Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Определение биологических границ жизни 10
1.2. Группа микроорганизмов, устойчивых к экстремальным отклонениям физических параметров окружающей среды 13
1.3. Группа микроорганизмов, устойчивых к экстремальным отклонениям химических параметров окружающей среды 18
1.4. О влиянии некоторых анионов на микробный рост 26
1.5. Биотехнологический потенциал экстремофильных микроорганизмов 32
1.6. Заключение 40
ГЛАВА 2. Объекты, материалы и методы 41
2.1. Объекты исследований 41
2.2. Материалы и реагенты 41
2.3. Микробиологические методы 42
2.3.1. Питательные среды 42
2.3.2. Селективные среды для скрининга на основе токсичных солей натрия 43
2.3.3. Условия культивирования и инокуляции 45
2.3.4. Почвенные образцы, отбор и их хранение 45
2.3.5. Приготовление и хранение интегральных почвенных образцов 45
2.3.6. Учет численности микроорганизмов, определение сублетальных ингибирующих концентраций L50 и L9o 46
2.4. Методы микроскопических исследований 47
2.5. Методы таксономических исследований 47 2.5.1. Фенотипический анализ 47
2.5.2. Филогенетический анализ 48
2.6. Молекулярно-биологические методы исследований 49
2.6.1. Амплификация гена рибосомальной РНК с помощью ПЦР 49
2.6.2. Секвенирование последовательностей гена 16S рРНК 50
2.7. Методы биохимических исследований 51
2.7.1. Определение оптической плотности биомассы 51
2.7.2. Определение скорости денитрификации нитритустойчивых бактерий 51
2.8. Физико-химические методы исследований 51
2.8.1. Определение концентрации ионов натрия в растворах 51
2.8.2. Определение газообразных продуктов реакции денитрификации 52
2.9. Математическая и статистическая обработка результатов
экспериментов 52
ГЛАВА 3. Сравнение токсичности натриевых солей различной природы 53
3.1. Разработка метода сравнительной оценки токсичности различных на триевых солей 54
3.2 Количественная оценка токсичности натриевых солей. Ряд токсичности натриевых солей 61
ГЛАВА 4. Устойчивость микроорганизмов к высоким концентрациям нитрита натрия 66
4.1. Оценка токсичности нитрита натрия 66
4.2. Скрининг нитрит-толерантных бактерий 68
4.3. Фенотипическое описание нитрит-толерантных бактерий 71
4.4. Филогенетическое положение нитритустойчивых бактерий 75
4.5. Денитрифицирующая активность нитрит-толерантных культур 79
ГЛАВА 5. Обнаружение других типов бактериальной анионрезистентности 83
5.1. Токсичность азида, бензоата, селенита и фторида натрия при разных значениях рН 83
5.2. Выделение и фенотипические характеристики бензоат- и азид-устойчивых бактерий 85
5.3. Филогенетическая позиция бензоат- и азидтолерантных бактерий 89
ГЛАВА 6. Биотехнологический потенциал нитрит-толерантных бактерий 92
6.1. Денитрификация стока, содержащего 2% NaN03 с использованием Halomonas sp. Л 92
6.2. Анаэробная микробиологическая очистка воды от органических соединений с использованием азотной кислоты в качестве окислителя 97
Выводы 100
Список литературы 101
Приложения
- Группа микроорганизмов, устойчивых к экстремальным отклонениям физических параметров окружающей среды
- Селективные среды для скрининга на основе токсичных солей натрия
- Оценка токсичности нитрита натрия
- Токсичность азида, бензоата, селенита и фторида натрия при разных значениях рН
Введение к работе
Микробная жизнь в экстремальных (выходящих в человеческом понимании за пределы «нормы») природных и антропогенных условиях, может быть удивительно разнообразна. Понятие «экстремофилы», «любящие экстремальность», введенное в практику Macelroy (1974), указало на возможность поиска новых микроорганизмов в нишах, ранее даже в принципе не представлявшимися возможными для жизни. Микробиология экстремофилов стала активно развиваться в последнее десятилетие, начавшись с нескольких больших обзоров (Madigan & Marrs, 1997; Horikoshi & Grant, 1998), обозначившись все большим количеством симпозиумов, секвенированных геномов, зарегистрированных патентов, с запуска и согласованного финансирования программ, таких, как национальный научный фонд США и программа NASA о жизни в экстремальных условиях, появлению таких наук, как экзо- и астробиология, а также европейских программ Union's Biotechnology of Extremo-philes и Extremophiles as Cell Factories (Aguilar, 1996; Aguilar et al., 1998).
Факторы экстремальности условно могут быть разделены на физические и химические отклонения окружающей среды от «нормальности» (Rothschild & Mancinelli, 2001). Физические простираются в область высоких и низких температур, давлений, влажности, ультрафиолетового и радиоактивного излучения. К химическим отклонениям относят вариации рН в кислую и щелочную сторону, наличие в среде высоких концентраций соли (NaCl), ионов токсичных металлов например, меди и ртути. В силу того, что наличие ядовитых катионов двухвалентных металлов, вероятно, не может способствовать какой либо известной форме жизни, и греческий термин «рЫ1ео»-«любить» здесь неуместен, для обозначения последней группы «микроорганизмов», используется название «толерантные к высоким концентрациям ионов тяжелых металлов». Часто встречаются экстремофилы со смешанным типом устойчивости, когда, например, гипертермофильность сочетается с пьезофильностью, галофильностью и алкалотолерантостью, что свойственно, в частности для многих представителей Archaea.
Одной из наиболее изученных групп химических экстремофилов являются галофильные бактерии, уже длительное время привлекающие внимание исследователей. В классическом понимании, это микроорганизмы, растущие при высоких концентрациях соли, под которой подразумевается хлорид натрия. Имеется лишь ряд общих упоминаний, о том, что NaCl может быть заменен на бромид или сульфат (Vreeland, 1984). Между тем, среди натриевых солей есть одно- и много- замещенные производные, практически инертные, и химически активные, обладающие окислительными и восстановительными свойствами, гидролизующиеся и стабильные в водных растворах. Очевидно, что та или иная реакция микроорганизмов в ответ на введение отличной от хлорида натриевой соли в питательную среду может также являться ответом на появление соответствующих анионов в их жизненном пространстве.
Если исключить из обсуждаемого ряда соединения, такие, например, как гипохлорит, перманганат, феррицианид натрия (и т.д.), биоцидная активность которых проявляется в результате окислительных или восстановительных реакций с белками, полисахаридами и другими компонентами клетки, то можно обнаружить немало химически нейтральных, но, вместе с тем, достаточно токсичных для представителей микробного мира соединений. К таковым, относятся, например, бензоат, сорбат, салицилат, азид, и вероятно, многие другие натриевые соли. Очевидно, что способность к подавлению жизненных функций микроорганизмов в ряде случаев не может быть объяснена лишь с позиций химической агрессивности аниона или каких-то других, чисто химических процессов. Для нас главным являлся вопрос: возможно ли существование явления «анионтолерантности», как проявления экстремо-фильности, выраженного в том, что разные микроорганизмы будут существенно отличаться по своему отношению к какому-либо «аномально» токсичному аниону в силу своих генетических особенностей.
В связи с выше сказанным, целью настоящей работы являлась демонстрация существования явления анионтолерантности как одной из форм экс-тремофильности. При этом также предполагалось получить количественные
данные о токсичности солей натрия различной химической природы, осуществить необходимый скрининг, показать на найденных штаммах наличие вариаций чувствительности различных групп микроорганизмов к избранным химическим факторам. При наличии устойчивости планировалось подробно охарактеризовать отдельные штаммы и молекулярно генетическими методами (по 16S рРНК), показать родственность (или филогенетическую удаленность) внутри исследуемой выборки микроорганизмов.
Для достижения поставленной цели обнаружения явления анион-резистентности у бактерий, как одной из разновидностей экстремофиль-ности необходимо было решить следующие задачи:
Разработать метод количественной оценки токсических свойств химических веществ (натриевых солей различных кислот) по отношению к широким группам бактерий.
Исследовать в сравнимых условиях их токсичность и построить ряд активности ПО Lgo-
Выделить из природных мест обитания, а также из техногенных ниш бактерии, устойчивые к высоким концентрациям токсичных солей и предположительно относящиеся к анионтолерантным разновидностям экстре-мофилов.
Получить чистые культуры ряда выделенных штаммов и определить последовательность генов кодирующих их 16S рРНК.
Провести филогенетический и морфолого-биохимический анализ выделенных штаммов и сделать вывод о наличии филогенетического родства или отсутствия такового в выборках толерантных (анионтолерантных) культур, выделенных из географически удаленных мест обитания.
Научная новизна. Впервые установлен ряд микробной токсичности натриевых солей. В группе алкалофильных бактерий обнаружены широкие вариации устойчивости бактерий по отношению к бензоату, нитриту, азиду, селениту, фториду, а также некоторым другим токсичным солям натрия. Выделены культуры, проявляющие толерантность к 10% нитрита, 2% азида и 10% бензоата натрия. Продемонстрирована высокая денитрифицирующая ак-
тивность нитрит-толерантных изолятов, относящихся к роду Halomonas. Определены полные последовательности 16S рРНК у 7 культур, для 2 культур -фрагменты данного гена. Показано филогенетическое сродство некоторых нитрит- и бензоат-толерантных изолятов, нитрит- и азидустойчивых культур. Для обозначения предположительно новой группы экстремофильных микроорганизмов введен термин анионтолерантные культуры.
Практическое значение. Разработан метод количественной оценки токсичности новых соединений с использованием в качестве тест-объекта интегральных микробных ассоциаций почвы. Создана коллекция штаммов, включающая нитрит-, азид- и бензоат- (и некоторые др.) толерантные бактерии. Полные последовательности генов 16S рРНК 7 культур депонированы в банке данных EMBL. Разработана схема аноксического (бескислородного) окисления органических субстратов с применением азотной кислоты в качестве акцептора электронов. Показан высокий денитрифицирующий потенциал некоторых штаммов рода Halomonas в процессах удаления связанного азота в форме солевых смесей содержащих анионы NO3" и NCV, из растворов, имеющих высокую ионную силу, являющихся характерными отходами процессах обогащения некоторых тяжелых металлов и очистке газовых выбросов от NOx (Гильванова и Усанов, 2001, 2003).
Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: Конференция, посвященная 150-летию со дня рождения академика И.П. Павлова, (Уфа, 1999); III Съезд Доку-чаевского общества почвоведов (Суздаль, 2000), Международная конференция «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов, выводов, приложений и списка цитируемой литературы, содержащего 211 ссылок. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, содержит 26 рисунков и 8 таблиц.
Группа микроорганизмов, устойчивых к экстремальным отклонениям физических параметров окружающей среды
Термофилы. Трудно провести четкую границу между термофильными и не являющиеся таковыми штаммами бактерий и грибов. Вместе с тем, считается, что факультативные термофилы, имеют максимальную температуру роста между 50С и 65С, хотя и способны к размножению при комнатной температуре. Они образуют большую группу, включающую и такие эукариотические виды как Aspergillus fumigatus, Melanocarpus albomyces (Hemida, 1992; Jain et al., 1992; Pretorius & Lempert, 1993; Жданова, 1998) и дрожжи Torula thermophila, Kluyveromyces marxianus (Banat et al., 1998). Стрептомицеты представлены Streptomyces thermoviolaceus (Brabban & Edwards, 1996; Edwards, 1993; Kim et al., 1999).
Термотолерантные бактерии, которые имеют максимальную температуру роста 45-50С, также способны к росту при комнатной температуре {Bacillus licheniformis, В. subtilis). К облигатным термофилам принадлежат те, у которых наблюдается оптимум роста при температуре 65-70С, но не способные к росту при температурах ниже 40-42С. Наиболее изучены термофилы родов Bacillus (Wisotzkey et al., 1992) и группы Thermus (Beffa et al., 1996; Moreira et al., 1997).
Гипертермофилы, способные к более быстрому росту при температурах выше 80С, были открыты в последние лишь 1-2 десятилетия (Huber et al., 2000), в процессе изучения специфических природных ниш, характеризующихся высокой температурой (гейзеры, подводные гипертермальные источники, подземные месторождения, антропогенные источники и т.д.). Выделение гипертермофилов стало возможным с развитием так называемой "техники разобщения без использования чашек Петри" (plating-independent isolation), основанной на использовании лазерной микроскопии.
В общей сложности, за 15-20 лет выделено и охарактеризовано около 75 новых видов, архебактерий и бактерий, представляющих 32 рода и 10 порядков. Весьма интересным представляется тот факт, что культура Pyrolobus fumarii не может расти при температуре ниже 90С и проявляет способность к развитию в вегетативной культуре при 113С. (BlochI et al., 1997). Проведенные исследования привели к убеждению, что термофильность включает множество молекулярных механизмов, и не может быть объяснена только каким-нибудь одним свойством организма. Одна из гипотез объяснения природы термофилии подчеркивает роль мембранных липидов. Уже давно было замечено, что липиды термофилов имеют более высокие температуры плавления, чем липиды мезо-филов, что достигается возрастанием содержания насыщенных жирных кислот в мембранах при повышении температуры культивирования и, тем самым, способствуя термостабильности мембран. (Гусев, Минеева, 1992). Немаловажную роль в явлении термофилии, возможно, играют белки, в первую очередь ферментные. Объяснению молекулярных основ повышенной термостабильности ферментов термофильных микроорганизмов посвящен ряд обзорных статей и работ (Fontana, 1986; Thomas et al., 1987). Термостабильность этих ферментов определяется такими стабилизирующими факторами, как дополнительные электростатические взаимодействия, существование дополнительных внутримолекулярных S-S-связей, дополнительные гидрофобные взаимодействия (Шульц, Ширмер, 1982; Tanford, 1980).
Психрофилы. В противоположность термофилам для их развития оптимальной является низкая температура. Область температур роста психрофилов лежит в пределах от -10 до +20С и выше. В свою очередь, психрофилы делятся на облигатных и факультативных. Основное различие между подгруппами заключается в том, что облигатные психрофилы не способны к росту при температуре выше 20С, а верхняя температурная граница роста факультативных форм намного выше. Таким образом, факультативные психрофилы характеризуются более широким температурным диапазоном, при котором возможен их рост. Принципиальное же сходство между ними - способность к росту при 0С и минусовых температурах. Имеющиеся данные о способности развития микроорганизмов при -10С достоверны, и эту температуру следует считать сегодня крайней минусовой для роста микроорганизмов (Iizuka et al., 1966; Лях, 1976). Облигатные психрофилы приспособились к обитанию в неустойчивых холодных условиях, тогда как психрофилы второго типа приспособились к обитанию в неустойчивых холодных условиях. Среди выделенных и охарактеризованных таксономических групп психрофильных микроорганизмов подавляющее большинство составляют бактерии следующих родов: Achromobacter, Aerobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Arthrobacter, Corynebacterium, Flavobacte-rium, Micrococcus, Proteus, Pseudomonas, Streptococcus, Vibrio, (Носкова, 1972). Грибы представлены Alternaria, Cladosporium, Hormodendron, Stemphylium (Артамонова, Красильников, 1972). Способность психрофилов расти в условиях низких температур связывают, в первую очередь, с особенностями их ферментных белков и мембранных липидов. Увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот в мембранных липидах позволяет мембранам находиться в функционально активном жидкостно-кристаллическом состоянии и при низких температурах (Квеситадзе, 1990). Также отмечается повышенная чувствительность к высоким температурам большинства цитоплазматических структур психрофилов и в особенности ферментов. В подавляющем большинстве случаев, рибосомная фракция у психрофилов термолабильна. Установлено наличие белкового фактора, стабилизирующего функцию психрофильных рибосом при температурах в районе нуля (Квеситадзе, 1990).
Селективные среды для скрининга на основе токсичных солей натрия
В работе использовали лабораторную коллекцию анионтолерантных культур микроорганизмов, выделенных из разнообразных природных мест обитания (культуры, обозначенные аббревиатурой IB), а также типовые штаммы Российской (ВКМ), Немецкой (DSZM) коллекций микроорганизмов.
В процессе работы, чистые культуры хранили при +4-г5 С на чашках Петри, содержащих агаризованные среды BS, XBz и ВТ, пересевая с периодичностью один раз в три месяца. Для более длительного хранения использовали замораживание бактериальной суспензии, содержавшей 12-16% глицерина при -18ч--20С. Для физиолого-биохимических тестов, в экспериментах по обнаружению денитрифицирующей способности, использовали 2-3-х суточные колонии чистых культур, полученные путем высева бактериальной суспензии, разведенной в стерильном растворе 0,9% хлористого натрия, на базовую агаризо-ванную среду.
В экспериментах, связанных с изучением денитрификации, использовали анаэробную накопительную культуру, полученную в течение суток на среде MGF при 40С.
В работе использовали соли и реактивы квалификации Ч.Д.А. и Х.Ч., а также агар фирмы "Difco", пептон (Семипалатинск), дрожжевой экстракт фирмы "Gibco", Казаминовые кислоты "Difco", неорганические и органические натриевые соли фирмы "Sigma". В работе применяли ферменты, олигонуклеотид-ные праймеры, смесь дНТФ "Fermentas", "Promega", агарозу разного типа фирм "Sigma" и "Promega", а также набор Gel Purification Kit (Germany).
Для хранения и поддержания выделенных культур на чашках Петри, и в экспериментах по определению токсичности неорганических и органических натриевых солей, использовали среду ВТ следующего состава, в граммах: Питательный бульон "Nutrient broth" 8 Дрожжевой экстракт 2 КН2Р04 2 Агар 16 Вода дистиллированная 1000 мл рН после стерилизации 6,8
Перед стерилизацией, кислотность среды доводили до значения 6,8, используя 20% раствор КОН, и контролируя рН с помощью рН метра ОР-211/1 ("Radelkis", Венгрия). Стерилизацию сред осуществляли автоклавированием при 1 ати в течение 40 минут. Вариант питательной среды с высоким значением рН (9,2-9,4) получали путем смешения стерильных растворов 10% Na2C03 и собственно питательной среды, непосредственно перед разливом ее в чашки Петри. Во всех остальных средах, рН корректировали теми же методами.
Для хранения нитритустойчивых культур готовили агаризованную базовую среду BS следующего состава, в граммах: Дрожжевой экстракт 10 NaN02 10 NaCl 40 КН2Р04 2 Агар 16 Вода дистиллированная 1000 мл рН среды 9,2-9,4 рН среды доводили до 9,2-9,4 как описано ранее.
Денитрифицирующую активность нитрит-толерантных культур определяли при выращивании на жидкой среде MGF, содержащей следующие компоненты, в граммах: Дрожжевой экстракт 50 NaN02 20 КН2РО4 4 Na2C03 6 Вода дистиллированная 1000 мл рН среды после стерилизации 9,2-9,4
Питательная среда SM2 с нитратом для проведения экспериментов по анаэробному культивированию штамма Halomonas sp. Л имела следующий состав: Дрожжевой экстракт 20 NaN03 20 NaCl 10 КН2РО4 4 Na2C03 6 Вода дистиллированная 1000 мл рН среды после стерилизации 9,2-9,4
Облигатную потребность нитритустойчивых культур в ионах натрия определяли по наличию или отсутствию бактериального роста на безнатриевой среде МК, аналогичной по составу среде ВТ, за исключением того, что вместо ИагСОз был использован К2СО3. Общее содержание натрия, вносимого в тестовую среду МК вместе с другими компонентами среды, составляло 90-100 мг/мл.
Для выделения нитритустойчивых бактерий использовали жидкую нако пительную среду SM, состав которой в (г) приведен ниже:
Дрожжевой экстракт Для скрининга нитритустойчивых бактерий использовали варианты среды SM, в состав которых вместо дрожжевого экстракта входили такие энергетические субстраты, как глюкоза, этанол, ацетат, бутират, глицерин, пируват. Среды с этими компонентами имели аббревиатуру G1M, ЕМ, AM, ВМ, GM, и РМ соответственно.
Для выделения бензоатустойчивых бактерий готовили жидкую накопительную среду XBz, содержащую в граммах: Питательный бульон Nutrient broth 5 Дрожжевой экстракт 2 Бензоат натрия 80 КН2Р04 2 Агар 16 Дистиллированная вода 1000 мл рН среды 9,2-9,4 рН до нужного значения доводили как описано выше. Чистые культуры бензоат-толерантных бактерий поддерживали на агари-зованных средах ВТ и XBz, содержащих бензоат натрия в количестве 3% (w/v).
Оценка токсичности нитрита натрия
Тем не менее, подход, основанный на составлении искусственных ассоциаций, может быть лишь гипотетическим, и для его осуществления необходимо решить очень многие вопросы. Какие именно родовые или видовые группы. Следует использовать в тестах, каким образом сохранить активность подобной смеси на протяжении длительного опыта и др.? В подобной ситуации представляется допустимым обратиться к использованию готового биологического материала, взятого, к примеру, из природных ниш, заселенных разнообразными микробными сообществами. С различных точек зрения наиболее перспективными в этом отношении представляются микробные ассоциации почв (Звягинцев, 1987), включающие разнообразные формы микроорганизмов, и представляющие собой (при соблюдении соответствующих мер предосторожности), весьма стабильную в процессе хранения систему.
Последнее преимущество является важным при организации серий опытов, растяженных во времени. При этом не следует полностью исключать возможность отклонений (от статистически нормального) микробного состава каких-либо почвенных образцов, что может быть связано с местом отбора проб, или предысторией их хранения. Следствием этого может быть неадекватный отклик в отношении каких-либо химических ингредиентов.
И, хотя, мы и не обнаружили подобных эффектов, при повторном тестировании сонцида тремя образцами почвы (Гильванова, Усанов, 2003), защитные меры, в данном случае, не являются большим методическим усложнением. На наш взгляд, проблема полностью может быть решена, если использовать интегральные почвенные смеси, включающие в своем составе несколько компонентов почвенных образцов одинаковой массовой концентрации, отобранных в разных местах. Как показал опыт нашей работы, для количественной оценки эффективности биоцидов широкого спектра действия оптимальным и достаточным является использование бактериальных ассоциаций, полученных из 10-15 равных по весу образцов почвы, отобранных из географически удаленных мест, и проявляющих активность по высеваемому титру не менее 10 КОЕ/г сухого материала. Помимо бактериальной осемененности, мы также контролиро вали величину рН отдельных образцов измеренную стандартными методами. По нашему мнению она должна была находиться в интервале 5,8-7,8.
Процедура приготовления интегральных почвенных образцов описана в главе 2 «Объекты, материалы и методы».
Разработанная количественная оценка биоцидной активности химических соединений с помощью искусственно созданных микробных ассоциаций, получила сокращенное рабочее название «метод интегральных почвенных образцов», и была использована в ходе всех экспериментов. По нашему мнению, предложенный метод интегральных почвенных образцов позволяет в сопоставимых условиях испытывать биоцидные свойства малоизученных и далеких по своей структуре химических соединений, более объективно проводить сравнения результатов исследований, выполненных в различных лабораториях.
Для испытаний в качестве ингибирующих агентов были использованы 20 солей натрия (табл. 4), химически инертных в условиях микробиологического эксперимента. Соединения, относящиеся к разряду «нестабильных», подверженных быстрому окислению кислородом воздуха, или, наоборот, являющиеся окислителями, легко гидролизуемые, зависимые от рН, нами не изучались.
Основными показателями, определяющими токсичность натриевых солей, являлись величины сублетальных концентраций L50 и L9o, более подробно охарактеризованные в разделе 2.3.6. Все эксперименты по определению токсичности солей натрия проводили с одной и той же «интегральной» смесью (интегральный почвенный образец № 2), полученной в результате гомогенизации одинаковых количеств 15 различных образцов почв, отобранных в географически удаленных местах Башкирии, Пермской и Кировской обл., Финляндии (табл. 2). Измеренная рН смеси, составила величину 6,2+0,07, начальный титр КОЕ при высеве почвенной суспензии на среду ВТ был определен на уровне 1,9-10 ±9,6-107г почвы. Исследуемую соль, в виде концентрированного раствора или порошка, добавляли в жидкую агаризованную стерильную среду и тщательно перемешивали, поддерживая температуру 50-60С на водяной бане. Высевы осуществляли в 3-кратной повторности на чашки Петри с богатой агаризованной средой ВТ. Инокулированные чашки десятичными разведениями почвенной суспензии инкубировали в термостате при 37С в течение 2-3 дней.
Токсичность азида, бензоата, селенита и фторида натрия при разных значениях рН
Сам факт наличия нитрит-толерантных бактерий в природных группах алкалофильных и алкалотолерантных бактерий свидетельствовал о том, что обнаруженный феномен может иметь место и в случае использования других токсичных солей натрия, таких, как фторид, бензоат, азид и др. Для экспериментального подтверждения этого тезиса, в сравнимых условиях нами дополнительно была изучена антимикробная активность натриевых солей бензойной, азидоводородной, селенистой, фтористоводородной (и некоторых других кислот) по отношению к микроорганизмам, являющимся нормофилами и алкало-филами. Количественную оценку токсичности проводили на твердых средах (см. 2.3.1.), имеющих два дискретных значения рН=6,8 и рН=9,4 и включающих различные концентрации исследуемых соединений. Чашки с агаризованнои средой инокулировали десятичными разбавлениями почвенной суспензии интегрального почвенного образца №2 (см. разд. 3.1).
Зависимость доли (в % к контролю) прорастания колоний, от молярных концентраций тестируемых токсичных солей натрия, измеренная в идентичных условиях при двух фиксированных значениях рН (6,8 и 9,4), показана в виде четырех графиков на рис. 17 а, б, в, г. Во всех случаях, степень прорастания колоний алкалофильных микроорганизмов по сравнению с нормофильными, оказалась существенно более высокой. Схожие эффекты были достигнуты также с формиатом, оксалатом, перхлоратом натрия и другими солями (данные не приводятся). На основании полученных резкльтатов, был сделан вывод о том, что скрининг микроорганизмов, устойчивых к повышенным концентрациям солей натрия, антимикробные свойства которых определяются природой токсичных анионов, возможен в группах алкалофильных бактерий развивающихся при высоких значениях рН. Таким образом, стало очевидным, что принцип, положенный в основу выделения галофилов и галотолерантных микроорганизмов, может быть модифицирован, если в накопительные среды вводить другие натриевые соли, такие, как азид, бензоат, фторид, селенит, тел-лурит, перхлорат и т.д. Бактерии, которые выделяются по этой процедуре, могут получить название анионтолерантных экстремофилов.
Наибольший теоретический интерес представляло изучение общего таксономического положения групп бактерий, устойчивых к различным солям натрия высокой токсичности. В качестве химических детерминант в селективных средах, использованных для скрининга, были выбраны азид и бензоат натрия, являющиеся классическими биоцидами. Принимая во внимание данные графических зависимостей (рис. 17 а и б), нами были сконструированы соответствующие селективные среды с высокими концентрациями токсичных солей (см. 2.3.2.).
Получение накопительных культур. С целью выделения бензоат- и азид-толерантных изолятов, пробирки, содержавшие по 10 мл селективных сред XBz и XAz соответственно, инокулировали индивидуальными пробами почв и термостатировали при 35С. Период инкубирования для получения накопительных бензоат-толерантных культур обычно составлял 2-3 сут, тогда как азид-устойчивые развивались медленнее и оптическая плотность культураль-ной жидкости достигала значений 0,5-0,7 ед (при 600 нм) лишь на 3-4 сутки в условиях аэробиоза. Чистые культуры получали путем прямого посева положительной накопительной культуры, предварительно разбавленной методом 10-кратных разбавлений на соответствующую агаризованную среду XBz или XAz с последующим пассажированием полученных колоний до чистых культур. Для дальнейших исследований отбирали доминантные морфотипы колоний, которые в таблице 6 имеют аббревиатуру В(1-10) для бензоат- и А(6,35) для азид устойчивых бактерий. Соответственно, бактерии, устойчивые к азиду натрия были названы азид-толерантными, в случае с бензоатом - бензоат-толерантными. Фенотипическая характеристика бензоат-толерантных бактерий. В результате скрининга, всего было выделено 10 бензоат-толерантных штаммов, характеризующихся различной морфологией клеток: к грам (+), спорообра-зующим были отнесены изоляты, получившие номера в коллекции В1, В2, ВЗ, В4, В5, В7, В8, В9. Грам (+) выборка была также представлена коккобактерия-ми В6 и В10. Все новые культуры являлись органогетеротрофными, каталаза-положительными (исключение составляли штаммы В6 и В10) и оксидазополо-жительными бактериями. На средах ВТ и XBz большинство культур формировали среднего размера колонии, округлые, гладкие, непрозрачные и полупрозрачные, без существенной пигментации, за исключением 2 коккобактерий, образующих колонии желтого цвета. Выделенные культуры хорошо росли на ага-ризованных средах, содержащих до 10% бензоата натрия, при этом рост наблюдался в интервале температур 15- 45 С, за исключением штаммов В1, В2 и В5, демонстрировавших рост при 50С. Бензоат-толерантные изоляты были способны расти в диапазоне рН 7-10 (В 1 развивался при рН 6,8). Дальнейшая дифференциация спорообразующих культур была выполнена в соответствии с морфологией спор и спорангиев по классификации Gordon (1973). Микроскопические исследования позволили отнести к I морфологической группе культуры В1, ВЗ, В4, В7 и В8, клетки которых представляли собой подвижные короткие палочки правильной формы, формирующие эллипсовидные и цилиндрические эндоспоры, не раздувающие спорангий. Во II морфологическую группу входили изоляты В2, В5 и В9, имевшие подвижные длинные палочковидные клетки, образующие эллипсоидальные эндоспоры терминально, раздувающие спорангий.
Похожие диссертации на Скрининг и изучение новых экстремофильных микроорганизмов, устойчивых к повышенным концентрациям солей натрия с биоцидными свойствами
