Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное состояние лабораторной диагностики заболеваний бактериальной этиологии 18
1.1. Характеристика микрофлоры организма человека 18
1.2. Современное состояние проблемы индикации и идентификации микроорганизмов 23
1.3. Сравнительный анализ традиционных устройств и методов исследования динамики развития бактериальной популяции 28
1.4. Современные представления о биофизических свойствах бактерий 33
1.5. Исследование процессов взаимодействия светового потока с параметрами развивающейся бактериальной популяции 44
Резюме 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы проведения исследований 50
2.1. Экспериментальная установка для исследования динамики развития бактериальной популяции 50
2.2. Стандартные материалы и методы проведения экспериментального исследования 58
Резюме 64
ГЛАВА 3 . Разработка методик приготовления материалов и тест-культур для проведения прецизионных измерений 65
3.1. Требования к методам исследования бактерий в динамике их развития .65
3.2. Методика подготовки материалов к исследованию 67
3.3. Основные требования и критерии оценки результатов эксперимента...69
3.4. Исследование влияния продуктов жизнедеятельности материнской культуры на динамику развития бактериальной популяции 71
3.5. Исследование влияния возраста материнской культуры на динамику развития бактериальной популяции 77
3.6. Исследование влияния количества посевного материала на динамику развития бактериальной популяции 81
3.7. Исследование влияния температуры культивирования на динамику развития бактериальной популяции 85
3.8. Устройство внесения инокулята 89
3.9. Специальная методика подготовки тест-культур и проведения экспериментального исследования 92
Резюме 94
ГЛАВА 4 . Моделирование процессов взаимодействия световых потоков с бактериальной клеткой 95
4.1. Гипотетическая модель динамики формирования межклеточных связей в бактериальной популяции 95
4.2. Экспериментальные исследования динамики развития бактерий 106
4.3. Исследование особенностей динамики развития бактериальной популяции в условиях слабого стационарного магнитного поля 117
4.4. Исследование механизмов развития бактерий в лаг-фазе 124
4.5. Исследование механизмов развития бактерий на стадии логарифмического роста 134
4.6. Исследование механизмов развития бактерий на стадии максимально "стационарной" 143
4.7. Статистическая обработка результатов исследования динамических свойств бактерий фотометрическим методом 148
Резюме 156
ГЛАВА 5 . Разработка методов идентификации бактерий на основе параметров динамики развития бактерий в реальном режиме времени 157
5.1. Исследование возможностей использования параметров динамики развития микроорганизмов в лаг-фазе в качестве критериев их "идентификации 157
5.2. Исследование возможностей идентификации бактерий по параметрам фазы логарифмического роста 170
5.3. Исследование возможностей идентификации бактерий по параметрам максимально стационарной" фазы динамики развития популяции 175
5.4. Разработка энерго-эволюционной модели развития микроорганизмов с целью повышения разрешающей способности методов их идентификации 177
5.5. Экспериментальные исследования динамики развития бактерий на основе энерго-эволюционной модели 181
5.6. Статистическая обработка результатов исследования динамических свойств бактерий фотометрическим методом 188
Резюме 199
ГЛАВА 6 . Применение фотометрического метода для диагностики гнойно-воспалительных заболеваний в реальном режиме времени 200
6.1. Исследование степени различия механизмов развития между свежевыделенными и музейными штаммами 201
6.2. Исследование механизмов действия антибиотиков на динамику развития бактериальной популяции 211
6.3. Исследование возможности применения фотометрического метода для контроля эффективности антибактериальной терапии 216
6.4. Сравнительная оценка специфичности и чувствительности фотометрического метода для идентификации бактерий 221
6.5. Статистическая обработка результатов исследования динамических свойств бактерий фотометрическим методом 225
Резюме 231
Заключение 232
Выводы 243
Литература 245
- Характеристика микрофлоры организма человека
- Экспериментальная установка для исследования динамики развития бактериальной популяции
- Требования к методам исследования бактерий в динамике их развития
- Гипотетическая модель динамики формирования межклеточных связей в бактериальной популяции
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее столетие отмечается резкий рост загрязнения окружающей среды химическими веществами и различного рода электромагнитными излучениями (ЭМИ) искусственного происхождения (электрорадиоцепи, электростанции, рентгеновское, лазерное","ради6актйвное излучения и т.д.). Причем, скорость нарастания мощности их воздействия на микроорганизмы в последнюю четверть века настолько возросла, что достигла критического предела природных адаптационных возможностей микроорганизмов. В ответ на это бактерии формируют механизмы, которые способствуют появлению у них в кратчайшие сроки новых свойств, адаптированных к данным условиям.
Микроорганизмы обитают не только во внешней среде, они заселяют и организм человека с момента его рождения, являясь его нормальной микрофлорой, а патогенные варианты, проникая во внутренние среды макроорганизма способны вызвать заболевания. Находясь во внутренних средах макроорганизма, микроорганизмы также изменяются под воздействием факторов этой среды (социальных, химических, физических, биологических и т.д.), обусловленных условиями проживания человека.
Именно этим обусловлено, видимо, появление штаммов, устойчивых не только к современным лекарственным препаратам, но и с новыми механизмами воздействия на организм человека, а в связи с этим и разнообразных клинических проявлений инфекций (дремлющих и скрытых форм, носительства патогенных возбудителей), полиморфизма патологических изменений в организме.
Для направленного и научно обоснованного учета этих специфических свойств микроорганизмов в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний необходимо знание законов жизнедеятельности микроорганизмов на микроуровне, включающее не только биохимические процессы, но и закономерности динамики развития бактериальной
популяции в реальном режиме времени. Последнее направление особенно важно, т.к. клинические проявления свойств модифицированных микроорганизмов при взаимодействии их с макроорганизмом всегда осуществляются на уровне популяции. Благодаря мониторированию состояния микрофлоры человека, появляется возможность проводить реабилитацию микроэкологической системы макроорганизма.
На сегодняшний день в решении проблемы профилактики и лечения инфекционных заболеваний и гнойно-воспалительных осложнений в неинфекционной клинике главенствующая роль среди всех параклинических служб принадлежит микробиологическим лабораториям, основными задачами которых является: 1 - выделение возбудителя; 2 - его идентификация; 3 - определение чувствительности к антибиотикам.
Следует отметить, что бактериологическое исследование клинического материала от больного существенно зависит от качества работы на долабораторном и лабораторном этапах: квалифицированного взятия и транспортировки образцов патологического материала из клиники в лабораторию [131, 215]. При этом время от момента доставки патологического материала в микробиологическую лабораторию до получения полного ответа составляет 4-7 суток, что не удовлетворяет требованиям клиницистов. Наиболее остро эта проблема стоит в ургентной гнойной хирургии [21, 25, 101]. Результат из бактериологической лаборатории обычно приходит к моменту выписки больного или тюсле его выписки, а иногда после летального исхода, когда потребность в этом уже отпадает.
Кроме того, в течение этого времени выделенные из организма культуры поддерживаются на искусственных питательных средах, что вполне достаточно для появления индуцированных мутаций по таким признакам, как токсинообразование, устойчивость микроорганизмов к антибиотикам, возникающая в результате замедления процесса размножения,
изменения рибосом, возникновения новой энзимной цепи для определенного процесса, связанного с изменением условий существования и т.д.
В связи с вышеизложенным сроки выполнения бактериологического исследования должны быть минимальными, т.к. своевременно поставленный этиологический диагноз — это снижение стоимости лабораторного исследования, вовремя назначенная этиотропная и специфическая терапия, снижение процента внутрибольничных инфекций и сроков пребывания больных в стационаре.
В работах [130, 162] в области лабораторной диагностики инфекционных заболеваний предлагается использовать различные микротест-системы, позволяющие проводить диагностические исследования в более короткие сроки по сравнению с традиционными методами.
Достижения в области физико-химической биологии, биотехнологии, компьютерной технологии позволили создать лабораторно-диагностические приборы нового поколения, базирующиеся на методах хемоиндикации: газохроматографический анализ жирно-кислотного профиля бактерий, хромато-масс-спектрометрический анализ, высоковольтный электрофорез [77, 102, 105, 114, 113, 115] иммуноиндикации и генетической идентификации [162]. Стало возможным проводить диагностику инфекционных заболеваний с помощью автоматизированных и полуавтоматизированных систем. Появились лаборатории экспресс-диагностики бактериальных инфекций, использующие иммунологические (ИФА) и молекулярно-генетические методы (ПЦР), которые позволяют не только идентифицировать бактерии, но и определять их чувствительность к некоторым антибиотикам по наличию мутаций в ДНК практически в день поступления патологического материала [162]. Но ни один из указанных методов не позволяет проводить обследование и оценку состояния больного с заболеваниями микробной этиологии непосредственно в клинических условиях (у постели, во время операции, в перевязочной) с целью экспресс-
диагностики инфекционного заболевания, коррекции и мониторинга эффективности лечения и прогнозирования исхода заболевания. Кроме того, эти методы требуют хорошего технического оснащения и финансирования, позволяют проводить измерения лишь по конечной точке.
Наличие же в лабораториях клинической микробиологии приборов, позволяющих снимать динамику размножения микроорганизмов, позволит решить широкий круг задач. Это, прежде всего: 1 - идентификация выделенных возбудителей в кратчайшие сроки (2-3 часа); 2 - определение чувствительности выделенного возбудителя к антибиотикам в реальном режиме времени (1-2 часа); 3 - мониторинг состояния микрофлоры человека в реальном режиме времени; 4 - изучение механизма действия лекарственных препаратов на чистую и смешанную культуру микроорганизмов в реальном режиме времени; 5 - определение микробного антагонизма в реальном режиме времени; 6 — контроль эффективности антибактериальной терапии в реальном режиме времени и т.д.
Существующие же традиционные методы, используемые при изучении динамики развития бактерий, длительны, малоинформативны, обладают высокой инертностью процесса измерения [63, 98]. В связи с этим большинство кратковременных, но определяющих микропроцессов не фиксируются ими, т.е. для выявления кратковременных микропроцессов, необходимо уменьшать период наблюдений (шаг измерения) до минимально возможного. Поэтому для изучения динамики развития бактериальной популяции требуются прецизионные методы, позволяющие использовать приборы, скорость измерения которых была бы в несколько раз выше, чем скорость процессов в бактериальной популяции. Этим требованиям отвечает фотометрический метод, измерительным инструментом которого является световой поток, позволяющий вести наблюдения в реальном режиме времени с шагом в 5 с. Применение прецизионных методов в клинической
микробиологии требует особого подхода к подготовке материалов и исходных образцов (тест-культур) для экспериментального исследования.
Известно, что при экспериментальных исследованиях, как в микроэлектронике, так и в микробиологии существуют общие проблемы. Так, например, любые загрязнения исходных материалов и образцов в микроэлектронике приводят к тому, что при последующих технологических операциях негативные последствия этих загрязнений перемножаются и приводят в конечном итоге к необратимому искажению параметров изготовляемых изделий. Аналогичные ситуации существуют и в микробиологии. Малейшие загрязнения исходных материалов и тест-культур приводят не только к искажениям результатов исследований, но и к появлению индуцированных мутаций по многим свойствам. Использование результатов этих исследований в практической деятельности врача приводит к ошибочным выводам и заключениям.
Разработка прецизионных методик для технологических процессов в микроэлектронике в 70-х годах способствовала выявлению неизвестных ранее явлений и бурному развитию этой области науки. По аналогии следует ожидать, что и в микробиологии тщательный контроль параметров исходных материалов и тест-культур должен привести, как минимум, к значительному увеличению воспроизводимости результатов экспериментальных исследований. Основываясь на анализе достижений микроэлектроники, автором работы по аналогии с этой областью науки сформулированы следующие требования, необходимые для экспериментального изучения свойств бактериальных популяций, включая и их жизнедеятельность в динамике развития:
необходим измерительный инструмент, размеры которого в несколько раз меньше исследуемого объекта (клетки, совокупности клеток);
измерение параметров жизнедеятельности бактерий необходимо проводить в реальном режиме времени, то есть шаг измерения должен
быть меньше не менее, чем в 10 и более раз относительно длительности изменения параметров исследуемого объекта; 3. прецизионный контроль за воспроизводимостью свойств тест-культур: возрастом, посевной дозой, продуктами жизнедеятельности инокулята, температурой культивирования, способом внесения инокулята;
питательные среды должны быть стандартными с точно известным и воспроизводимым (прецизионным) составом;
прецизионный контроль за степенью чистоты материалов, содержащих лабораторную посуду и другое оснащение.
Однако в практической медицине отсутствуют описания методик и устройств, позволяющих изучать с необходимой степенью достоверности и воспроизводимости особенности динамики развития бактериальных популяций и, как следствие - методы, решающие эту задачу.
Цель и задачи исследования: На основании динамических свойств бактериальной популяции разработать экспериментальный метод, позволяющий идентифицировать бактерии в реальном режиме времени.
В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:
Выбор и обоснование измерительного инструмента для изучения динамики развития бактерий в реальном режиме времени;
Разработка прецизионных методик приготовления исходных материалов, позволяющих получать достоверные и воспроизводимые результаты и изучать динамику развития биосистем в реальном режиме времени при помощи световых потоков;
Исследование особенностей динамики развития бактериальных популяций и определение факторов, влияющих на поведение бактерий в популяции в реальном режиме времени;
4. Определить достоверность экспериментальных результатов,
полученных при изучении динамики развития бактериальных
популяций в реальном режиме времени;
5. Разработать методику применения результатов исследования для
лабораторной диагностики заболеваний бактериальной этиологии.
Научная новизна. Проведенные исследования являются
новым научным направлением в изучении динамики развития бактериальных популяций в реальном режиме времени, при выполнении которых впервые:
- применены принципы микроэлектроники при разработке методик
приготовления тест-культур, питательных сред, лабораторной посуды и
других технических средств;
- предложена гипотетическая модель жизнедеятельности микроорганизмов
в реальном режиме времени, на основе которой описаны механизмы развития
бактериальной популяции в лаг-фазе, на стадии логарифмического роста и
максимально "стационарной";
- определены параметры динамики развития бактериальных популяций,
позволяющие получить информацию о стадийных механизмах развития
бактерий в реальном режиме времени;
- обнаружены эффекты: диффузного распределения бактериальных клеток в
жидкой среде; флуктуации скорости развития бактерий в лаг-фазе и в конце
фазы логарифмического роста; эффект нестационарности максимально
"стационарной" стадии развития бактериальной популяции;
последовательного развития смешанных культур;
- определены критерии идентификации бактерий: тангенс угла наклона участка кривой логарифмической фазы, коэффициент диффузии клеток инокулята в жидких средах и длительность участка кривой в лаг-фазе.
Практическая значимость результатов работы определяется следующим:
в лабораторной практике клинической микробиологии предложены методики приготовления тест-культур, питательных сред, лабораторной посуды и других технических средств, используемые в технологических процессах микроэлектроники, что позволяет повысить воспроизводимость результатов исследований до 97%;
найденные режимы приготовления материалов могут быть использованы для разработки конкретных методик, пригодных для проведения микробиологических исследований в клинико-лабораторной практике;
воспроизводимость результатов исследований динамики развития бактериальной популяции повышается до|87-97%, если в качестве инокулята использовать отмытую от продуктов жизнедеятельности материнскую культуру в возрасте 24 ч с посевной дозой, соответствующей первоначальной оптической плотности рабочего раствора 0,025-0,050, культивирование осуществлять при 30-31 С, соблюдая условия внесения инокулята;
- повышение воспроизводимости позволяет осуществлять экспресс -
контроль параметров бактериальных популяций в реальном режиме времени
при конкретных условиях их жизнедеятельности;
разработан способ идентификации бактерий по тангенсу угла наклона кривой динамики их развития на стадии логарифмического роста на уровне родовой и штаммовой принадлежности для клинико-лабораторной диагностики заболеваний бактериальной этиологии в реальном режиме времени (патент № 2087537 от 20.08.97 г.);
разработан способ идентификации живых и убитых бактериальных клеток по коэффициенту их диффузии в жидких средах для клинико-лабораторной диагностики заболеваний бактериальной этиологии и индикации и идентификации вакцинных штаммов в реальном режиме времени (патент № 2113467 от 20.06.98 г.);
- разработан способ определения микробного антагонизма в реальном
режиме времени, позволяющий сократить сроки исследований до 3 ч.
разработан способ фотометрического контроля эффективности антибактериальной терапии и определения чувствительности бактерий к антибиотикам в реальном режиме времени (рац. предл. №315 от 03.04.03 г.);
- предлагаемые в настоящей работе способы идентификации
бактерий и определения их чувствительности к антибиотикам позволили
сократить длительность этих исследований с 72 ч до 2 ч, что способствовало
более раннему назначению и своевременной смене антибактериальной
терапии, сокращению сроков лечения и пребывания больных в связи с этим в
стационаре, снижению процента повторных хирургических вмешательств в
послеоперационном периоде; снизить в несколько раз экономические
затраты на собственно микробиологические исследования;
- разработан алгоритм исследования клинического материала для
лабораторной диагностики заболеваний бактериальной этиологии;
- проведенный сравнительный анализ характеристик, полученных при
изучении динамики развития бактерий традиционными и предлагаемыми в
настоящей работе методами, показывает значительные преимущества
последнего для использования в лабораторных исследованиях клинической
микробиологии.
Реализация результатов исследования: Методы идентификации бактерий, определения чувствительности их к антибиотикам, способ фотометрического контроля эффективности антибактериальной терапии используются в практике работы Клиник Самарского государственного медицинского университета, Самарской областной клинической больницы им. М.И.Калинина, фармацевтического завода ООО «Гиппократ», а также в учебном процессе кафедр общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии; общей хирургии с курсом оперативной хирургии Самарского государственного медицинского
университета, клинической лабораторной диагностики Пензенского института усовершенствования врачей.
На защиту выносятся следующие положения:
- гипотетическая модель жизнедеятельности микроорганизмов в реальном
режиме времени, на основе которой описаны механизмы развития
бактериальной популяции в лаг-фазе, на стадии логарифмического роста и
максимально "стационарной";
- фотометрический метод для клинико-лабораторных исследований в
микробиологической практике и методика приготовления образцов,
позволяющая получать результаты исследований с погрешностью до 3%;
- эффекты, обнаруженные при изучении динамики развития бактериальной
популяции в реальном режиме времени: диффузного распределения
бактериальных клеток в жидких средах; флуктуации скорости развития
бактерий в лаг-фазе и в конце фазы логарифмического роста;
нестационарности максимально "стационарной" стадии развития
бактериальной популяции; последовательного развития смешанных культур;
- способы идентификации бактерий по тангенсу угла наклона кривой
динамики их развития на стадии логарифмического роста; по коэффициенту
их диффузии в жидких средах (живых и убитых штаммов), индикации и
идентификации вакцинных штаммов; фотометрического контроля
эффективности антибактериальной терапии и определения чувствительности
бактерий к антибиотикам в реальном режиме времени.
Апробация работы. Основные разделы работы были доложены и обсуждены на заседании кафедры микробиологии Самарского государственного медицинского университета, кафедры оптики и спектроскопии Самарского государственного университета, кафедры микроэлектроники и технологии радиоэлектронной аппаратуры Самарского государственного аэрокосмического университета им. академ. С.П.Королева, на заседании кафедры микробиологии ММА им. И.М.Сеченова, на заседании
секции биофизики и мембранологии МОИП, Всероссийской научно-технической конференции профессорско-преподавательского состава, Самара, 1995; Всероссийской научно-технической конференции «Перспективные информационные технологии в научных исследованиях, проектировании и обучении», Самара 1995; Международного семинара "Дифференциальные уравнения и их приложения", Самара, 1996; Всероссийской научно-технической конференции "Диагностика, информатика, метрология, экология, безопасность-96", Санкт-Петербург, 1996; Первой Международной конференции. "Приборостроение в экологии и безопасности человека («ПЭБЧ»), Санкт-Петербург, 1996; научно-практической конференции «Факультету последипломной подготовки Сам.ГМУ 15 лет», Самара 1998; на заседании секции «Биотехнические проблемы» Первой международной школы-семинара «БИКАМП,98», Санкт-Петербург, 1998; XXXII Итоговой научной конференции профессорско-преподавательского состава Самарского военно-медицинского института, Самара, 1999; Всероссийской научно-технической конференции «Микроэлектроника и информатика 99», Зеленоград, 1999; Международной научной конференции «XXY Гагаринские чтения», Москва, 6-10 апреля 1999, на заседании секции «Биотехнические проблемы» Третьей международной школы-семинара <<БИКАМП,01», Санкт-Петербург, 2001; Четвертой международной школы-семинара «БИКАМП,03», Санкт-Петербург, 2003; на II и III съездах научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики, Москва, 2004, 2005 г.г.
Публикации. Основные результаты экспериментально-теоретических исследований опубликованы в журналах: "Клиническая лабораторная диагностика", 1993, № 2, с.61-63; 2004, № 10, с.48; 2005, № 9, с.39; 2006, № 3, с.55-56; "Бюллетень экспериментальной биологии и медицины", 1993, № 4, с.399-401; 1994, № 3, с.331-336 (статьи рекомендованы к публикации академиком А.А. Адо); "Вестник Российской
Академии медицинских наук", 1994, № 7, с.49-52, "Журнал эпидемиологии микробиологии и иммунологии", 1995, № 3, с.70-74 (статьи рекомендованы к публикации академиком А.А. Воробьевым); Вестник Самарского государственного университета, 2005, № 5 (39), с. 179-187; 2005, № 6 (40), с.184-193; 2006, № 4 (44), с.203-206; Биология, Разд. 04Б, Вирусология. Микробиология: РЖ ВИНИТИ, 1994, Вып. 12, с. 7, 19, 21; 1995, Вып. 1, с. 19-20, 22, а также в докладах, опубликованных в Трудах конференций: Первая Международная конференция "Приборостроение в экологии и безопасности человека («ПЭБЧ»), Санкт-Петербург, 1996, с. 100-106, 115-120; «I Международная школа-семинар БИКАМП, 98», Санкт-Петербург, 1998; «III Международная школа-семинар «БИКАМП,01», Санкт-Петербург, 2001, с.108-111, 126-128; «IV Международная школа-семинар, <<БИКАМП,03», Санкт-Петербург, 2003, с. 122-125, 225-228; Сб. научных статей под ред. Проф. СМ. Бабкина «Моделирование в медицинских и биологических исследованиях», Самара, 1999, с. 45-46; в Патентах на изобретение № 2087537, 20.08.97 г.; №2113467, 20.06.98 г.; Рац. Предложение № 351, 03.04.2003 г.
Всего опубликовано 40 работ, в том числе 2 патента и 1 рационализаторское предложение.
Структура и объем диссертации.
Диссертация состоит из введения, шести глав с резюме, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Она изложена на 268 страницах машинописного текста и содержит 103 рисунка и 45 таблиц. В списке цитируемой литературы 218 наименований, в том числе иностранной 55.
Характеристика микрофлоры организма человека
С современных позиций микрофлору человека рассматривают как совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих многочисленные экологические ниши на коже и слизистых оболочках полостей макроорганизма [30, 43, 79, 159, 165].
Большинство авторов считают, что нормальная микрофлора тела человека сформировалась в процессе эволюции в результате взаимодействия между макроорганизмом и окружающими его микробами, отбора определенных видов микроорганизмов, способных к прикреплению и колонизации кожи и слизистых оболочек. Причем эволюция макро- и микроорганизмов происходила параллельно и в тесной взаимосвязи друг с другом [29, 30].
Среди микроорганизмов, занимающих различные экологические ниши в организме человека, исследователи выделяют группы патогенных, условно-патогенных и симбионтных, непатогенных микробов. Патогенные микроорганизмы характеризуются выраженной агрессивностью и способностью защищаться от действия неспецифических защитных механизмов при попадании в макроорганизм. Условно-патогенные микроорганизмы характеризуются менее выраженной агрессивностью, ограниченной возможностью к колонизации макроорганизма, персистенции и распространению и лишь в условиях ослабления системы антиинфекционной резистентности проявляют свои вирулентные свойства. Группа симбионтных непатогенных микробов выделилась в результате эволюции и использует организм хозяина как новую среду обитания. Среди этой группы имеются комменсалы - микроорганизмы, живущие за счет макроорганизма и не приносящие ему вреда, и синергисты -микроорганизмы, участвующие в формировании эубиоза [19, 107].
Установлено, что нормальная микрофлора включает в себя десятки и сотни разнообразных видов, численность которых у взрослого человека составляет 1014 клеток, что на порядок превышает число клеток всех органов и тканей макр о организма [199]. Известно, что качественный видовой и количественный состав микрофлоры зависит от ее локализации. Наиболее сложные по составу микробиоценозы - это микрофлора толстой кишки, рта и носоглотки [166, 180,211].
Совокупность микробиоценозов макроорганизма обозначается как эубиоз (нормобиоценоз), а также микроэкология. Микроэкология характеризует не только качественное и количественное состояние микробной флоры различных частей макроорганизма, но также и их биохимическое, метаболическое и иммунологическое состояние.
Подавляющее большинство авторов склонны подразделять всю микрофлору биотопа на 3 части: облигатную (главная микрофлора); факультативную (условно-патогенная и сапрофитная микрофлора); транзиторную (случайные микроорганизмы).
Считается, что количество видов относительно невелико, но численно они всегда представлены наиболее обильно [30, 79, 159]. Многочисленными исследованиями установлено, что микроорганизмы, присутствующие в организме хозяина, находятся между собой в разнообразных отношениях (комменсализм, синергизм, паразитизм, мутуализм, синергизм). Благодаря наличию сложной и разветвленной системы кооперации между населяющими макроорганизм популяциями, микроэкологическая система человека выступает как единое целое, согласованно работающее в интересах всей системы и организма человека, в которой она локализована [107, 159, 209,211].
Доказано, что основу нормальной микрофлоры человека составляют облигатно-анаэробные бактерии [211]. В ротовой полости и в толстой кишке соотношение анаэробов и аэробов составляет 1000:1 и более. Помимо хорошо известных групп микроаэрофильных и аэробных бактерий (лактобактерии, бифидобактерии, бактероиды, клостридии, пептококки, пептострептококки и др.) в составе аутохтомной микрофлоры в последние годы обнаружены многочисленные представители и других анаэробов (Eubacterium, Megamonas, Leptotrichia, Selenomonas, Lachnospira и др.)
Многолетние исследования взаимоотношений макроорганизма и его нормальной микрофлоры показали, что индигенная микрофлора кожи и слизистых человека принимает участие в морфогенезе и функционировании различных органов и систем (иммунной, сердечно-сосудистой, эндокринной, нервной и др.) за счет продукции разнообразных ферментов, токсинов, витаминов, антигенов и других биологически активных соединений, а также метаболитов, которые образуются при микробной трансформации экзогенных и эндогенных субстратов [95, 96, 97, 160].
Экспериментальная установка для исследования динамики развития бактериальной популяции
При исследовании динамики развития бактериальной популяции в качестве основного измерительного инструмента были взяты процессы взаимодействия внешних ЭМИ (световых потоков) с бактериальной популяцией.
Известно, что толщина мембраны клеток большинства бактерий составляет примерно 0,01 мкм [54, 144]. Авторами установлено, что при такой толщине мембраны частота ЭМК, излучаемых клеткой, равна 5-Ю11 Гц. Имеются сведения также о том, что ЭМК с такой частотой оптимально взаимодействуют с ЭМК светового потока, длина волны которого лежит в диапазоне 440-700 нм [56]. Поэтому в качестве измерительного инструмента при изучении динамики развития бактерий был использован фотометрический метод, так как длины волн его светового потока лежат в диапазоне 315-980 нм, что в 2-8 раз меньше средних размеров бактериальной клетки (0,6 - 8 мкм). Это не позволяет изучать параметры отдельно взятой клетки, но дает возможность изучать бактериальную популяцию как систему взаимосвязанных клеток, так как размеры популяции не в 10, а в несколько сот раз превышают размеры измерительного инструмента.
О высокой чувствительности и связанной с ней прецизионности фотометрического метода говорят и теоретические исследования, приведенные в работе [5]. Предлагаемое автором выражение, описывает взаимодействие ЭМП различных источников, включая и световые потоки, с биологическими объектами: К(рт) = K{oz) + [к(0) - к(ос)\ (і + ш2т2 )" , где к =— А - химическое сродство реакции, є - степень полноты реакции, дє х - время релаксации, то есть время установления равновесного состояния, ю - частота ЭМИ светового потока. Из анализа этого выражения следует, что в случае совпадения частот наложенного на объект ЭМИ (светового потока) и ЭМИ самого объекта, отмечается скачок на зависимости величины 1 / тг(со), где 1 / хг - величина, обратная времени релаксации реакции. Причем, этот скачок наблюдается только в случае равенства со = 1/ т, то есть именно при равенстве длин волн ЭМИ наблюдаемых объектов и ЭМИ измерительного инструмента (светового потока). Жесткая скачкообразная зависимость этих величин говорит о высокой точности фотометрического метода, так как любые изменения частоты ЭМИ изучаемого объекта приводят к изменениям амплитуды светового потока, проходящего через этот объект. Кроме этого, такая зависимость позволяет сократить шаг наблюдений до нескольких секунд, что дает возможность изучать развитие клетки в динамике в реальном режиме времени с высокой степенью вероятности регистрации многих биохимико-физических процессов, протекающих в ней.
Практическая реализация фотометрического метода может быть осуществлена в конструкции приборов двух типов. В первом случае световой поток проходит по нормали к поверхности питательной среды, следовательно, будет поглощаться, в случае развития в объеме среды бактериальной популяции, тремя слоями: aj, а2, а3 (рис. 2.1). Наличие этих слоев было подтверждено экспериментально количественным соотношением жизнеспособных клеток в каждом слое (рис. 2.2, 2.3, 2.4).
Слой ai является областью, в которой процесс поглощения светового потока осуществляется в основном за счет вновь образовавшихся бактериальных клеток, то есть динамика изменения поглощения светового потока в этом слое питательной среды характеризует в наиболее "чистом" виде динамику развития бактериальной популяции (рис.2.2).
Наряду с этим при развитии бактериальной популяции возникает и третий слой аз (рис. 2.3) в объеме жидкой питательной среды, формируемый в основном погибшими особями, осевшими на дно кюветы. Толщина этого слоя является переменной величиной, жестко связанной с законами динамики развития бактериальной популяции. Однако характер этой связи, Рис. 2.1. Схема устройства фотометра с вертикальным прохождением света. I - устройство, формирующее световой поток, 2 - световой поток, 3 — кювета, 4 - рабочая часть. то есть закономерности поглощения светового потока именно этим слоем аз, пока не изучен. Следовательно, параметры, формируемые слоем а3, нельзя изъять из общей суммы результатов, полученных при прохождении светового потока через слои Э[ и а3 для анализа динамики развития бактериальной популяции в "чистом" виде.
Кроме этого, в эксперименте наблюдается возникновение и еще одного слоя аг (рис.2.4), механизм образования которого следующий. Вместе с погибшими бактериальными клетками в слой а3 могут опускаться и бактерии частично «коллапсированные». Не чувствуя влияния электрического потенциала соседних клеток (погибших), частично «коллапсированные» особи как бы получают сигнал о наличии свободного жизненного пространства и начинают делиться. Поскольку концентрация частично «коллапсированных» бактерий достаточно велика, поэтому над слоем аз возникают микропроцессы, подобные брожению. Эти микропроцессы формируют слой а2 в объеме питательной среды. Процесс прохождения светового потока через этот слой будет принципиально отличаться от процесса прохождения его через слои ai и а3. Причем, связь между закономерностями изменения прохождения светового потока через слои at и аг значительно слабее, чем связь между коэффициентами поглощения светового потока слоями aj и а3. Это обусловлено с нашей точки зрения неоднородностью микропроцессов, происходящих в слое а2. Кроме этого, характер поглощения светового потока слоем а2 также не изучен и, следовательно, является величиной неизвестной.
Таким образом, при использовании фотометра с вертикальным прохождением светового потока для изучения динамики развития бактериальной популяции коэффициент поглощения его светового потока может быть описан следующим уравнением: коэффициенты поглощения светового потока, прошедшего через слои, соответственно аь а2, аз. Второй и третий члены этого уравнения величины неизвестные. Поэтому коэффициент поглощения светового потока в этом случае может характеризовать динамику развития бактериальной популяции лишь в "замаскированном" виде, что требует довольно сложной расшифровки полученных результатов и приведения их к истинному значению.
При использовании же фотометра с горизонтальным прохождением света (КФК-2МП) для изучения динамики развития бактериальной популяции световой поток направляется параллельно поверхности питательной среды и, следовательно, с помощью сканирования светового потока по нормали к поверхности питательной среды можно изучать параметры слоев аь а2, аз независимо друг от друга, что позволит получить достоверные и воспроизводимые результаты о свойствах каждого слоя. Именно это и послужило основанием для использования в настоящей работе фотометра типа КФК-2МП (рис. 2.5).
Требования к методам исследования бактерий в динамике их развития
Анализ работ [9, 63, 122, 123] показывает, что многие процессы, происходящие в период развития бактериальной популяции быстротечны, длительность их исчисляется секундами и минутами, а динамика их развития представляет собой довольно сложную характеристику, которая обусловлена сложностью развития внутренних процессов в микроорганизмах.
В связи с этим при изучении динамики развития бактериальной популяции требуется применение методов исследования, у которых длительность измерения характеристик была бы меньше, по крайней мере, в 10 раз, чем длительность изменения параметров исследуемого объекта. Например, время генерации кишечной палочки составляет 16 мин [140], в то время как у используемого в настоящей работе прибора (КФК-2МП) шаг измерений характеристик исследуемого объекта составляет 5 с. Это позволяет с высокой точностью исследовать многие процессы, происходящие в бактериальной популяции в период ее развития, такие, например, как процесс синхронного деления. Причем, становится возможным не только зафиксировать сам факт синхронного деления, но и исследовать форму кривой динамики развития этого процесса. Результаты измерения параметров исследуемого объекта на качественном и количественном уровне должны давать максимально возможную и достоверную информацию об изучаемом объекте. Это в свою очередь требует совместимости измерительного устройства и методик анализа результатов исследований с электронно-вычислительной техникой.
Достоверность и воспроизводимость получаемых результатов исследований во многом определяются условиями развития микроорганизмов. В связи с этим материалы и методы, используемые при исследовании динамики развития бактериальной популяции, должны отвечать в свою очередь следующим требованиям. 1. Известно [98], что многие ингибиторные эффекты связаны с действием жирных кислот, которые могут содержаться в материалах, используемых при исследовании, например, в вате, на стенках стеклянной посуды, закрытой ватными тампонами и подвергшейся стерилизации сухим жаром при 160-180 С в течение 1,5 часов. Поэтому, посуда, применяемая при исследовании, должна быть обработана таким образом, чтобы на ней не оставалось загрязнений, органических веществ с антибактериальными свойствами. 2. Питательные среды должны быть стандартными с точно известным и воспроизводимым составом. В процессе культивирования микроорганизмов при изучении динамики их развития необходимо осуществлять контроль за температурой питательной среды, а также за величиной рН. 3. Перед исследованием материнская культура должна быть отмыта от продуктов жизнедеятельности. 4. Для получения достоверных и воспроизводимых результатов весьма важно также учитывать возраст, посевную дозу и способ внесения инокулята. 5. Методика для изучения динамики развития бактерий не должна требовать для своего выполнения специальных условий. 6. Измерение параметров жизнедеятельности микроорганизмов должно осуществляться не менее 5 раз. 7. Необходимо стремиться при выполнении методики к применению простого и доступного оборудования. 8. Если в качестве измерительного инструмента применяется световой поток, длина волны которого лежит в диапазоне 315-980 нм, что в 2-8 раз меньше средних размеров бактериальной клетки (0,6 - 8 мкм), то это позволяет изучать развитие бактериальной популяции как системы. При исследовании же бактериальной клетки размеры измерительного инструмента должны быть меньше размеров клетки не менее, чем в 10 раз.
Выполнение перечисленных выше требований позволяет получить воспроизводимые и достоверные результаты исследований динамики развития микроорганизмов с погрешностью до 3%.
Процесс подготовки материалов к исследованиям содержал два этапа: общую подготовку, которую проходили все без исключения материалы, и специальную, проводимую в соответствии с требованиями каждого конкретного эксперимента.
В данном разделе описана степень модернизации общей подготовки материалов эксперимента. Начальной стадией проведения эксперимента являлось значительное повышение чистоты исходных материалов, содержащих кюветы из кварцевого стекла, стеклянные пробирки, микропипетки, центрифужные пробирки и доведение до требований микроэлектроники. Получение максимально чистых исходных материалов позволило полностью устранить с их поверхности жиры и, следовательно, устранить их непредсказуемое влияние на процессы жизнедеятельности бактериальных популяций. Технически это осуществлялось кипячением стеклянной посуды (пипетки, пробирки) в 4-хлористом углероде в течение 10 мин. Кюветы фотометра согласно инструкции на прибор нельзя подвергать нагреванию до 100С. Поэтому очистка их поверхностей осуществлялась смесью Никифорова (смесь эфира и этилового спирта в соотношении 1:1). Отмывка поверхностей описанных материалов от продуктов 4-хлористого углерода осуществлялась в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Рабочей жидкостью в ультразвуковой ванне служила дианизованная вода, отличительной особенностью которой является высокая степень чистоты, а, следовательно, и высокая степень воспроизводимости ее свойств. Кюветы фотометра от остатков смеси Никифорова освобождались путем протирания их стерильными тампонами.
После выполнения описанных процедур стеклянная посуда стерилизовалась в сухожаровом шкафу при 170С в течение 40 мин, а кюветы - согласно инструкции на фотометр. Применение вышеизложенной методики позволило получить поверхности материалов, используемых при исследованиях, с практически неизмененными свойствами в каждом эксперименте. Стерильность материалов, использовавшихся в эксперименте, контролировалась путем выдержки контрольных растворов питательной среды (мясопептонного бульона) в кюветах и пробирках в течение 24 часов при 30-37С с последующим измерением их оптической плотности. В эксперименте использовались только те материалы, в которых оптическая плотность контрольных растворов была неизмененной по истечении 24 часов.
Другим не менее важным условием проводимых в настоящей работе исследований является использование воспроизводимых по своим свойствам питательных сред. В эксперименте использовались среды (мясопептонный бульон, мясопептонный агар) постоянного состава и рН (7,3 ± 0,2). Готовились среды на бидистиллированной воде в стеклянной посуде, обработанной по вышеописанной методике, что позволило получать питательные среды с четко контролируемыми составными частями и независимыми от природных загрязнений воды (фенол, хлор, аммиак др.), как основы питательных сред.
Гипотетическая модель динамики формирования межклеточных связей в бактериальной популяции
В результате восстановления собственных ЭМИ расстояние между отдельными клетками уменьшается на величину h - h0 (рис. 4.1 б), то есть на величину амплитуды этих излучений, что должно сопровождаться уменьшением светопроницаемости. Одновременно с восстановлением ЭМИ клетки начинают делиться. По мере увеличения количества клеток за счет процесса размножения расстояние между отдельными особями в какой-то момент времени достигнет некоторой критической величины Н (рис. 4.1 в), когда возможно их взаимодействие электромагнитными полями. Часть бактериальных клеток, у которых фазы ЭМИ совпадают, начинают синхронно делиться, что должно обуславливать новый подъем оптической плотности. Между остальными особями, то есть между разделившимися и неразделившимися клетками начинается процесс выравнивания фаз. Кроме того, уменьшается расстояние до Н между оставшимися особями, расположенными на расстоянии Н. Как только большинство клеток в популяции начинает колебаться в единой фазе, подключается механизм синхронного деления. Процесс выравнивания фаз длится до тех пор, пока не сформируется единая колеблющаяся (излучающая) система с единым типом межклеточных связей, то есть каждая особь в популяции начинает колебаться в единой фазе, с единой частотой и амплитудой и, следовательно, делиться с одинаковой скоростью. С момента формирования единой колеблющейся системы, то есть с момента установления между клетками прочных электромагнитных связей, должна начаться фаза логарифмического роста бактериальной популяции.
В фазе логарифмического роста быстро уменьшается расстояние между бактериальными клетками за счет их интенсивного размножения. Иначе говоря, увеличение количества особей в популяции означает увеличение количества источников первичных ЭМИ, длина волны которых соизмерима с длиной волны источника света. Увеличение количества источников излучения ЭМИ приводит к усилению поглощения светового потока, формируемого фотометром, что должно сопровождаться быстрым увеличением оптической плотности. Согласно теории электромагнитных волн взаимодействие ЭМИ между собой носит нелинейный характер и чаще всего аппроксимируется логарифмической функцией.
Фаза логарифмического роста длится до тех пор, пока не наступит эффект близкодействия между клетками (рис. 4.1 г), в результате которого нарушается колеблющаяся система, следовательно, изменяется характер межклеточных связей. Бактериальные клетки начинают, как бы мешать друг другу. При этом меняются как амплитуда, так и частота ЭМИ, сигнализирующие клетке о нарушении нормальных условий развития (рис. 4.1. д). Микроорганизмы, чтобы ослабить эффект близкодействия, который их деформирует (рис. 4.1 е), стараются прекратить колебательные движения. Часть погибших клеток начинает оседать на дно. Все это приводит к повышению проницаемости светового потока через раствор. Поскольку нарушение связей между клетками за счет изменения амплитуды колебаний быстротечно, постольку в этот период развития бактериальной популяции должно отмечаться резкое увеличение светопроницаемости. Мгновенно колебательные движения не могут прекратиться, так как это генетически обусловленное явление. Часть бактериальных клеток, не осевших на дно кюветы, устремляется в освободившееся пространство, восстанавливая межклеточные связи, что является причиной нового снижения светопроницаемости. Этот процесс должен повторяться до тех пор, пока большинство бактериальных клеток в популяции не прекратит колебательные движения. В конце этого периода жизнедеятельности микроорганизмов каждая особь бактериальной популяции вновь становится независимой (автономной) частицей, то есть частицей, являющейся источником только вторичных ЭМИ, что должно обуславливать увеличение светопроницаемости. Более того, под действием силы тяжести клетки, погибшие в результате эффекта близкодействия, оседают на дно кюветы, что должно способствовать еще большему увеличению светопроницаемости.
Таким образом, согласно предлагаемой в настоящем разделе модели жизнедеятельности микроорганизмов бактериальные клетки представляют собой своеобразные генераторы ЭМИ, посредством которых осуществляются межклеточные взаимодействия в бактериальной популяции в процессе ее развития.
Передача биологической информации с помощью квантов ЭМИ оптического диапазона имеет свою историю [70, 71, 72, 73, 138]. Установлено, что ЭМИ в диапазоне от инфракрасной до ультрафиолетовой области спектра принимают обязательное участие в процессах жизнедеятельности любых биосистем. Есть основание предполагать, что электромагнитные взаимодействия представляют собой один из общих принципов информационных взаимоотношений живых систем, отражаясь в проявлениях различных форм жизнедеятельности. В процессе эволюции живого мира ЭМП из неизбежных спутников и свидетелей биохимических процессов в результате естественного отбора превратились в важнейшую информационную систему и обязательный атрибут жизни [71].
В работе [69] описаны результаты исследования жизнедеятельности культур в гипомагнитнои камере, то есть в условиях экранирования от внешних ЭМИ. Обнаружено значительное увеличение митотической активности и числа патологических митозов. Наблюдалось угнетение процессов жизнедеятельности клеток. Причем, культура дегенерировала, что приводило к гибели клеточного монослоя. Дегенерация клеточной культуры имела обратимый характер.
В работах [133, 136, 150, 169] показано, что у растущих в экранированном пространстве коринебактерий, эшерихий, шигелл, сальмонелл, клебсиелл и стафилококка после длительных пассажей изменяются интенсивность размножения, биохимическая активность, ряд видовых признаков и свойств, а также токсичность и антибиотикорезистентность.
Авторами работы [71] изучались дистантные межклеточные взаимодействия при помощи метода биологического детектирования. Культура ткани заражалась вирусом, отравлялась сулемой или подвергалась действию УФЛ. В интактной культуре развивались все признаки поражения при наличии только оптического контакта с пораженной тканью. Феномен дистантных межклеточных взаимодействий обнаружен у всех исследованных авторами первичных и перевиваемых гомологичных клеточных культур и при использовании агентов биологической (вирусы), химической (клеточные яды) и физической (УФ-радиации) природы. Эти исследования свидетельствуют об универсальном характере информационной связи и широком использовании электромагнитного канала в живой природе.
