Введение к работе
Актуальность работы. В последние годы биокаталитические технологии становятся все более востребованными, так как количество ферментов, эффективно используемых в различных областях промышленности, растет очень быстро. Гликозидгидролазы (гликозидазы), катализирующие расщепление гликозидных связей в олиго- и полисахаридах, - одна из самых широко изучаемых групп ферментов. Представителями гликозидаз являются инулиназы -ферменты, гидролизующие фруктозосодержащие олигосахариды и полимеры (фруктаны) до фруктозы и фруктоолигосахаридов различной степени полимеризации. Инулиназы привлекают к себе внимание вследствие их востребованности в пищевой промышленности, фармакологии, сельском хозяйстве и других областях.
Интерес к эндо-инулиназам вызван тем, что образующиеся в результате их каталитического действия фруктоолигосахариды обладают пребиотическими свойствами. Доказано, что инулин и олигофрутозиды избирательно стимулируют рост и метаболическую активность бифидо- и лактобактерий, не влияя на рост других культур и подавляя развитие потенциально патогенных бактерий. Производимые в настоящее время короткие олигофруктозиды получают из сахарозы с помощью фрукозилтрансферазы, синтезируемой из Aspergillus niger. Этот метод оказался крайне дорогим и многостадийным, в результате чего цена конечного продукта очень высокая (Granger, 2000).
Альтернативным подходом к получению фруктоолигосахаридов является ферментативный гидролиз природных полифруктанов посредством комплексного действия эндо- и экзо-инулиназ, тем более, что инулинсодержащее сырье является легко доступным и недорогим.
Инулиназы, синтезируемые многими микроорганизмами,
включая грибы, дрожжи и бактерии, довольно подробно изучены
(Onodera et al., 1992; Pessoni et al., 1999; Gupta et al., 1994; Ettalibi et al.,
1990, Arand et al„ 2004, Pandey et al, 2001, Синицин А.П., 2006, Абелян
B.A.,1996). На основе гомологии аминокислотных
последовательностей и сходного механизма действия инулиназы отнесены к 32-ому семейству гликозидгидролаз (Coutinho and
Henrissat, 1999). Это семейство также включает инвертазы, леваназы и два типа 1-фруктозилтрансфераз. Несмотря на многочисленные исследования инулиназ, вопрос о специфичности эндо-инулиназ до сих пор актуален, данные по исследованию пребиотической способности образующихся в результате их каталитического действия олигофруктозидов немногочисленны. В связи с этим получение высокоактивных ферментных препаратов для гидролиза инулинсодержащего сырья до фруктоолигосахаридов, являющихся пребиотиками и способствующих поддержанию нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта, является актуальной задачей биотехнологии. Расширение спектра пребиотических препаратов имеет значение не только для медицинской практики, но и для пищевой промышленности.
Настоящая работа выполнялась в соответствии с научным направлением кафедры микробиологии и биохимии Воронежской государственной технологической академии по проблеме «Научные основы и практическое применение биокаталитических технологий в биоконверсии природных полимеров» и в рамках научно-технической программы «Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники».
Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы явилось получение высокоактивного ферментного препарата эндо-инулиназы, исследование его некоторых физико-химических свойств и субстратной специфичности, а также получение фруктоолигосахаридов и определение их пребиотической способности.
Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих задач:
- изучение некоторых культуральных, морфологических
признаков и биосинтетической способности дрожжей Saccharomyces
cerevisiae ВГШ-2;
- оптимизация условий биосинтеза эндо-инулиназы дрожжами
S. cerevisiae ВГШ-2;
- разработка эффективного способа выделения и очистки
ферментного препарата;
определение физико-химических свойств, субстратной специфичности и кинетических закономерностей процесса кислотной и термической инактивации эндо-инулиназы;
получение фруктоолигосахаридов путем ферментативного гидролиза инулинсодержащего сырья;
исследование пребиотических свойств олигофруктозидов в опытах in vitro и in vivo;
- обоснование целесообразности использования эндо-инулиназы
для получения пребиотиков.
Научная новизна. Впервые получен ферментный препарат эндо-инулиназы из дрожжей S. cerevisiae ВГШ-2, эффективно гидролизующий инулин до олигофруктозидов.
Проведены комплексные исследования физико-химических свойств фермента, его субстратной специфичности. Выявлены закономерности процесса термической и кислотной инактивации фермента. Установлено, что эндо-инулиназа гидродизует как Р-2,1-, так и Р-2,6-фруктозидные связи в субстратах.
Установлены способность фруктоолигосахаридов увеличивать резистентность бифидобактерий в присутствии антибиотика и проявление мутуализма к нормальной микрофлоре ЖКТ, в частности, к Е. coli, что указывает на положительное воздействие этого углевода на нормобиоз кишечника.
Практическая значимость. Результаты настоящего исследования дают возможность получать олигофруктозиды пребиотического действия, способствующие поддержанию нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта. Это позволит расширить спектр пребиотических препаратов, имеющих значение как в медицинской практике, так и в пищевой промышленности.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены на отчетных научных конференциях ВГТА за 2005-2008 гг, на 3 и 4-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005, 2007), международной научно-технической конференции «Инновационные технологии переработки сельскохозяйственного сырья в обеспечении качества жизни: наука, образование и производство» (Воронеж, 2008), III международой научно-технической конференции «Инновационные технологии и оборудование для пищевой промышленности (приоритеты развития)» (Воронеж, 2009), международном симпозиуме «Okologische, technologische und rechtliche aspekte der ledtnsversorgung» (Ганновер, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения результатов, заключения, выводов, списка литературы (170 источников) и приложения. Иллюстративный материал включает 36 рисунков и 25 таблиц.
