Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы. 11
I. Gcn5-содержащие комплексы многоклеточных. 11
Транскрипция и ацетилирование 11
Структурная организация GCN5 и PCAF белков и их функции . 12
Два различных GCN5-содержащих комплекса многоклеточных и их состав. 14
GCN5-содержащие STAGA/TFTC-подобные комплексы массой 2 МДа. 14
GCN5-содержащие АТАС комплексы массой 700 кДа. 16
Трехмерная структура SAGA/TFTC-подобных комплексов. 18
Функции GCN5-содержащих комплексов. 19
II. Экспорт мРНК и транскрипция. 24
Рецептор и адаптеры экспорта мРНК. 24
TREX комплекс. 25
Sac3-Thpl-Susl-Cdc31 комплекс. 26
III. Транскрипция на периферии ядра. 28
Эпигенетическое состояние генома. 28
Транскрипционно неактивный хроматин и ядерная периферия. 29
Репрессия теломер у дрожжей. 29
Ядерная ламина и репрессия генов. 31
Транскрипционно активные гены на периферии ядра . 32
Факторы, влияющие на связывание транскрипционно активных генов с NPC. 34
Влияние мРНК на прикрепление генов к ядерным порам. SAGA комплекс участвует в организации связывания генов с IV. Инсуляторы.
Организация эукариотических геномов. Su(Hw) - зависимые инсуляторы.
Строение и белковый состав Би(Нм>)-инсуляторов.
Энхансер-блокирующая активность 5и(Ну^)-инсуляторов.
Барьерная активность 8и(Нм?)-инсуляторов. Модели функционирования инсуляторов.
Экспериментальная часть.
I. Объект и задачи исследования. И. Материалы и методы.
1. Материалы.
Штаммы и вектора S. cerevisiae и Е. Coll
Клеточные линии.
Библиотека кДНК.
Эмбриональный ядерный экстракт.
Дрожжевые и бактериальные среды.
Ферменты и реактивы.
Антитела.
Праймеры.
Конструкции для двухгибридного скрининга.
Конструкции для экспрессии рекомбинантных белков .
Конструкции для трансформации S2 клеток.
2. Работа с дрожжами.
3. Работа с клетками. Трансформация S2 клеток. 56
РНК интерференция. 56
4. Работа с ДНК. 56
Приготовление компетентных клеток. 56
Трансформация бактерий. 57
Щелочное выделение плазмидной ДНК. 57
Обработка ДНКрестриктазами. 5 7
Лигирование. 57
Выделение геномной ДНК из мух 58
Гель-электрофорез ДНК. 5 8
РСД. 58
Секвенирование ДНК. 59
5. Работа с РНК. 59
Получение двухцепочечной РНК. 59
Выделение РНК. 59 RT-PCR. 59
Нозери-блот анализ. 60
6. Работа с белками. 61
Экспрессия и очистка рекомбипантных белков . 61
Связывание белков на глютатион-сефарозе. 61
Получение антител и их очистка. 62
Белковый гель-электрофорез. 62
Вестерн-блот анализ 63
Соосаждение белков антителами. 63
Дот-блот анализ. 63
7. Иммуноокрашивание. 64
Иммуноокрашивание политенных хромосом. 64
Иммуноокраишвание S2 клеток. 65
8. Гибридизация in situ. 66
РНК in situ гибридизация с СуЗ-oligo-dT праймером. 66
ДНК in situ гибридизация с зондом к индивидуальному гену. 66
9. Электронная микроскопия. 67
10. Анализ изображений. 68
11. Хроматиниммунопреципитация. 68
12. Использованное программное обеспечение. 69
III. Результаты.
- Структурная организация GCN5 и PCAF белков и их функции
- Транскрипционно активные гены на периферии ядра
- Конструкции для экспрессии рекомбинантных белков
- Экспрессия и очистка рекомбипантных белков
Введение к работе
Одной из фундаментальных задач современной науки является изучение принципов организации и функционирования живых систем. Неотъемлемое свойство живых организмов* - способность хранить и передавать потомкам і наследственную информацию. Таким образом, изучение механизмов реализации наследственной информации имеет фундаментальное значение для понимания феномена жизни. Помимо фундаментального значения, исследования в данной области имеют обширное практическое применение в медицине, фармакологии, биотехнологии, селекции. В настоящее время молекулярные механизмы реализации наследственной информации активно изучаются с помощью методов молекулярной биологии и генетики.
Носителями наследственной информации являются гены, а процесс ее реализации называется экспрессией генов. Экспрессия генов представляет собой сложный многостадийный процесс. Он включает следующие этапы: транскрипцию и процессинг мРНК в ядре, экспорт мРНК из ядра в цитоплазму через ядерные поры, трансляцию в цитоплазме и, наконец, деградацию мРНК и белков. Хотя изначально эти процессы, рассматривались и изучались, как полностью независимые друг от друга, в последнее время становится понятным, что in vivo они тесным образом взаимосвязаны. Так транскрипция влияет на процессинг и экспорт мРНК, и наоборот: нарушения процессинга способны иметь негативный эффект на транскрипцию. Молекулярные механизмы, обеспечивающие такую координацию различных стадий экспрессии генов друг с другом, еще очень слабо изучены.
Транскрипция является ключевым этапом экспрессии генов. Регуляция транскрипции обеспечивается при помощи чрезвычайно сложно устроенных клеточных систем, включающих цис-действующие элементы — разнообразные регуляторные элементы генома и транс-действующие элементы — многочисленные факторы транскрипции. Эукариотическая ДНК упакована в хроматин, который способен
находиться в различных состояниях^, отличающихся прежде всего степенью
компактизации: и транскрипционной- активностью. Поддержание и изменение структуры
хроматина является.важнейшими факторами, влияющими на экспрессию генов, так как
определяют степень доступности регуляторных элементов действию; транскрипционных
факторов. Одним' из факторов, регулирующих организацию хроматина, является
пространственное распределение хроматина в ядре; клетки, в частности, взаимодействие
хроматина с белками, ассоциированными с ядерной оболочкой. Также в формировании
раздельных функциональных доменов хроматина; принимают участие регуляторные
элементы, называемые инсуляторами. Одно из свойств инсулятора состоит в способности
препятствовать распространению гетерохроматина на близлежащие эухроматиновые
области. В клетке имеется ряд комплексов, способных изменять структуру хроматина и,
таким образом, регулировать транскрипцию, к ним относятся и комплексы^
осуществляющие различные химические модификации гистонов. Активная транскрипция»
связана с ацетилированием гистонов, которое осуществляется г
гистонацетилтрансферазными комплексами: "
В настоящее время-, большое количество исследований посвящено изучению транскрипционных факторов и принципов их работы. Конечной целью является* понимание работы молекулярного аппарата транскрипции.
Ранее в нашей лаборатории был впервые описан новый коактиватор транскрипции эволюционно консервативный белок Е(у)2. Было предположено, что Е(у)2 вовлечен в регуляцию; транскрипции большого числа генов в ходе развития дрозофилы. Было показано, что; Е(у)2 коактивирует транскрипцию* на хроматиновой матрице и входит в состав многосубъединичного комплекса; содержащего белок TAF9:
Целью данной работы являлось изучение функций Е(у)2. Было показано, что Е(у)2: входит в состав SAGA/TFTC гистонацетилтрансферазного комплекса дрозофилы, являясь новым, ранее- не описанным компонентом этого комплекса. Кроме того, Е(у)2
10 взаимодействует с белком Xmas-2 и вместе с ним входит с состав нового
ассоциированного с ядерной порой комплекса, который участвует в организации экспорта
мРНК. На модели кластера SAGA/TFTC-зависимых генов теплового шока hsp70 мы
показали, что Е(у)2 является белком, координирующим транскрипцию hsp70 генов, их
прикрепление к NPC и экспорт мРНК. Таким образом, впервые в многоклеточном
организме был описан белок, осуществляющий физическую связь между транскрипцией
генетического локуса, его внутриядерным положением и экспортом его транскриптов.
Также впервые было показано, что Е(у)2 связывается с белком Su(Hw) и является
белковым компонентом Su(Hw)-3aBHCHMbix инсуляторов МДГ-4 и 1А2. Е(у)2 необходим
для барьерной активности данных инсуляторов. Полученные результаты позволили
предложить модель работы 8и(Н\у)-зависимых инсуляторов как барьерных элементов.
Таким образом, в данной работе сделан шаг в понимании функций инсуляторов и,
следовательно, в развитие представлений о механизмах функциональной организации
хроматина.
В целом, проведенное исследование вносит вклад в понимание функций Е(у)2 и,
следовательно, в общую картину организации экспрессии генов.
11 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
GcnS-содержащие комплексы у многоклеточных.
Транскрипция и ацетилирование.
Транскрипция у эукариот - сложный многостадийный процесс, подверженный
строгой регуляции. Для того, чтобы обеспечить точную инициацию транскрипции РНК-
полимеразой П, необходим доступ к конкретному генетическому локусу ген-
специфических активаторов, нескольких различных кофакторов и общих факторов
транскрипции. То, каким образом активируется транскрипция генов, организованных в
хроматин, представляется важным вопросом в изучении эукариотической транскрипции.
Было показано, что.определенные посттрансляционные модификации гистонов нуклеосом
коррелируют с тем или иным транскрипционным состоянием хроматина: активацией или
репрессией (30,80). Одна из наиболее интенсивно изучаемых модификаций -
ацетилирование аминокислот высококонсервативных N-концов гистонов. Постоянный
уровень ацетилирования гистоновых белков поддерживается работой
гистонацетилтрансфераз (HATs) и гистондеацетилаз (HDACs) (30,80,107). Различные
HATs модифицируют е-аминогруппу лизина или аргинина, используя acetyl coenzyme А в
качестве коэнзима. Ацетилирование влияет на формирование более
высокоорганизованных хроматиновых структур и регулирует гистон-белковые взаимодействия (139,154,159). Таким образом, действие HATs увеличивает афинность транскрипционных факторов к нуклеосомной ДНК (147).
Первая гистон-специфическая ацетилтрансфераза; р55, была выделена из Tetrahymena. Было показано, что р55 является гомологом дрожжевого белка GCN5-(General Control Nonderepressive 5), транскрипционного адаптера, и, таким образом, р55 стал первым обнаруженным белком, связавшим ацетилирование гистонов и активацию транскрипции (12). С тех пор было найдено большое количество HATs. HATs можно
Структурная организация GCN5 и PCAF белков и их функции
Семейство GNAT ацетилтрансфераз включает более 10000 представителей среди различных организмов. GCN5 гомологи у многоклеточных отличаются от GCN5 белка дрожжей наличием длинного N-концевого участка (12,142,162,164). В то время как большинство геномов содержит одну копию gcn5 гена, позвоночные имеют второй ген, кодирующий PCAF (рЗОО/СВР associated factor), степень гомологии которого с GCN5 составляет приблизительно 73% (Рис.1) (164). У всех известных гомологов GCN5 многоклеточных могут быть выделены два участка: N-концевой, который является специфическим для многоклеточных и С-концевой, который высокогомологичен короткому дрожжевому белку. N-концевая часть содержит так называемый PCAF homology домен, а С-концевая часть состоит из двух консервативных доменов: ацетилтрансферазного домена (AT) и бромодомена (147).
Была определена структура AT домена белка GCN5 Tetrahymena, связанного со своими лигандами: коэнзимом А (СоА) и гистоном НЗ (125). Эта структура вместе со структурой AT домена PCAF выявила (22), что центральная коровая область AT домена участвует в связывании СоА и является основой для каталитической реакции, a N- и С 13 концевые участки AT домена содержат структуру, которая, по-видимому, ответственна за специфичность к гистоновому субстрату (97). GCN5 и PCAF обладают широкой субстратной специфичностью, но основными мишенями для ацетилирования являются гистоны и нуклеосомы. Нуклеосома представляет собой структурную единицу хроматина. Основная часть нуклеосомы образована гистоновым! октамером, содержащем по две копии гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4, и участком ДНК в 147 пар оснований, закрученным вокруг октамера. В экспериментах со свободным гистонами рекомбинантные GCN5 и PCAF преимущественно ацетилировали К14 гистона НЗ, и в меньшей степени, К8 и К16 гистонаН4 (58,85,131). Бромодомен состоит из приблизительно 110 аминокислот и играет роль во многих клеточных процессах, как связанных с хроматином, так и нет. Бромодомены имеются у многих известных ядерных HATs, которые осуществляют ассоциированное с транскрипцией ацетилирование гистонов по определенным остаткам лизина, но отсутствуют у цитоплазматических HATs. Принято считать, что бромодомены распознают ацетилированные хвосты гистонов и таким образом участвуют в ремоделировании хроматина. Структурные исследования бромодоменов yGCN5 и hPCAF в. комплексе с пептидами гистоновых хвостов показали, что бромодомен GCN5 связывается с гистоном Н4, ацетилированным по 16 остатку лизина (71,109), а бромодомен PCAF распознает гистон Н4, ацетилированный по К8 и гистон НЗ, ацетилированный по К14 (26). Интересно то, что механизм распознавания ацетилированных лизинов бромодоменом схож с механизмом распознавания ацетил-СоА AT доменом. Было показано, что эти HATs связываются посредством бромодоменов с теми же ацетилированными аминокислотными остатками гистонов, которые они сами же ацетилируют. Отсюда возникает вопрос: каким образом происходит ацетилирование?
Один из возможных ответов следующий: на хроматиновой матрице GCN5- или PCAF содержащий комплекс сначала ацетилирует нужный сайт, не связываясь с ним, а затем і другой комплекс распознает и связывает эту модификацию и далее ацетилирует второй сайт. Этот второй сайт может находиться на N-конце другого гистона. В этом отношении интересно Отметить, что в дрожжевом SPT-ADA-GCN5 ацетилтрансферазном комплексе (SAGA) имеется два белка, содержащие бромодомен (GCN5 и SPT7), из которых только бромодомен GCN5 необходим для связывания комплекса с ацетилированным хроматином in vitro (26,65,66). При этом в соответствующем комплексе у человека только GCN5 имеет бромодомен, a hSPT7L не содержит такого участка (25,144). Анализ GCN5 мутантов in vivo показал, что в то время как PCAF homology домен и HAT домен необходимы для функционирования белка dGCN5, бромодомен, по-видимому, для этого не требуется (17). Эти данные указывают на то, что бромодомен dGCN5 может быть не единственным доменом, необходимым для посадки ССШ-содержащих комплексов на ацетилированные гистоны.
Было показано, что PCAF обладает ЕЗ убиквитин-лигазной активностью и участвует в регуляции уровня белка р53 в клетке (92). ЕЗ убиквитин-лигазная активность локализуется в PCAF homology домене белка. Следовательно, PCAF является не только ацетилтрансферазой, но и фактором убиквитинилирования с присущей ему ЕЗ лигазной активностью, что говорит о функциональной взаимосвязи между процессами ацетилирования и убиквитинилирования в клетке (16). Неизвестно, обладает ли GCN5 ЕЗ лигазной активностью, имея относительно консервативный PCAF homology домен, специфичность ЕЗ лигазной активности PCAF и GCN5 также еще предстоит определить.
Транскрипционно активные гены на периферии ядра
Несмотря на данные, говорящие о нахождении репрессированных генов на периферии ядра, в последнее время появляются свидетельства того, что ассоциация активированных индуцируемых генов с ядерными порами образует еще один функциональный компартмент на периферии ядра. У дрожжей количественный анализ внтуриядерного расположения нескольких индуцируемых генов, а именно INOl (inositol 1 -phosphate); НХК1 (hexokinase isoenzyme 1), GAL1, GAL2, HSP104 (heat shock protein 104) при помощи LacO/LacI системы подтвердил, что после активации эти гены стабильно позиционируются вблизи ядерной оболочки (1,10,11,13,19,20,27,152). Для некоторых локусов сравнительным анализом положения гена и количественного уровня мРНК было показано, что максимальная экспрессия наблюдается при стабильном связывании гена с ядерной порой (11,19,152).
Хотя элементы, необходимые для перемещения генов на периферию ядра, ген-специфичны, удалось выявить общие закономерности в позиционировании генов (3). Одна из них состоит в том, что определяющим для стабильного связывания гена с NPC является, наличие специфических промоторных последовательностей и активаторов. Так, репортерная конструкция, содержащая промотор GAL1, сохраняла способность перемещаться к ядерным порам (1). Из двух способов активации гена НХК1 только один (индукция низким содержанием глюкозы) приводит к ассоциации с NPC (152). Таким образом, само по себе наличие транскрипта недостаточно для связывания гена с NPC, і необходимы промоторные последовательности. Однако и наличие промоторов не является достаточным условием. В случае гена GAL2 последовательность UAS и промотор были достаточны для обеспечения локализации гена с ядерными порами (27), а в случае генов МО, и GAL1 перемещение на периферию ядра происходило независимо от элонгации транскрипции (10). При этом сам по себе UAS гена GAL1 был недостаточен, требовалось также наличие специфического 3 UTR. Аналогично, стабильное связывание гена НХК1 с NPC зависело от присутствия его 3 UTR (152). Было предположено, что различия в требовании наличия 3 UTR для локализации генов с ядерной порой связаны с различиями в силе взаимодействий между ассоциированными с промоторами факторами и NPC. В случаях сильного взаимодействия достаточно промотора и участие 3 UTR не требуется, другие промоторы требуют присутствия 3 UTR (3). То, каким образом перемещение генов к ядерным порам влияет на уровень экспрессии, еще не понятно. Для некоторых генов увеличение уровня транскриптов может быть результатом стабильного связывания генов с NPC (11,152), для других такое влияние незначительно (1,13,27). Так, было показано, что активация гена INOJ у S.cerevisiae происходит вблизи ядерной мембраны. В этом случае, как активация транскрипции, так и перемещение гена зависело от белка Scs2 - интегрального белка ядерной мембраны. При искусственном прикреплении IN01 локуса к периферии ядра активация происходит в отсутствии Scs2, для GAL1 искусственное прикрепление приводит к более быстрой реиндукции транскрипции (10,11). В другой работе меченый НХК1 ген перемещался из теломерного кластера к ядерной поре после активации транскрипции низким содержанием глюкозы (132,152). Когда связывание локуса с NPC предотвращалось посадкой вирусного трансактиватора на 5 -область гена, уровень НХК1 транскрипта снижался в два раза (152). Так же, как и для IN01 (10,11), индукция НХК1 становилась в два раза эффективнее после прикрепления гена к ядерной оболочке посредством субдомена белка Escl. Эти результаты свидетельствуют о том, что ассоциация генов с NPC действительно может регулировать уровень экспрессии. Полагают, что такое прикрепление может облегчать доступ новосинтезированных транскриптов к ядерным порам. Тем не менее, BJ случае с другими индуцируемыми генами мутации, приводящие к нарушению связывания с ядерными порами, не оказывали значительного влияния на уровни соответствующих мРНК (1,13,27). Такую вариабельность можно объяснить различиями в хроматиновом окружении репортерных генов или в силе промоторов. Было показано, что у D.melanogaster прикрепление геновк ядерным порам также играет роль в усилении экспрессии определенных генов, а именно, генов, подверженных дозовой компенсации (102). В ходе дозовой компенсации у самцов D.melanogaster транскрипция генов, находящихся на Х-хромосоме, возрастает в два раза по сравнению с самками. Этот процесс зависит от Rox РНК и MSL комплекса, состоящего из белков MSL1, MSL2, MSL3 и MOF гистон ацетилтрансферазы. В результате очистки MSL белков» были выделены компоненты NPC MTOR (Megator) HNUP153, а также составляющие экзосомы DIS3 и RRP6. Хотя эти белки присутствовали в субстихиометрических количествах, их нокаут при помощи РНК-интерференции проводил к нарушению паттерна связывания MSL белков с Х-хромосомой и влиял на дозовую компенсацию ряда генов X хромосомы (102). Так как MTOR является функциональным гомологом дрожжевого белка Мірі, можно провести параллель между взаимодействием MTOR с MSL белками и взаимодействием между Мехб7р и Мірі в дрожжах (20,27).
Конструкции для экспрессии рекомбинантных белков
Ранее в генетической; системе І с активированным мобильным элементом Stalker в присутствии аллеля yellow2 был обнаружен ряд мутаций; названных e(y)bf 1 {enhancer of yellow, N — номер мутации); благодаря их способности;усиливать, фенотип указанного yellow2 аллеля (42). Все найденные мутации связаны с генами, находящимися в X-хромосоме; Ген yellow отвечает за; окраску кутикульь у дрозофилы. Этот ген имеет сложную, систему- регуляции экспрессии: у него имеется четыре энхансера, действующих на разных: стадиях1 развития и в разных тканях. Мутация yellow2 связана со вставкой мобильного элемента МДГ-4 в регуляторную; область гена- yellow. Этот мобильный-элемент содержит инсулятор, блокирующиййдействие расположенных выше энхансеров, на промотор; гена; Мутация yellow2 имеет следующий фенотип у взрослых: мух: светлые (желтые) покровы .тела, темные (нормальные),щетинки: Щетинки сохраняют пигментацию, благодаря.тому, что соответствующий энхансер щетинок располагается в первом интроне гена yellow и не подвержен влиянию МДГ-4: Наличие мутации в каком-либо гене- e(y)N приводит к тому,. что и t щетинки лишаются, пигментации и становятся светлыми. Таким образом белковые продукты генов е(у) каким-то образом участвуют в, активированной; транскрипции гена yellow, запускаемой; с энхансера щетинок; Иными словами; кодируемые генами е(у) белки вовлечены в организацию взаимодействия; между энхансером и промотором: Интересно;, что- слабые мутации ( генов, не влияющие на выживаемость мух каждая по отдельности, в совокупности .являются, летальными, что указывает на, то, что кодируемые: е(у) генами белки выполняют перекрывающиеся функции (41).
Продукты всех трех генов е(у) были охарактеризованы. Ген е(у) 1 кодирует общий фактор транскрипции и коактиватор TAF9, входящий в состав комплексов TFIID и SAGA (143). Ген е(у)3 кодирует повсеместно экспрессирующийся ядерный белок размером более 2000 а.к., имеющий гомологов у других эукариот, и названный SAYP (Supporter of Activation of Yellow Protein). SAYP связывается со многими областями транскрипционно активного хроматина на политенных хромосомах и коактивирует транскрипцию эухроматиновых генов. SAYP также в большом- количестве присутствует в гетерохроматине 4-ой хромосомы и хромоцентре и репрессирует транскрипцию: эухроматиновых генов, перемещенных в гетерохроматин. То есть SAYP играет двоякую роль в регуляции транскрипции в эухроматине и гетерохроматине (138). Объектом изучения в данной работе является белковый продукт гена е(у)2 — белок Е(у)2. Е(у)2 представляет собой эволюционно консервативный белок размером в 101 ак, не содержащий известных структурных доменов. Е(у)2 экспрессируется на всех стадиях развития и во всех органах D.melanogaster. Е(у)2 локализуется преимущественно в ядре клетки и присутствует в большом количестве сайтов локализации на политенных хромосомах из клеток слюнных, желез D.melanogaster. Слабая мутация е(у)2" вызывает многочисленные фенотипические нарушения у мух (44) и усиливает фенотипические проявления слабых.мутаций, генов .yellow, white, cut и scute (41). Сильная мутация е(у)2 является летальной. Было предположено, что Е(у)2 вовлечен в регуляцию транскрипции большого і числа генов-в ходе развития дрозофилы. У человека также имеется гомолог е(у)2, кДНК которого присутствует в различных тканях организма. Предполагается, что гомолог Е(у)2 у человека участвует в регуляции широкого спектра генов (44). Был найден паралог е(у)2 — ген е(у)2Ъ, экспрессирующийся только в небольшой, группе половых клеток самцов. Оказалось, что е(у)2 является ретрокопией е(у)2Ъ, приобретшей общие функции, в то время как исходный ген стал узкоспецифичным! (83). Было показано, что Е(у)2 коактивирует транскрипцию на- хроматиновой матрице" и входит в состав многосубъединичного комплекса, содержащего белок TAF9 (Е(у)1) (44). TAF9 является субъединицей общего фактора транскрипции TFUD, а также входит в состав dSAGA/TFTC гистонацетилтрансферазного комплекса, участвующего в ремоделировании хроматина и инициации транскрипции ряда Pol П-зависимых генов (88,103,112). Позднее был найден дрожжевой гомолог Е(у)2 - белок Susl. Было показано, что Susl является компонентом транскрипционного SAGA комплекса дрожжей и ассоциированного с ядерной порой Sac3hpl-Cdc31 комплекса, участвующего в экспорте мРНК из ядра в цитоплазму (124). Susl необходим для перемещения активированных GAL генов к ядерным порам и эффективного экспорта их транскриптов (13).
С целью исследовать функции Е(у)2 в многоклеточном организме были поставлены следующие экспериментальные задачи: - провести поиск белков, взаимодействующих с белком Е(у)2, в дрожжевой двухгибридной системе; - охарактеризовать комплекс, содержащий белки Е(у)2 и TAF9; исследовать функции белка Е(у)2 на основе полученной информации о взаимодействующих с ним белках.
Экспрессия и очистка рекомбипантных белков
Полученные результаты свидетельствуют, что Е(у)2 является компонентом двух комплексов, играющих разные роли в клетке. Он входит в состав транскрипционного dSAGA/TFTC комплекса и нового ассоциированного с ядерной порой Xmas-2-содержащего комплекса (АМЕХ), осуществляющего экспорт мРНК. Данные о взаимодействии компонентов dSAGA/TFTC с NPC позволяли предположить, что Е(у)2 является фактором, обеспечивающем связь между экспортной машиной клетки и dSAGA/TFTC комплексом на промоторах транскрибирующихся генов. Было показано, что Е(у)2 вместе с другими субъединицами dSAGA/TFTC комплекса присутствует на хромосомных локусах, содержащих hsp70 гены, кодирующие белок теплового шока hsp70, как до, так и после активации транскрипции тепловым шоком. Удобным свойством генов hsp70 является то, что их транскрипцию можно индуцировать тепловым воздействием на клетку. Поэтому кластер hsp70 генов представляет собой прекрасную модель для изучения функций Е(у)2. Было обнаружено, что нокаут Е(у)2 или Xmas-2 в результате РНК-интерференции приводит к нарушению преимущественно периферического расположения hsp70 локусов, накоплению hsp70 транскриптов в ядре и нарушению регуляции транскрипции. Все эти результаты в совокупности позволяют сделать вывод о том, что Е(у)2 в комплексе с Xmas-2 осуществляет прикрепление hsp70 локусов к ядерной поре, физически являясь связующим звеном между транскрипционным коактиватором dSAGA/TFTC и ассоциированными с ядерной порой экспортными факторами.
Представляются возможными два механизма взаимодействия между этими двумя комплексами: либо оба комплекса контактируют друг с другом на промоторе hsp70 гена, либо Е(у)2 рекрутируется на промотор dSAGA/TFTC комплексом, а затем Е(у)2 связывается с ассоциированным с NPC Xmas-2. Второй механизм находится в хорошем соответствии с тем фактом, что не весь расположенный на периферии ядра Е(у)2 101 ассоциирован с Xmas-2. Дальнейшие исследования должны подтвердить ту или иную модель. Е(у)2 координирует транскрипцию генов, прикрепление к NPC и экспорт мРНК.
Тот факт, что Е(у)2 обнаруживается на промоторах hsp70 генов еще до активации, находится в хорошем соответствии с нашим- наблюдением, что прикрепление hsp70 локусов к ядерной оболочке зависит от Е(у)2, но не зависит от транскрипционного состояния генов. Можно предположить, что внутриядерное положение каждого конкретного локуса определяется тем, присутствует ли Е(у)2 (и, возможно, Xmas-2) на промоторе гена до активации (как в случае промоторов hsp70 генов дрозофилы) или рекрутируется на него активатором. В согласии с этой моделью нокаут Е(у)2 и Xmas-2 в результате РНК-интерференции приводит к нарушению ассоциации hsp70 локусов с ядерной порой и их равномерному распределению внутри ядра как до, так и после активации транскрипции. Таким образом, Е(у)2 и Xmas-2 являются ключевыми факторами1 в организации динамического процесса, определяющего внутриядерное позиционирование и последующее транскрипционное состояние hsp70 генов и, вероятно, ряда других генов.
Было показано, что при падении уровня экспрессии Е(у)2 или Xmas-2 нарушаются транскрипция РНК-полимеразой П, расположение модельного гена относительно периферии ядра и экспорт мРНК. Хотя нокауты Е(у)2 и Xmas-2 сходным образом влияют на связывание hsp70 локусов с ядерной оболочкой, оказываемый ими эффект на транкрипцию hsp70 генов отличается: нокаут Е(у)2 приводит к более значительному уменьшению уровня транскрипции по сравнению с нокаутом Xmas-2 . Эти различия можно объяснить тем, что какое-то остаточное количество Xmas-2 по-прежнему функционирует в транскрипции, в отличие от Е(у)2, экспрессия которого при РНК-интерференции почти полностью блокируется. Интересно, что почти полное исчезновение 102 Е(у)2 приводит к снижению уровня транскрипции- только в два раза. Из этого можно сделать вьшод, что расположение hsp70 локусов на периферии ядра позитивно влияет на транскрипцию, но не является необходимым условием для нее. При этом периферическое положение hsp70 генов, по-видимому, есть необходимое условие для эффективного экспорта соответствующих транскриптов. Так как все эти процессы, по крайней мере, в случае hsp70 генов, по-видимому, являются пространственно и функционально связанными, определить, каким образом Е(у)2, SAGA/TFTCTH Xmas-2 влияют на каждый из них в отдельности, трудно.
У дрожжей.существует генетическое взаимодействие между компонентами Susl Sac3hpl -Cdc31 комплекса (АМЕХ) и і другого эволюционно консервативного TREX комплекса, участвующего, в экспорте мРНК: комбинации мутаций субъединиц этих комплексов приводят к летальному эффекту. Такой эффект можно объяснить тем, что TREX и АМЕХ комплексы играют роль в организации, параллельных процессов, координирующих транскрипцию и экспорт (34). Возможно также, что TREX и АМЕХ комплексы последовательно рекрутируются на одни HJ те же транскрипты, чтобы осуществить транспорт мРНК через ядерные поры. Показано, что TREX связывается с новосинтезированными мРНК котранскрипционно у дрожжей и в ходе сплайсинга в клетках человека. Поэтому можної предположить, что вначале TREX связывается с транскриптами hsp70 генов, а затем, привлекает на них Е(у)2-содержащий АМЕХ комплекс, который обеспечивает доступ транскриптов к экспортной машине клетки.
