Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
I. Ядерно-цитоплазматический транспорт белков 8
1. Введение 8
2. Ran-зависимый ядерно-цитоплазматический транспорт белков 9
2.1. Сигналы ядерно-цитоплазматического транспорта и транспортные факторы
10
2.1.1. Сигналы ядерной локализации и кариоферины-а 10
2.1.2. Сигналы ядерной локализации и импортины 12
2.1.3. Сигналы ядерного экспорта и экспортины 13
2.2. Строение ядерного порового комплекса, нуклеопорины 14
2.3. Модель Ran-зависимого транспорта 17
2.3.1. Ran, регуляторы Ran 18
2.3.2. Посадка комплекса кариоферин-а/импортин-|31/с№,8-белок на NPC... 19
2.3.3. Прохождение комплекса кариоферин-сс/импортин-р1/сЫЬ8-белок через центральный канал ядерной поры 20
2.3.4. Разборка комплекса кариоферин-а/импортин-рУсЫЬБ-белок 21
2.3.5. Перемещение белков из ядра в цитоплазму 22
2.3.6. Ran-связывающие белки 23
2.4. Транспорт белков внутренней ядерной мембраны 25
3. Ran-независимый ядерно-цитоплазматический транспорт белков 27
4. Регуляция ядерно-цитоплазматического транспорта 31
4.1. Регуляция транспорта за счёт модуляции взаимодействий
импортина/экспортина с сигналом NLS/NES субстрата 31
4.1.1. Маскирование сигналов NLS/NES субстрата от узнавания импортином/экспортином 31
4.1.1.1. Внутримолекулярное маскирование сигналов NLS/NES субстрата. 31
4.1.1.2. Межмолекулярное маскирование сигналов NLS/NES субстрата 33
4.1.2. Регуляция транспорта за счёт усиления связывания импотрина/экспортина с сигналом NLS/NES субстрата 35
4.1.3. Регуляция транспорта за счёт удержания в цитоплазме или в ядре 36
4.1.4. Регуляция транспорта за счёт котранспортировки и изменения субстрат-связывающих свойств кариоферина 37
4.2. Регуляция транспорта за счёт изменения состава импортинов и экспортинов 38
4.3. Регуляция транспорта за счёт изменения состава нуклеопоринов 39
II. Мультифункциональный ядерно-цитоплазматический белок YB-1 41
1. История открытия белков семейства YB-1 41
2. Структурно-функциональная организация YB-1 43
2.1. Домен холодового шока 45
2.2. С-концевой домен 46
3. Функции YB-1 в ядре 46
3.1. Участие YB-1 в регуляции транскрипции 46
3.2. Участие YB-1 в репликации и репарации ДНК 49
3.3. Участие YB-1 в сплайсинге 50
3.4. Участие YB-1 в разборке ядрышек 50
4. Функции YB-1 в цитоплазме 51
4.1. Участие YB-1 в трансляции 51
4.2. Участие YB-1 в упаковке мРНК 53
4.3. Участие YB-1 в регуляции стабильности мРНК 55
4.4. Участие YB-1 в локализации мРНК 56
4.5. Участие белков семейства YB-1 в процессинге мРНК 56
5. Ядерно-цитоплазматический транспорт YB-1 57
5.1. Сигнальные последовательности в молекуле YB-1 57
5.2. Механизм ядерно-цитоплазматического транспорта YB-1 58
5.3. Возможные механизмы регуляции ядерно-цитоплазматического транспорта YB-1 59
5.3.1. Регуляция транспорта YB-1 за счёт взаимодействия с мРНК 59
5.3.2. Тромбин стимулирует переход YB-1 в ядро в эндотелиальных клетках 60
5.3.3. Переход YB-1 в ядро в комплексе с другими белками 61
5.3.4. Фосфорилирование YB-1 может влиять на его ядерно-цитоплазматическое распределение 62
6. YB-Іирак 63
Заключение 65
Материалы и методы 66
1. Плазмидные конструкции 66
2. Выделение рекомбинантного YB-1 из Escherichia coli 67
3. Выделение мутантных форм YB-1 из Escherichia coli 68
4. Выделение YB-1-специфичной протеазы и 26S протеасомы из лизата ретикулоцитов кролика 69
5. Электрофорез белков в полиакрипамидном геле в присутствии SDS 70
6. Расщепление YB-1 20S протеасомой 71
7. Фосфорилирование YB-1 71
8. Определение киназ, фосфорилирующих YB-1, в SDS-полиакриламидном геле (ingel kinase assay) 72
9. Обработка препаратов YB-1 рибонуклеазами 72
10. Центрифугирование YB-1-протеазы в градиенте концентрации сахарозы 72
11. Иммунологический анализ белковых препаратов (иммуноблоттинг) 73
12. Культуры клеток. Получение клеточных, ядерных и цитоплазматических экстрактов и метаболическое мечение белков 74
13. Иммунопреципитация 76
14. Иммунофлуоресцентная микроскопия 76
15. Выделение плазмидной ДНК из Escherichia coli 77
16. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 78
17. Обработка плазмиды рестриктазами 78
18. Получение транскриптов РНК in vitro 79
19. Мечение РНК по 5'-концу и по кэп-структуре 79
20. Электрофорез нуклеиновых кислот в геле агарозы 80
21. Анализ изменения подвижности комплексов белок-РНК в геле 80
22. Бесклеточная система трансляции из ретикулоцитов кролика 80
23. Ультрафиолетовая перешивка YB-1 смРНК 81
Результаты
- Сигналы ядерной локализации и импортины
- Маскирование сигналов NLS/NES субстрата от узнавания импортином/экспортином
- Регуляция транспорта за счёт котранспортировки и изменения субстрат-связывающих свойств кариоферина
- Участие YB-1 в регуляции стабильности мРНК
Введение к работе
Пространственное разделение синтеза мРНК и трансляции позволило эукариотам достичь совершенной регуляции экспрессии генов. Такое разграничение двух основополагающих клеточных процессов привело к формированию очень сложного механизма транспортировки макромолекул через ядерную мембрану. Упрощённо, ядерно-цитоплазматический транспорт сводится к тому, что ядерные белки импортируются в ядро, а РНК экспортируется в цитоплазму. На самом деле, транспорт и белков и РНК через ядерную мембрану может быть двунаправленным, и, в последние годы, список белков, постоянно перемещающихся между цитоплазмой и ядром, существенно расширился. Создаётся впечатление, что именно такие ядерно-цитоплазматические «белки-челноки» являются ключевыми звеньями в передаче информации между двумя основными компартментами клетки. Первые свидетельства, указывающие на возможность перемещения белков между цитоплазмой и ядром, были получены в 1950-х годах (Goldstein, 1958). Тем не менее, потребовалось ещё около 30 лет пока был идентифицирован первый «белок-челнок» - нуклеолин (Borer et al, 1989). К настоящему времени список белков, перемещающихся между цитоплазмой и ядром, включает транспортные рецепторы и адаптеры (Gorlich and Kutay, 1999; Nakielny and Dreyfuss, 1999), рецепторы стероидных гормонов (Hache et al, 1999), факторы транскрипции (Cartwright and Helin, 2000), регуляторы клеточного цикла (Pines, 1999; Yang and Kornbluth, 1999) и множество РНК-связывающих белков (Nakielny and Dreyfuss, 1999; Shyu and Wilkinson, 2000).
Y-бокс связьшающий белок 1 (YB-1) - это внутриклеточный ядерно-цитоплазматический белок млекопитающих с молекулярной массой около 36 кДа. YB-1 - белок мультифункциональный, его участие в широком спектре внутриклеточных процессов объясняется прежде всего достаточно уникальной способностью взаимодействовать как с ДНК, так и с РНК, а также связываться с большим числом других клеточных белков (Kohno et al, 2003). Взаимодействуя с определенными регуляторными последовательностями в ДНК, в том числе с участками, содержащими Y-боксы в промоторах и энхансерах генов, YB-1 позитивно или негативно влияет на экспрессию ряда важнейших клеточных генов (Kohno et al, 2003). Среди них гены факторов роста, гены, участвующие в делении
клеток, апоптозе, иммунном ответе, развитии множественной лекарственной устойчивости, стрессовых ответах, регуляции опухолевого роста, а также ряд вирусных генов. YB-1 обладает повышенным сродством к участкам ДНК с поврежденной вторичной структурой и способствует процессу их репарации, а ускоряя обмен комплементарных нуклеотидных последовательностей в двойных спиралях, он, как предполагается, может участвовать в рекомбинации ДНК (Ise et al, 1999; Skabkin et al, 2001). Имеются данные о вовлечении YB-1 и в процесс репликации ДНК (Levenson et al, 2000). Одним словом, YB-1, по-видимому, играет роль практически во всех ДНК-зависимых процессах. В ходе синтеза мРНК, YB-1 связывается с их предшественниками ещё на хромосомах и потом сопровождает молекулы мРНК на протяжении всей их жизни (Kohno et al, 2003). В клеточном ядре белок участвует в альтернативном сплайсинге предшественников мРНК (Chansky et al, 2001). В цитоплазме подавляющая часть YB-1 может находиться в ассоциации с транслируемыми и нетранслируемыми мРНК, определяя их функциональную активность, стабильность, а также локализацию трансляционно активных мРНК на актиновом скелете (Davydova et al, 1997; Evdokimova et al, 2001; Ruzanov et al, 1999).
Участие YB-1 в таком широком спектре клеточных процессов позволило прийти к выводу, что характер действия YB-1 на клеточные процессы зависит не только от его содержания в клетке, но также и от его распределения между ядром и цитоплазмой, которое должно строго регулироваться. Если общие механизмы ядерно-цитоплазматического транспорта белков изучены достаточно детально, то информация о транспортировке YB-1 скудна и никогда не обобщалась. В связи с этим, нам показалось очень важным и интересным проанализировать известные механизмы регуляции ядерно-цитоплазматического транспорта белков, включая данные об YB-1 по этой теме.
Сигналы ядерной локализации и импортины
Большинство импортинов связывают субстраты напрямую, без участия кариоферинов-а (Fried and Kutay, 2003; Weis, 2003). Часто сигналы ядерной локализации, узнаваемые импортинами, очень трудно определить. В некоторых случаях NLS содержат несколько положительно заряженных аминокислотных остатков, как было показано для коровых гистонов (Н2А, Н2В, НЗ, Н4) (Mosammaparast et al, 2002b; Mosammaparast et al, 2001; Muhlhausser et al, 2001) и рибосомальных белков (rpS7, rpL5, rpL23a) (Jakel and Gorlich, 1998). Аргинин-глицин богатые NLS были обнаружены в некоторых РНК-связывающих белках (Npl3p, Noplp, Soflp) (Leslie et al, 2004; Senger et al, 1998). В других случаях, NLS является относительно большим; так NLS М9 у hnRNP Al состоит из 38 остатков, обогащен глицином и содержит незначительное число положительно заряженных остатков (Pollard et al, 1996). В некоторых случаях в качестве NLS определяется очень протяжённый сегмент молекулы белка, что указывает на критичность пространственной укладки всей молекулы для узнавания импортинами-Р (Rosenblume/a/., 1998).
Как видно, NLS весьма разнообразны, поэтому их определение осложнено и зачастую требует анализа пространственной структуры комплекса импортин/NLS-белок. Структурные исследования импортина-рі с фрагментами его различных субстратов (кариоферин-а, SREBP-2, РТНгР) показали, что в каждом отдельном случае в формирование комплекса задействованы разные контакты (Cingolani et al, 2002; Cingolani et al, 1999; Lee et al, 2003). Из этих же исследований видно, что кариоферины-Р способны принимать несколько различных конформаций, подстраиваясь под определенный субстрат - это объясняет, как ограниченное число импортинов может переносить огромное число субстратов часто без сходств в последовательности NLS.
Экспортины также узнают специальные сигналы - сигналы экспорта из ядра (Fried and Kutay, 2003; Weis, 2003). Самым распространенным и охарактеризованным является гидрофобный (лейцин-богатый) NES. Это неконсервативный мотив, содержащий 3 или 4 гидрофобных остатка (например, LPPLERLTL83 у белка HIV Rev) (Fischer et al, 1995). Гидрофобный NES встречается у всех эукариот. Идентифицировано, по крайней мере, 15 белков, содержащих NES такого типа (la Cour et al, 2003). Гидрофобные NES обнаруживаются у многих факторов транскрипции и регуляторов клеточного цикла, у белка Rev HIV и у ингибитора протеинкиназы А, в которых впервые был обнаружен гидрофобный NES (Fischer et al, 1995; Wen et al, 1995). Эти NES распознаются экспортином Crml. Так же как и импортин-рі, Crml способен перемещать несколько субстратов без участия или с участием адаптерных белков (Johnson et al, 2002; Ohno et al, 2000; Paraskeva et al, 1999). Экспортироваться из ядра могут также белки, лишенные гидрофобных NES. В экспорте этих белков принимают участие специфичные экспортины. Например, белки Pho4 и Migl без гидрофобных аминокислот в NES экспортируются при помощи кариоферина Msn5p (Hood and Silver, 1999; Komeili and O Shea, 1999). В этом случае транспорт сопряжен с фосфорилированием субстрата, из чего можно заключить, что сайт фосфорилирования может входить в NES, или фосфорилирование может влиять на узнавание NES экспортином (Kaffman and O Shea, 1999; Mosammaparast and Pemberton, 2004).
Стоит выделить экспортин CAS (Cselp), который в комплексе с RanGTP транспортирует из ядра в цитоплазму кариоферин-сс, обеспечивая, таким образом, рециркуляцию этого фактора.
Помимо белков, из ядра экспортируются несколько типов РНК (Lei and Silver, 2002). За их транспортировку отвечают, по крайней мере, два экспортина. Это экспортин, обеспечивающий транспорт тРНК и узнающий часть её структуры в качестве сигнала экспорта из ядра (NES), и экспортин 5, транспортирующий тРНК и предшественники микроРНК в цитоплазму, принимая шпилечную структуру РНК с выступающим 3 -концом за NES (Kim, 2004; Zeng and Cullen, 2004). В транспорте большинства мРНК кариоферины не участвуют, их роль вьшолняют белки семейства TAP/NFX (Lei and Silver, 2002).
Для того, чтобы ответить какие белки формируют ядерный поровый комплекс (NPC) были подробно изучены несколько систем из Saccharomyces cerevisiae, Xenopus laevis и млекопитающих. Реконструкция структуры NPC из данных электронной микроскопии высокого разрешения выявила, что архитектура всех NPC высоко консервативна. NPC имеет 8-лучевую симметрию перпендикулярно мембране и асимметричен относительно плоскости мембраны (Akey and Radermacher, 1993; Hinshaw et al, 1992; Stoffler et al, 1999; Yang et al, 1998). Упрощённо комплекс состоит из трёх подструктур: (1) цитоплазматических фибрилл, (2) центрального кора и (3) ядерной сетки (рисунок 3).
Маскирование сигналов NLS/NES субстрата от узнавания импортином/экспортином
Внутримолекулярное маскирование заключается в том, что при внесении заряда или конформационных изменений в NLS/NES-содержащей области белка доступ кариоферина к NLS/NES сигналу пропадает (рисунок 6).
р50 субъединица димерного транскрипционного фактора NF-кВ (nuclear factor kappa В) синтезируется в виде предшественника рЮ5, в котором NLS, узнаваемый комплексом кариоферин-а/импортин-р 1, маскирован и недоступен. При иммунном ответе р105 специфично фосфорилируется и его С-концевая часть подвергается деградации. В результате такого процессинга до р50 NLS становится доступным для узнавания кариоферином-а/импортином-рі, и NF-кВ может перемещаться в ядро (рисунок 6А) (Riviere et al., 1991). Сходный механизм показан для белка INI1 (integrase interactor 1) из комплекса SNF5 ремоделирования хроматина человека: С-конец этого белка маскирует NES, узнаваемый Crml, и предотвращает его экспорт из ядра (Craig et al, 2002).
Внутримолекулярное маскирование может быть вызвано фосфорилированием в непосредственной близости от сигналов NLS/NES или внутри них. Белок NF-AT2 (nuclear factor of activated T cell 2) содержит два NLS, взаимодействие импортина с которыми зависит от фосфорилирования белка. При низком содержании Са+2 в клетке фосфорилируются аминокислотные остатки в обоих сигналах, что приводит к ингибированию импорта NF-AT2 в ядро. При повышении Са+2 фосфатаза кальциневрин (calcineurin) дефосфорилирует сигналы и NF-AT2 перемещается в ядро (Beals et al, 1997). Аналогично, при высоком содержании фосфатов в клетке циклин-зависимьгй киназный комплекс Pho80-Pho85 фосфорилирует фактор транскрипции Pho4 по Ser вблизи NLS, что предотвращает взаимодействие с импортином-рз (КарШ/Psel) и, как следствие, запрещает переход фактора в ядро (рисунок 6Б) (Kaffman et al, 1998).
Сходные механизмы показаны и для регуляции экспорта: в условиях осмотического стресса происходит фосфорилирование белка Hoglp (high osmolality glycerol pathway-signaling protein) киназой Pbs2p no Thr174 и Туг176, что делает NES недоступным для связывания с экспортном 1 (Xpolp) и приводит к ингибированию транспорта Hoglp из ядра (рисунок 6В) (Ferrigno et al, 1998).
К маскированию NLS/NES могут приводить конформационные изменения из-за образования дисульфидных связей между цистеиновыми остатками. Так в условиях окислительного стресса, у транскрипционного фактора Yaplp наблюдается формирование дисульфидной связи между Cys598 и Cys620, что делает его NES недоступным для взаимодействия с экспортином Crml (рисунок 6Г) (Kuge et al, 2001). Сходный механизм регуляции перемещения показан и для транскрипционного фактора Papl (Kudo et al, 1999). Межмолекулярное маскирование заключается в том, что к нарушению взаимодействий HMnopTHH-NLS/3KcnopTHH-NES приводит связывание NLS/NES-содержащего белка с другим белком или нуклеиновой кислотой (рисунок 7).
При высоком содержании Са+ Са+2-зависимая фосфатаза кальциневрин связывается с транскрипционньш фактором NF-AT4, маскирует его NES от взаимодействия с Crml, что предотвращает экспорт фактора из ядра. При низком содержании Са кальциневрин диссоциирует от NF-AT4 и демаскирует его NES (рисунок 7А) (Zhu and McKeon, 1999). Сходный механизм регуляции перехода в ядро показан для р65 субъединицы NF-кВ: её NLS маскируется от взаимодействия с комплексом кариоферин-а/импортин-Р 1 специфичным ингибитором 1-кВ (Beg et al, 1992). При иммунном ответе I-кВ фосфорилируется, что стимулирует его убиквитинилирование и последующую деградацию под действием протеасомы. Это приводит к демаскированию NLS сигнала на р65 и переходу NF-кВ В ядро (рисунок 7Б) (Traenckner et al, 1994). Подобно I-кВ может функционировать BRCA1-связывающий белок BRAP2: он взаимодействует с NLS не только BRCA, но и с NLS большого Т антигена вируса SV40 (Li et al, 1998), но влияние этих взаимодействий на импорт не было продемонстрировано, и роль этих взаимодействий в регуляции ядерного транспорта пока неизвестна.
Ядерная локализации супрессора опухолей р53 регулируется несколькими механизмами. Один из них связан с фосфорилированием Ser1520 в р53, вызываемым повреждением ДНК. Это приводит к маскированию NES1. Другой механизм заключается в тетрамеризации белка р53 в ядре в ответ на повреждения ДНК: у тетрамерного р53 маскируются NES2. Диссоциация такого тетрамера необходима для экспорта белка из ядра (Stommel et al, 1999).
Связывание лиганда также может приводить к маскированию NES/NLS, как было продемонстрировано для рецептора андрогена, у которого NES лежит в лиганд-связывающем домене (Saporita et al, 2003). В присутствии лиганда (андрогена) NES маскирован и не способен узнаваться Crml. Перемещение рецептора происходит лишь после диссоциации андрогена (рисунок 7В).
Межмолекулярное маскирование сигналов локализации может происходить при связывании белка с РНК или ДНК. Примером может служить белок Rev вируса HIV-1. Этот белок участвует в транспортировке мРНК HIV-1 из ядра в цитоплазму. При связывании мРНК с аргинин-богатым мотивом Rev, его NLS теряет способность взаимодействовать с импортином-Р 1. Переход Rev из цитоплазмы в ядро становится возможным лишь после освобождения в цитоплазме от перенесенной им мРНК (рисунок 7Г) (Fineberg et al., 2003).
Транскрипционный фактор дрожжей GAL4 (Chan and Jans, 1999; Chan and Jans, 2001) и человеческий фактор ремоделирования хроматина SRY содержат NLS сигналы, которые перекрываются с их ДНК-связьшающими доменами. Понятно, что при попадании в ядро связывание с ДНК приводит к диссоциации белков из комплекса с импортином-рі. Физиологическое значение этого механизма может сводиться к Ran-независимому высвобождению транспортируемого белка в ядре в условиях, когда RanGTP лимитирован или когда активность Ran заингибирована цитозольным Са+2 (Argentaro et al, 2003). Таким же способом при связывании с ДНК STAT1 диссоциирует из комплекса с кариоферином-а/импортином-р 1 (McBride et al, 2002).
Регуляция транспорта за счёт котранспортировки и изменения субстрат-связывающих свойств кариоферина
Как уже упоминалось выше, разные кариоферины вовлечены в импорт или экспорт белков, и лишь некоторые работают в обоих направлениях (Harel and Forbes, 2004; Mosammaparast and Pemberton, 2004; Weis, 2003). Немногочисленное семейство кариоферинов обеспечивает транспортировку по крайней мере 1500 белков. Это свидетельствует о том, что каждый кариоферин способен связывать большое количество различных субстратов. На сегодняшний день наличие специфичных пар субстрат-кариоферин известно только приблизительно для 40 субстратов, более того, не все сигналы NLS/NES известны или точно идентифицированы (Harel and Forbes, 2004; Mosammaparast and Pemberton, 2004; Weis, 2003). Для некоторых белков показано, что они транспортируются в комплексе с другими белками, который формируется сразу после синтеза, до связывания с кариоферином (Leslie et al, 2004; Mosammaparast et al, 2002a; Mosammaparast et al., 2002b; Mosammaparast et al., 2001; Titov and Blobel, 1999; Yoshida and Blobel, 2001). Также возможно одновременное связывание кариоферинов с несколькими разными субстратами, что может говорить о котранспортировке их одним кариоферином.
Иногда регуляция клеточных процессов требует точного соотношения белков или одновременной доставки белков в определенное место ядра или цитоплазмы. Такая координированная регуляция транспортировки может достигаться за счёт одновременного перехода на одном и том же кариоферине двух или более разных белков. Транспортировка такого типа описана для гистонов Н2А, Н2В и их шаперона Naplp с помощью кариоферина Кар114р (Mosammaparast et al., 2002а; Mosammaparast et al., 2001). Для кариоферина Кар114р показано, что он содержит перекрывающиеся субстрат-связывающие сайты для четырёх разных субстратов: гистонов Н2А и Н2В, Sua7p и Naplp; а также для партнёров по транспортировке: RanGTP и нуклеопоринов (Hodges et al, 2005). Поскольку не удавалось получить комплексы кариоферина Кар114р одновременно с гистонами Н2А/Н2В и Sua7p, было предположено, что эти белки имеют перекрывающиеся сайты связывания на кариоферине. С другой стороны, Sua7p способен связываться с кариоферином одновременно с Naplp. Значит, их сайты не перекрываются. Вместе с тем, удалось получить стабильные комплексы Кар114р одновременно с гистонами Н2А/Н2В и Sua7p в присутствии Kapll4p/Naplp/Sua7p в качестве затравки для сборки. Предполагается, что гистоны Н2А/Н2В могут вовлекаться в комплекс через взаимодействие с Naplp (Hodges et al, 2005). He исключено, что из-за определенных конформационных перестроек кариоферина при связывании одного субстрата, может формироваться другой субстрат-связывающий сайт, возможно, с участием первого субстрата.
Регуляция транспорта за счёт изменения состава импортинов и экспортинов
Изобилие различный факторов, узнающих сигнальные последовательности на транспортируемых белках (таблица 1), свидетельствует в пользу того, что транспорт определенных клеточных белков может избирательно регулироваться на этом уровне. Так как факторы имеют разную субстратную специфичность, логично предположить, что транспорт определенных белков может регулироваться за счёт изменения уровня экспрессии соответствующего транспортного фактора (импортина или экспортина).
Анализ уровня мРНК кариоферинов-а в различных тканях показал, что экспрессия генов кариоферинов-а может быть тканеспецифичной: уровень мРНК импортина-al был невысоким в различных тканях, тогда как мРНК импортинов-а4, а5 и аб было очень много в семенниках и чуть меньше в селезёнке (Nadler et al, 1997; Tsuji et al, 1997). Анализ количества белков подтвердил данные о тканеспецифичности кариоферинов-а. Так к примеру, человеческий импортин-а4, количество которого составляет более 1% от белков в скелетных мышцах, практически отсутствует в сердце, селезёнке и почках (Nachury et al, 1998). Импортина-а2 много в сердце, семенниках, скелетных мышцах и яичниках, а
импортин-аЗ - сильнее всего представлен в яичниках (КоЫег et al, 1997). Недавно было продемонстрировано, что белок dHSF {Drosophila heat-shock factor), специфично переносимый импортином-аЗ, транспортируется в ядро только на поздних стадиях развития, когда начинает экспрессироваться импортин-аЗ (Fang et al, 2001).
Мало что известно относительно кариоферинов-р. Было показано, что уровень мРНК Crml (Collier et al, 2000), транспортна 1 (Norvell et al, 1999) и импортина-аЗ (Mathe et al, 2000) практически не изменяется в разных тканях в ходе развития Drosophila, тогда как мРНК CAS обнаруживается в разных тканях лишь на определенных стадиях развития (Tekotte et al, 2002).
Несмотря на то, что NPC не содержит никаких моторных белков и, по-существу, является пассивным участником транспорта, его состав может изменяться. Известно, что нуклеопорины проявляют разную специфичность (аффинность) к разным импортинам и экспортинам (Allen et al, 2001). Из этого можно предполагать, что изменение экспрессии того или иного нуклеопорина может модулировать эффективность транспортировки определенных белков через NPC. К примеру, в клетках, дефицитных по нуклеопорину Nup98, селективно ухудшается транспортировка белков, содержащих классические NLS, но не рибосомального бежа L23a (Wu et al, 2001).
Были также описаны тканеспецифичные различия в NPC. Так содержание в NPC белка Npap60, который облегчает транспортировку определенных факторов и комплексов в ядро, в семенниках более чем в 10 раз больше, чем в других тканях (Fan et al, 1997). Нуклеопорин Nup BS-63 (сплайсинг-изоформа Nup358) также обнаруживается исключительно в семенниках. Показано, что он может напрямую взаимодействовать с Ran, импортином-р2 и фактором ремоделирования хроматина aF10. aFlO-подобные факторы могут проникать в ядро за счёт прямого взаимодействия с нуклеопорином Nup BS-63 (Cai et al, 2002). Функциональная важность индивидуальных нуклеопоринов продемонстрирована и на Nup 154 Drosophila (гомолог Nup 155): в его отсутствие нарушается нормальное развитие гамет (Gigliotti et al, 1998).
Интересным оказался результат, полученный in vitro. Оказалось, что при снижении концентрации Са+2 существенно затрудняется транспорт белков в ядро даже за счёт диффузии. Было высказано предположение, что снижение концентрации Са+2 приводит к конформационным изменениям в NPC, что и может вызьгеать затруднения в транспортировке (Perezerzic et al, 1997). Вероятно, этот эффект обусловлен конформационными изменениями в большом полостном нуклеопорине gp210, который содержит несколько Са -связывающих доменов (Perezerzic et al., 1996).
Участие YB-1 в регуляции стабильности мРНК
Ранее в ряде работ было показано, что белки семейства YB-1 фосфорилируются как in vivo, так и in vitro (Auerbach and Pederson, 1975; Minich et al, 1993; Murray et al, 1991). Известно, что YB-1 фосфорилируется казеинкиназой II (CK II), но до настоящего времени нет однозначной оценки влияния такого фосфорилирования на функции YB-1 - имеющиеся данные весьма противоречивы. Есть данные экспериментов in vitro о фосфорилировании YB-1 киназами ERK2 и GSK3p. После такого фосфорилирования увеличивается сродство YB-1 к промотору гена VEGF (Coles et al, 2005). Ряд данных указывает на то, что фосфорилирование может регулировать транспорт YB-1 из цитоплазмы в ядро. Например, в фибробластах человека переход YB-1 в ядро, индуцируемый интерфероном у, подавлялся в присутствии специфического ингибитора СК II (Higashi et al, 2003а), а в клетках KB транслокация YB-1 в ядро под действием УФ облучения не происходила при добавлении специфического ингибитора протеинкиназы С Н-7 (Koike et al, 1997).
Лишь сравнительно недавно удалось установить одну из киназ, фосфорилирование которой может стимулировать переход YB-1 из цитоплазмы в ядро. В опытах на культивируемых клетках MCF7 было обнаружено, что при стимуляции их ростовыми факторами часть YB-1 переходит в ядро (Sutherland et al, 2005). Известно, что при стимуляции ростовыми факторами активируется, главным образом, PI(3)K-Akt и МАРК сигнальные пути. Коиммунопреципитацией было показано, что YB-1 может связываться с киназой Akt, и формирование этого комплекса стимулируется при обработке клеток ростовыми факторами. В экспериментах in vitro было установлено, что за взаимодействие с киназой Akt отвечает CSD домен YB-1 (рисунок 10). Интересным оказалось, что связываться с YB-1 способна лишь активированная (фосфорилированная) форма Akt. Было установлено, что киназа Akt фосфорилирует YB-1 по Ser-102, и после этого фосфорилирования YB-1 перемещается в ядро. Замена остатка Ser-102 на аланин снижало количество YB-1 в ядре. Остаток Ser-102 находится недалеко от двух консервативных РНП-мотивов в домене холодного шока (смотри рисунок 10 и главу раздела II «Обзора литературы»).
Считается, что именно эти мотивы играют основную роль в связывании YB-1 с мРНК. Было выдвинуто предположение, что при фосфорилировании YB-1 по Ser-102 его сродство к мРНК существенно снижается, он диссоциирует от мРНК и переходит в ядро (Sutherland et al, 2005). Данный механизм регуляции транспорта YB-1 можно отнести к регуляции за счёт удержания в цитоплазме, только в качестве сигнала удержания в данной ситуации выступают РНП-1 и РНП-2 мотивы в домене холодового шока. Однако результат эксперимента, из которого авторы данной работы делают вывод о влиянии фосфорилирования киназой Akt белка YB-1 по Ser-102 на его перемещение в ядро, выглядит неубедительно и требует перепроверки. 6. YB-1 и рак
Особый интерес к YB-1-подобным белкам возник в 1997 году после появления в солидном научном журнале «Nature Medicine» сообщения об обнаружении прямой корреляции между ядерной локализацией YB-1 и появлением множественной лекарственной устойчивости клеток при раке молочной железы человека (Bargou et al, 1997). Напротив, в клетках, чувствительных к противоопухолевым препаратам, YB-1 обнаруживался только в цитоплазме. Дополнительный синтез YB-1 с плазмиды в таких чувствительных клетках вызывал повышение уровня гликопротеина Р и повышение устойчивости клеток к лекарственным препаратам. Было найдено разумное объяснение обнаруженной корреляции. Оказалось, что ген mdr-1, кодирующий гликопротеин Р - мембранный белок, выкачивающий ксенобиотики из клетки и обеспечивающий множественную лекарственную устойчивость, содержит Y-бокс в своем промоторе, и его экспрессия находится под контролем YB-1 (Goldsmith et al, 1993; Ohga et al, 1998). Переход YB-1 в ядро вызывает активацию синтеза мРНК с гена mdr-1 и приводит к появлению у клеток множественной лекарствешюй устойчивости. Помимо гликопротеина Р, YB-1 активирует экспрессию белка MVP/LRP (major vault protein), ген которого в промоторе также содержит Y-бокс элемент (Stein et al, 2005). Белок MVP/LRP вовлечён в формирование лекарственной устойчивости, так как он отвечает за инактивацию ксенобиотиков в цитоплазме (Mossink et al, 2003). Было предложено рассматривать ядерную локализацию YB-1 как наиболее ранний маркер множественной лекарственной устойчивости клеток рака молочной железы человека (Bargou et al, 1997; Janz et al, 2002; Saji et al, 2003). Переход YB-1 в ядро наблюдается не только в случае рака молочной железы, но и при других типах злокачественных опухолей, например, остеосаркоме (Oda et al, 1998), аденокарциноме яичника (Kamura et al., 1999), раке легкого (Shibahara et al., 2001), синовиальной саркоме (Oda et al, 2003) и т.д. Во всех случаях появление YB-1 в ядре свидетельствовало о плохом прогнозе у пациентов после операции. Опухоли, в клетках которых YB-1 обнаруживался в ядре, характеризовались как более агрессивные и более устойчивые к послеоперациошюму лечению химиотерапией (Huang et al, 2005). Помимо активации гена mdr-l, которая чётко коррелировала с переходом YB-1 в ядро, оказалось, что эффект такого перехода на физиологию опухолевых клеток может быть связан с ингибированием гена белка р53 (Lasham et al, 2003). Уровень этого белка значительно повышается при разнообразных воздействиях на клетку, вызывающих повреждение ДНК (различные типы облучения, токсичные химические агенты и т.п.). р53 участвует в запуске механизмов, позволяющих клетке восстановить целостность генома, а при наиболее тяжелых повреждениях активность р53 вызывает клеточную смерть (апоптоз), не допуская их злокачественную трансформацию (Levine, 1997). Оказалось, что YB-1, накапливаясь в ядре, способен ингибировать промотор гена р53, предотвращая его экспрессию. Интибирование синтеза р53, наряду с запуском синтеза гликопротеина Р, при ядерной локализации YB-1, способствует более агрессивному поведению злокачественной опухоли, что, в свою очередь, приводит к плохому прогнозу на выздоровление. Кроме того, YB-1 активирует промотор гена металлопротеиназы гелатиназы А, которая расщепляет белки базальных мембран и способствует инвазии раковых клеток в соседние ткани (Mertense/a/.,2002a).
Похожие диссертации на Поиск ферментов, контролирующих ядерно-цитоплазматическое распределение белка YB-1 в клетках млекопитающих
