Содержание к диссертации
Введение
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Механизмы распознавания заряженных субстратов протеолитическими ферментами 7
2.1. Введение 7
2.2. Номенклатура, применяемая для описания взаимодействия протеазы с субстратом 8
2.3. Аспартильные протеазы 9
2.4. Металлопротеазы 12
2.5. Цистеиновые протеазы 18
2.6. Сериновые протеазы 25
2.7. Заключение 39
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 42
3.1. Реактивы и материалы 42
3.2. Общие методы 42
3.3. Конструирование плазмид для экспрессии BIGEP в клетках В. subtilis 45
3.4. Получение нативного фермента (BIGEP-Bs) из клеток Bacillus subtilis 46
3.5. Конструирование плазмид для экспрессии BIGEP в клетках Е. coli 47
3.6. Очистка рекомбинантного пропептида BIGEP (HP) 48
3.7. Очистка рекомбинантных вариантов BIGEP (SPM, РМ, РЕМ, М, N-l, N-2,
N-3) 48
3.8. Ренатурация и активация рекомбинантных вариантов BIGEP (SPM, РМ, РЕМ, М, N-l, N-2, N-3) 49
3.9. Электронная микроскопия 49
3.10. Получение пропептида BIGEP слитого с целлюлозосвязывающим доменом CelD целлюлазы Anaerocellum thermophilum (CBD-P) 49
3.11. Ренатурация зрелых частей BIGEP рекомбинантым пропептидом in trans 50
3.12. Обработка BIGEP аминопептидазами 50
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 52
4.1. Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins: связь между распознаванием субстрата и активацией предшественника 52
4.2. Изучение созревания глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius 55
4.2.1. Влияние природы (-1) остатка на созревание глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius 4.2.2. Эффект делеции З'-некодирующей области гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius на продукцию активного белка клетками Bacillus subtilis 58
4.2.3. Созревание глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius in vitro 61
4.2.4. Автоактивация глутамилэндопептидазы В. intermedius 65
4.3. Изучение роли N-концевого остатка в функционировании зрелой глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius 67
4.3.1. Получение вариантов глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius без N-концевых остатков 67
4.3.2. Исследование созревания глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius с собственным пропентидом в системе in trans 69
4.3.3. Получение глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius с тремя удаленными N-концевыми остатками 71
4.4. Заключение 74
5. ВЫВОДЫ 75
6. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 76
- Аспартильные протеазы
- Получение нативного фермента (BIGEP-Bs) из клеток Bacillus subtilis
- Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins: связь между распознаванием субстрата и активацией предшественника
Введение к работе
Актуальность исследования
В современных науках о жизни значительное место занимают проблемы изучения белковых молекул, связи структуры и функции белков. Наибольшее внимание при этом привлекают каталитически активные белки — ферменты. Одним из основных направлений является исследование механизмов ферментативного катализа, представляющее значительный интерес как с фундаментальной точки зрения, так и для развития биотехнологии. Важнейшим этапом функционирования ферментов является специфическое распознавание и связывание молекул субстрата. Понимание механизмов, лежащих в основе субстратной специфичности белков, позволяет управлять активностью природных ферментов, в частности, в медицинских целях. Кроме того, знание закономерностей распознавания субстрата позволяет конструировать белки с модифицированной, заданной субстратной специфичностью.
Удобной моделью для исследования механизмов, определяющих субстратную специфичность, являются протеолитические ферменты. Внутри этого класса ферментов можно выделить ряды родственных белков, по-разному взаимодействующих с различными аминонокислотными остатками субстрата. Таким образом, становится возможным проанализировать изменения в структуре ферментов, приводящие к различиям в субстратной специфичности.
Среди протеаз особый интерес вызывают ферменты с узкой субстратной специфичностью, распознающие, например, только положительно или только отрицательно заряженные остатки. Подобные ферменты нашли широкое применение в современных биомедицинских технологиях, благодаря их способности осуществлять ограниченный гидролиз белков и пептидов. Это делает протеазы с узкой специфичностью незаменимой составляющей основанных на масс-спектрометрии иротеомных исследований. Такие ферменты применяют для определения первичной структуры и доменной организации, а также идентификации белков. Они могут быть использованы также для сиквенс-специфического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов.
Моделью в наших исследованиях служит глутамилэндопептидаза Bacillus
intermedins (BIGEP) - сериновая протеаза, с высокой специфичностью гидролизующая
пептидные связи, образованные а-карбоксильными группами глутаминовой и
аспарагиновой кислот. Подобная специфичность выделяет глутамилэндопептидазы
(ГЭПазы) в ряду химотрипсинподобных протеаз. Несмотря на то, что BIGEP относится к хорошо изученному структурному семейству химотрипсина, а для самого фермента установлена пространственная структура и проведен направленный мутагенез субстратсвязывающего сайта, механизм, определяющий субстратную специфичность BIGEP, как и других глутамилэндопептидаз, неизвестен. Изучение закономерностей, обеспечивающих распознавание отрицательно заряженных остатков субстрата ГЭПазами на примере BIGEP, и последующее сравнение с таковыми других ферментов семейства, позволит проанализировать эволюционные изменения, обеспечивающие разнообразие субстратных предпочтений химотрипсинподобных протеаз.
Цели и задачи исследования
Основной целью данного исследования являлось изучение структурно-функциональных особенностей BIGEP, обеспечивающих предпочтение фермента к связям, образованным остатками глутаминовой кислоты. Для этого в работе решались следующие задачи:
изучение механизма созревания предшественника BIGEP;
получение зрелой BIGEP без N-концевых аминокислотных остатков и анализ ее специфичности.
Научная новизна исследования
В представленной работе впервые продемонстрировано, что модификация сайта процессинга BIGEP влияет на продукцию активного белка клетками В. subtilis. Впервые исследован механизм созревания рекомбинантной BIGEP in vitro, и показана необходимость пропептида BIGEP для формирования активного фермента. Получен вариант зрелой BIGEP с делецией трех N-концевых аминокислотных остатков, что позволило впервые продемонстрировать важность N-концевого района для функционирования фермента.
Практическая значимость исследования
Полученные в работе данные о влиянии модификации сайта процессинга на продукцию активной BIGEP могут быть использованы для создания эффективных продуцентов протеаз с узкой субстратной специфичностью. В частности, в работе предложен новый подход к получению BIGEP в гетерологической экспрессионной системе, заключающийся в создании автоактивирующегося варианта целевого фермента путем модификации сайта его процессинга.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Аспартильные протеазы
Все аспартильные протеазы являются эндопептидазами. Подавляющее большинство аспартильных протеиназ, примером которых может служить пепсин (семейство А1, по классификации, представленой в базе данных MEROPS [2]), неспособны к гидролизу связей, образованных заряженными остатками, предпочитая большие гидрофобные остатки в Р1 и РГ положениях [3]. Исключение составляю! пепсины грибов, способные с низкой эффективностью расщеплять связи с положительно заряженным лизином в Р1 положении [4]. В то же время говорить о предпочтении пепсинов грибов к заряженным остаткам нельзя. Анализ структуры пепсина из Rhizopus chinensis показал, что различия с пепсинами млекопитающих заключаются в наличии в субстратсвязывающем районе этих протеиназ двух остатков аспарагиновой кислоты (Asp30 и Asp77) в дополнение к остаткам каталитического центра (Asp32, Asp215). У пепсинов млекопитающих в этих положениях находятся остатки изолейцина/валина и треонина, соответственно. Методом сайт-направленного мутагенеза остатки Asp30 и Asp77 пепсина Rhizopus были поочередно заменены на изолейцин и треонин [4]. Было показано, что замена Asp30 не влияла на специфичность фермента. В то же время мутант Asp77- Thr демонстрировал субстратные предпочтения, характерные для классических аспартильных протеиназ и не был способен распознавать заряженные остатки. Таким образом, один заряженный аминокислотный остаток в субстратсвязывающем районе дает возможность взаимодействовать с противоположным зарядом, однако его наличие является недостаточным условием для предпочтительного связывания заряженных субстратов. И все же среди аспартильных протеиназ можно выделить две группы белков, демонстрирующих строгое предпочтение к заряженным субстратам: япсины (yapsins, семейство А1) дрожжей и герменативные протеазы (GPR, семейство А25) бацилл. Первые, мембраносвязанные белки, специфически расщепляют связи, образованные карбоксильными группами положительно заряженных аминокислот (лизин, аргинин) [5]. Вторые при прорастании спор бацилл гидролизуют кислые белки, составляющие основную массу споры, по отрицательно заряженным остаткам (глутаминовая и аспарагиновая кислоты) в Р1 положении [6]. Механизмы, определяющие специфичность данных протеиназ к настоящему времени не изучены.
Строгой специфичностью к заряженным субстратам обладают ферменты группы омптинов (omptins, семейство А26). Это родственные трансмембранному белку Е. coli OmpT протеиназы грамотрицательных бактерий, расщепляющие субстрат между двумя положительно заряженными аминокислотными остатками (лизин, аргинин). Анализ пространственной структуры и сайт-направленный мутагенез OmpT позволили выделить остатки данного фермента, участвующие в катализе: Asp83, Asp85, Asp210 и His212 [7. 8]. Это позволяет считать омптины аспартильными протеиназами, хотя многие исследователи предлагают выделить их в отдельную группу. Основанием для этого служит то, что первичная, третичная структуры и энзиматические свойства данных белков не имеют сходства с таковыми пепсинподобных аспартильных протеиназ и не позволяют отнести их к другим известным типам протеолитических ферментов [7]. В то же время механизмы, определяющие узкую субстратную специфичность данных белков, изучены достаточно полно. Кроме вышеперечисленных каталитических остатков, в субстратсвязывающей бороздке омптинов обнаруживаются консервативные остатки Glu27, Asp97, Asp208 и Ser223, что придает этому участку значительный отрицательный заряд и позволяет с высокой специфичностью распознавать основные остатки субстрата (рис. 2). Было предположено, что остаток Asp97 ответственен за распознавание положительного заряда в РГ положении, a Glu27, Asp208 и Ser223 формируют SI субсайт. Замены Glu27, Asp97 и Asp208 на аланин приводили к десятикратному уменьшению ферментативной активности [7], что согласовывалось с выдвинутой гипотезой, но не являлось доказательством участия данных остатков в распознавании субстрата. В другой работе было продемонстрировано, что мутант с заменой Asp208- Gly обладает пониженной активностью, но значительно лучше гидролизует связь Ala-Arg в субстрате, чем Arg-Arg, характерную для специфичности нативного белка [9]. Можно заключить, что главной детерминантой, определяющей предпочтение омптинов к положительному заряду в Р1 положении субстрата, является остаток Asp208. В то же время замена расположенного поблизости остатка Ser223- Arg приводит к тому, что мутантный фермент, демонстрируя уровень пептидазной активности, близкий к уровню активности белка дикого типа, специфически расщепляет связь Ala-Arg, и не способен гидролизовать субстрат между двумя положительно заряженными остатками [9].
Таким образом, можно заключить, что модификация субстратсвязывающего района почти всегда ухудшает ферментативные свойства белка. При этом пример пепсинов грибов показывает, что замена одного или двух остатков редко приводят к кардинальному изменению специфичности фермента. Очевидно, важна вся геометрия S1 субсайта: введение/удаление в структуру субстратсвязывающего сайта методом сайт-направленного мутагенеза объемных группировок, как в случае омптина, всегда отражается на функционировании белка. При этом прямая замена остатка-компенсатора заряда субстрата не является обязательной — возможно удалить заряд введя дополнительный противоположный.
Получение нативного фермента (BIGEP-Bs) из клеток Bacillus subtilis
Клетки В. subtilis BG2036(p58.21) растили в 100 мл среды LB в течение 48 часов (37С, 200 об./мин) в присутствии хлорамфеникола (10 мкг/мл). Затем клетки отделяли центрифугированием (4000 g, 10 мин), а к культуральной среде добавляли сульфат аммония до 70 % насыщения. После 12 часов инкубации при 4С образовавшийся осадок осаждали центрифугированием (10000 g, 10 мин) и растворяли в 4 мл 50 мМ MES-NaOH буфера (рН 6,0). Полученный раствор наносили на Econo-Pac HighS cartridge, 1 ml (Bio-Rad, США), уравновешенный 50 мМ MES-NaOH буфером (рН 6,0). Элюцию проводили линейным градиентом концентрации NaCl (0-1 М, 100 мл) в том же буфере при скорости потока 1,0 мл/мин. Содержащую BIGEP фракцию концентрировали ультрафильтрацией на мембране PTGC (Millipore, США) и наносили на колонку Superdex 75 HR 10/30 (Amersham Biosciences), уравновешенную 25 мМ Tris-HCl буфером (pll 8,0), содержащим 0,15 М NaCl. Белок элюировали тем же буфером при скорости потока 0,5 мл/мин. Ход очистки контролировали электрофорезом.
На матрице плазмиды р58.21 методом ПЦР были получены варианты гена BIGEP, кодирующие: полноразмерный предшественник (SPM), предшественник без секреторного лидера (РМ), зрелую часть BIGEP (М). Кроме того, были получены фрагменты, кодирующие зрелые части BIGEP без одного (N-1), двух (N-2) и трех (N-3) N-концевых аминокислотных остатков, а также пропептид BIGEP с шестигистидиновой якорной последовательностью (HP). Для получения SPM использовали пару праймеров SigNI (ataaaggaggcatatgatgatgaaaaagg) и EndHIII (ggaaacaagctttgtgctc), для получения РМ — праймеры ProNI (tttgcccatatgacatcggattcagtactaac) и EndHIII, для получения М - MatNl (caaacacatatggtcattggagacgatggaag) и EndHIII. Для получения N-J, N-2 и N-3 пары праймеров составляли олигонуклеотиды N1 (acaaaacatatgattggagacgatggaagaac), N2 (aaagtccatatgggagacgatggaagaacaaaag) и N3 (gtcgtccatatggacgatggaagaacaaaagtag), соответственно, и EndHIII. Для получения HP использовали праймеры HProNI (gttUacatatgc a/cacca/cacca/cacacatcggattcagtactaac) и РгоНШ (gtctccaagcttttattttgtttgaaagtcttttaaata). Кодирующая шестигистидиновый якорь последовательность выделена в HProNI курсивом. Для получения гена предшественника BIGEP с заменой Lys(-l) Glu (РЕМ) использовали пару праймеров ProNI/EndHIH, а в качестве матрицы для ПЦР плазмиду рЕ-1. (Данный вектор, содержащий ген BIGEP с целевой мутацией, был получен нами ранее для экспрессии мутантной BIGEP в клетках Bacillus subtilis.)
Все перечисленные выше продукты ПЦР, ограниченные сайтами рестрикции Ndcl и НіпсШІ (подчеркнуты в последовательностях праймеров), были фосфорилированы и клонированы в линеаризованную по сайту Hindi плазмиду pUC19. Полученными векторами трансформировали клетки Е. coli XL-1 Blue (Stratagene, США). После подтверждения структуры всех конструкций секвенированием, фрагменты гена BIGEP переносили в плазмиду pET23b(+) (Novagen, США) по сайтам рестрикции Nde\ и Hind\\\. Целевые экспрессионные векторы (pSPM, рРМ, рМ, pN-1, pN-2, pN-З, рРЕМ и рНР соответственно) были введены в клетки штамма Е. coli BL21(DE3) (Novagen, США).
Глутамилэндопептидаза Bacillus intermedins: связь между распознаванием субстрата и активацией предшественника
Для группы родственных ГЭПаз бацилл и кокков, имееющих высокую гомологию и, вероятно, аналогичную структуру субстратсвязывающего района, была выдвинута гипотеза, объясняющая строгое субстратное предпочтение. На основании рентгено-структурного анализа молекул ГЭПаз Bacillus intermedius (BIGEP) и Staphylococcus aureus (протеаза V8) было выдвинута гипотеза, что основной во взаимодействии с карбоксильной группой боковой цепи остатка субстрата в Р1 положении является свободная аминогруппа N-концевого остатка (Vail) [88, 89]. Данный остаток (Vail) приближен к активному центру фермента, а его а-аминогруппа экспонирована в область субстрат-связывающего кармана (рис. 16). Работа, направленая на анализ роли N- концевой аминогруппы во взаимодействии с субстратом, ведется нами на модели ГЭПазы Bacillus intermedins (BIGEP), выделенной и охарактеризованной ранее.
Протеаза V8 и фермент В. intermedins, как и другие бактериальные ГЭПазы, являются секреторными белками и синтезируются в виде предшественников. Помимо последовательности зрелой ГЭПазы, предшественник включает в себя N-концевой сигнальный пептид, необходимый для секреции, и пропептид (пропоследовательность). удаляемый при созревании. Таким образом, N-концевая аминогруппа зрелого фермента формируется в результате процессинга — гидролиза связи между пропептидом и зрелой частью белка. Из этого следует, что если гипотеза об участии свободноіі аминогруппы в распознавании субстрата верна, то специфичность вышеназванных ГЭ11аз также формируется лишь после удаления пропептида [89]. Предшественники BIGEP и родственных белков, в таком случае, либо имеют субстратную специфичность, отличную от зрелой ГЭПазы, либо не обладают протеолитической активностью. С другой стороны, если высказанная гипотеза не верна и механизм, определяющий предпочтение ГЭПаз к отрицательно заряженным остаткам, не основывается на участии Vail (нумерация от начала зрелого фермента) во взаимодействии с субстратом, то предшественники ГЭПаз должны либо демонстрировать глутамилэндопептидазную активность, либо, как и в предыдущем случае, быть неактивными.
Функции пропоследовательностей ГЭПаз до настоящего времени оставались не ясными, однако для большинства протеолитических ферментов других групп показано, что пропептид участвует в формировании пространственной структуры белка [103]. Удаление пропептида у бактериальных секреторных протеиназ в большинстве изученных случаев происходит автокаталитически, то есть благодаря протеолитической активности предшественника [104]. Характерными примерами такого механизма процессинга могут служить субтилизин [105] и термолизин [106]. Природа расщепляемой связи в обоих случаях соответствует свойствам зрелых протеиназ, что не удивительно, так как эти ферменты, в отличие от ВЮЕР, имеют широкую субстратную специфичность.
В то же время анализ последовательностей известных ГЭПаз показывает, что только у двух из них, ферментов Streptomyces griseus и Str. fradiae, в (-1) позиции расположен остаток глутаминовой кислоты (рис. 2). Вероятно, предшественник ГЭПазы Sir. griseus, вероятно, может процессироваться автокаталитически. Существующие экспериментальные данные позволяют думать, что это действительно так [85]. Это значит, что специфичность, характерная для зрелой ГЭПазы Str. griseus, возникает, видимо, до активации предшественника. Однако, ранее было показано, что N-концевая сс аминогруппа зрелого фермента Str. griseus не имеет отношения к механизму, определяющему субстратную специфичность [83]. Следовательно, автоактивация ГЭПазы Str. griseus не противоречит гипотезе об участии свободной аминогруппы BIGEP в распознавании заряда субстрата.
Иная ситуация наблюдается в районе сайта процессинга бациллярных и кокковых ГЭПаз. Очевидно, что, если предшественник BIGEP имеет специфичность, характерную для зрелого фермента, для осуществления автокаталитического процессинга С-концевым остатком пропоследовательности должна быть глутаминовая кислота. Однако в положении (-1) BIGEP расположен остаток лизина, несущий положительный заряд. Этот факт подразумевает две возможности: первая - предшественник BIGEP имеет прямо противоположную зрелому белку специфичность, вторая - процессинг BIGEP происходит гетерокаталитически, то есть при участии другой протеиназы.
