующей реконструкцией фильтрованного исходного изображения является одним из методов оптического анализа электронно-микроскопических изображений объектов с выраженной периодичностью организации (Klug a. Berger, 1964; Klug a. De Rosier, 1966). В основе метода лежит получение дифракционной картины с зафиксированного на пленке изображения. Оптический дифрактометр состоит из источника излучения (обычно лазер или ртутная лампа), объекта и системы линз для получения дифракционной картины, которую наблюдают на матовом стекле (рис. ЗА). Формирование оптической дифракционной картины обусловлено структурными деталями участков микрографии. Кристаллическая организация образца выражается помимо шумового спектра в периодической ориентации дифракционных пятен или линий. Анализ взаимного расположения позволяет получить информацию о периодической структуре соответствующих участков образца (Вайнштейн, 1963).
Следующим этапом является оптическая фильтрация и реконструкция изображения, которая состоит в выделении информативного Схема оптического дифрактометра (А) и оптическая схема для получения реконструированного изображения (Б). А - лазер; В - заслонка; С - линза, сужающая пучок (обычно 8-миллиметровая объективная линза); Д - отверстие малого диаметра (500 мкм;; Д - регулируемая диафрагма; Р-] и Р9 -конденсорные линзы; Рз-основная дифракционная линза; G -электронная микрография;н-матовое стекло (экран}; I и «г- система реконструирующих линз; к - фильтрующая маска; L - увеличительная линза; м - держатель фильтрующей маски; Ж - плоскость конечного реконструированного изображения (место расположения экрана или фотоаппарата); о - телескоп для наблюдения; Р - увеличительная линза для дифракционной картины. сигнала из шумового фона оптической дифракционной картины.Метод состоит в наложении маски с пробитыми в соответствующих нужным рефлексам местах отверстиями, лежащими в плоскости дифракционной картины. Маска отфильтровывает шумовой спектр дифракционной картины и пропускает только периодические рефлексы. Пропуская эти пучки через реконструирующую линзу формируют фильтрованное изображение исходной микрофотографии. Оптическая схема для получения реконструированного изображения приведена на рис.ЗБ.
Таким образом, метод оптической дифракции и реконструкции электронно-микроскопических изображений дает возможность получить периодическое изображение, очищенное от случайного шума и проанализировать это изображение. Для спиральных структур, где имеется наложение передней и тыльной сторон спирали этот метод позволяет разделить изображения этих сторон.
Механическая дезинтеграция. Клетки отбирали в экспоненциальной фазе роста, центрифугировали при 10 OOOg 15 мин и отмывали 0,05 М Трис-HCl буфером (рН 7,4) с 5 мМ MgCl2. Клетки ре-суспендировали в том же буфере, добавляли 10 мкг/мл ДНКазы и 10 мкг/мл ГНКазы. Разрушение клеток проводили в дезинтеграторе ДКМ-3 при 0С и рабочем давлении 2500-3200 кг/см . После отделения неразрушенных клеток (10 000g, 15 мин) надосадочную жидкость центрифугировали (150 000g, 60 мин). Полученный осадок суммарных мембран суспендировали в дистиллированной воде. Полученную суспензию использовали в электронно-микроскопических исследованиях.
Для отделения поверхностных трубчатых образований у Methyio-cystis echinoides суспензию клеток обрабатывали ультразвуком с помощью ультразвукового генератора УЗДН-І. Обработку суспензии клеток осуществляли в протоке через мембранный фильтр, вмонтиро 64 ванный в ячейку. Режим обработки подбирали таким образом, чтобы обеспечить наибольший выход оторванных трубочек при наименьшем проценте разрушения клеток (см.главу У).
Энзиматичеокая дезинтеграция. Разрушение клеток осуществляли путем лизиса клеточной стенки в присутствии лизоцима и ЭДТА (Misushima a. Yamada, 1975; Sekizawa a. Pukui, 1973) с последующим воздействием осмотического шока. Клетки отмывали и разводили в дистиллированной воде. К 88 мл суспензии клеток, имеющих оптическую плотность 0,12 (кювета 0,5 см), добавляли последовательно 5 мл 0,1 М Трис-HCl буфера рН 8,0; 5,5 мл 2 М сахарозы; 0,83 мл 1% раствора ЭДТА и 0,83 мл раствора лизоцима (0,5 мг/мл). Приготовление смеси и последующую инкубацию проводили при 00 в течение 20-25 мин. Лизис осуществляли осмотическим шоком путем 20-кратного разведения 0,01 М Трис-нсі буфером рН 7,4 на холоду. Затем добавляли MgCl2 в конечной концентрации 0,01 М, ДНКазу (10 мкг/мл) и РНКазу (10 мкг/мл). Лизат центрифугировали (12 000g, 20 мин) для удаления нелизировавших сферопластов. Затем вновь центрифугировали (150 000g, 60 мин) и получали осадок мембран,который разводили в дистиллированной воде. Полученную суспензию использовали в электронно-микроскопических исследованиях.
Влияние условий культивирования на организацию мембранного аппарата I типа
Исследование влияния условий культивирования на организацию мембранного аппарата I типа проводили с целью выяснения закономерностей его субстратзависимых и возрастных изменений. Мы полагали, что динамика субстратзависимых перестроек мембран отражает специфическую роль ВЩ в метаболизме метанотрофных бактерий, а также их возможное участие в окисление метана. Представлялось также, что выявление причин редукции ВЩ и условий, индуцирующих формирование обширных, сильно развитых систем ВЦМ будет способствовать расшифровке основных закономерностей формирования этих субклеточных структур.
Динамику возрастных и субстратзависимых изменений внутрици-топлазматических мембран I типа изучали на метанотрофнои бактерии Methylomonas methanica 12. Расчет относительной площади ВЦМ показал, что возрастные изменения ВЩ I типа в оптимальных условиях роста при соотношении метан:воздух=1:1 (СН = 22 ммоль/л; О2 = 6 ммоль/л) проявляются в постепенном возрастании числа и протяженности везикул ВЦМ в стопках.и упорядочивании их организации. На ранних стадиях роста клетки Methylomonas methanica неоднородны по степени развития ВЩ. Везикулы в стопках малочисленны и имеют небольшую протяженность. Наблюдается неупорядоченность в расположении стопок в цитоплазме клеток. Наиболее обширная система ВЩ наблюдалась в конце логарифмической и начале стационарной фазы роста, когда ВЩ занимали значительную часть объема клетки. В стационарной фазе роста относительная площадь ВЩ уменьшалась. При этом уменьшался главным образом диаметр везикул, число же везикул изменялось незначительно (рис.9). Кроме этого возрастало число электроннопрозрачных включений в клетках (рис.106). Морфо-метрический анализ клеток, выращенных в присутствии различных источников азота (аммония или нитратов) не выявил существенных различий в динамике возрастных и ультраструктурных изменений системы ВЩ М «methanica.
Электронноншпсроскопическое изучение организации ВЩ Methylomonas methanica при различных соотношениях метана и кислоро Рис.9. Динамика возрастных изменений основных параметров ВЦМ клеток Methylomonas methanica 12 (I - кривая роста; 2 - относительная площадь ВЦМ; 3 - среднее число везикул в клетках). рис.10. Ультратонкие срезы клеток Methylomonaa methanica 12 при выращивании с метано-воздушной смесью (1:1). а - экспоненциальная фаза роста (хЗОООО); б - стационарная фаза роста (х35000). да показало, что наибольшая степень развития ВЩ имеет место в экспоненциальной фазе в условиях роста с низким парциальным давлением кислорода или метана (рис.II). Было также установлено,что увеличение относительной площади ВЩ сопровождается практически полным исчезновением электроннопрозрачных включений в цитоплазме клеток, которая к концу экспоненциальной фазы роста обычно полностью заполняется стопками ВЩ. При высоких парциальных давлениях кислорода или метана наблюдалось значительное уменьшение площади ВЦМ, Наиболее существенные изменения в организации и степени развития ВЩ отмечались в клетках, выращенных при высоком парциальном давлении метана. Значительная часть клеток (до 8С$) в этих условиях утрачивала к стационару систему ВЩ практически полностью и сохраняла лишь отдельные везикулы не организованные в стопки и локализованные преимущественно в периферической части цитоплазмы клеток (рис.12). Визуально на ультратонких срезах процесс редукции ВЩ выражался в значительном уменьшении в этих условиях числа везикул и их диаметра уже в первые часы роста. В отдельных клетках нарушалась организация единичных везикул, которые вследствие неравномерного увеличения их толщины утрачивали характерную правильну!) дисковидную форму. Оставшиеся везикулы перемещались в периферическую часть цитоплазмы и ориентировались параллельно поверхности цитоплазматической мембраны. Одновременно в клетках появлялись многочисленные крупные электроннопрозрачные включения и миелиноподобные структуры. Наблюдаемая редукция ВЩ обратима. При повторном выращивании клеток Methylomonas methanica в условиях с высоким парциальным давлением метана в первые часы роста происходит полное исчезновение внутриклеточных включений и появляется слабо развитая система ВЩ, которая к концу логарифмической фазы роста достигает высокой степени развития и затем вновь почти полностью редуцируется в стационарной фазе роста (рис. 13а).
