Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1 Биогенез и свойства низина 10
1.1.1 Структура низина 10
1.1.2 Свойства и механизм действия низина 12
1.1.3 Организация кластера генов низина 15
1.1.4 Регуляция биосинтеза низина 17
1.1.5. Возможные механизмы защиты клеток продуцента от низина 18
1.2 Мультилекарственная резистентность у молочнокислых бактерий 20
1.3 Метаболизм молочнокислых бактерий 23
1.3.1 Питательные потребности и протеолиз белков 23
1.3.1.1. Питательные потребности молочнокислых бактерий 23
1.3.1.2. Протеиназы молочнокислых бактерий 25
1.3.1.3. Продукты расщепления казеина 25
1.3.1.4. Аминокислотные и пептидные транспортные системы 26
1.4 Углеводный метаболизм 29
1.4.1 Регуляция гликолиза 29
1.4.2 Влияние углеводов на биосинтез низина 33
1.4.3 Регуляция утилизации углеводов 36
1.5. Применение низина 41
ГЛАВА 2 Материалы и методы 45
2.1 Штаммы, использованные в работе 45
2.2 Питательные среды 46
2.2.1 Агаризованные среды для проведения селекционной работы, под держания и хранения культуры Lactococcus lactis subsp. lactis 46
2.2.2 Среды для глубинного культивирования L. lactis subsp. lactis в колбах 47
2.2.3 Среды для глубинного культивирования L. lactis subsp. lactis в аппарате 48
2.3 Хранение, поддержание и глубинное культивирование продуцента низина 48
2.4. Морфологическая характеристика культуры 50
2.5 Методика определения активности низина 50
2.6. Получение мутантов, устойчивых к антибиотикам 53
2.7. Определение редуцирующих веществ методом Бертрана 55
2.8 Определение редуцирующих веществ методом ТСХ 57
2.9. Тесты на чувствительность к антимикробным агентам 59
2.10. Чувствительность к деоксиглюкозе 60
2.11. Чувствительность к окислительному стрессу 60
2.12. Определение титра клеток 61
2.13. Определение содержания молочной кислоты 61
2.14. Определение протеолитической активности 61
2.15 Определение рН среды 62
2.16 Метод определения а/к «Капель 105» 62
2.17 Статистическая обработка данных 63
ГЛАВА 3 Результаты и обсуждения 66
3.1. Схема экспериментальных исследований 66
3.2 Условия поддержания культуры 67
3.3 Получение нового высокопродуктивного штамма 70
3 А Характеристика нового бацитрацинустойчивого штамма 73
3.4.1. Сравнение ферментационных характеристик мутанта и исходного штамма 73
3.4.2 Устойчивость к бацитрацину 75
4 3.4.3. Чувствительность исходного штамма и мутанта 75 к различным антимикробным агентам 76
3.4.4 Чувствительность исходного штамма и мутанта 75 к низинуА 78
3.4.5. Устойчивость к окислительному стрессу 78
3.4.6. Биосинтез низина при утилизации различных углеводов 79
3.5. Модификация технологии получения низина с ипользованием штамма Lactococcus lactis вар.№75 85
3.5.1. Влияние режимов фильтрации ферментационной среды на биосинтез низина 85
3.5.2. Оптимизация ферментационной среды по составу белковых субстратов 86
3.6. Обсуждение результатов 94
ГЛАВА 4 Биосинтез низина в промышленных условиях 101
4.1. Технология производства низина 101
4.2. Утилизация отходов производства низина 104
4.3. Экономическая оценка себестоимости продукта с использованием предлагаемых изменений 105
4.3.1. Расчет экономического эффекта при использовании мутанта 75 105
4.3.2. Расчет экономического эффекта при замене молочной среды на среду, содержащую соевую муку 106
ВЫВОДЫ 107
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 108
ПРИЛОЖЕНИЯ 131
Введение к работе
Актуальность темы.
За последнее время возрос интерес к использованию молочнокислых бактерий (МКБ) в качестве защиты от порчи пищевых продуктов. Одной из главных причин этого является заинтересованность потребителей в том, чтобы в пищевой промышленности уменьшалось использование химических средств защиты и жесткой термообработки «натуральных» продуктов с целью сохранения их качества.
Биозащита - метод, с помощью которого микроорганизмы и/или их антимикробные вещества, прежде всего бактериоцины, используются для увеличения срока хранения продуктов. МКБ играют определенную роль и при ферментации пищевых продуктов, продлевая срок хранения их по сравнению с нефер-ментированными продуктами.
В настоящее время известно большое количество бактериоцинов. Наиболее известный и изученный бактериоцин - низин А. Результаты новых исследований, опубликованных в 1928, продемонстрировали антимикробную активность Streptococcus lactis против других МКБ. Позднее было установлено, что эта активность обусловлена бактериоцином, низином А. В 1969 году экспертная комиссия по вопросам продовольствия и сельского хозяйства при ООН и Всемирной организации здравоохранения (ФАО/ВОЗ) одобрила использование низина в качестве защитной добавки к пищевым продуктам. В 1988 низину был присвоен статус GRAS (Обще Признанный Как Безопасный) в США. В 1990 Научный комитет по вопросам питания (SCF) при ЕС произвел оценку низина и постановил, что ДСП (допустимое суточное потребление) низина должно равняться 0.13 мг/кг веса в пересчете на препарат с активностью 40000 ME (Scientific Committee for Food, 1990). Сегодня использование низина в пищевых продуктах разрешено в более чем 50 странах, включая Европейский Со-
юз, где низин (Е234) применяется в ограниченных количествах в качестве защитного компонента в ряде продуктов ежедневного потребления таких, как некоторые виды сыров, сливок, пудингов. На сегодняшний день низин является единственным бактериоцином, одобренным и разрешенным для защиты продуктов.
Важным свойством, позволяющим использовать низин в пищевой промышленности, является то, что он быстро распадается в человеческом организме до аминокислот. В силу этого, низин является безвредным консервантом для пищевых продуктов.
Потребность в низине растет пропорционально мировому рынку продовольствия. Только в производстве сыра и йогуртов, традиционной области использования низина, в обороте находятся миллионы долларов. В настоящее время в России потребление низина составляет 3-4 т/год, и потребности постоянно растут. Проявляется интерес к использованию низина и в медицине для подавления патогенных бактерий, устойчивых к «классическим» антибиотикам. Однако низин является относительно дорогим продуктом. В настоящее время розничные цены низинсодержащих препаратов в России составляют около 400 $/кг. Поэтому актуальным является снижение цены низина как за счет повышения продуктивности штаммов-продуцентов низина, так и за счет модернизации технологии процессов ферментации, выделения и очистки бактериоцина.
Цели и задачи исследования.
Целью работы является усовершенствование процесса получения низина А. Для достижения поставленной цели сформулированы следующие задачи:
на основе штамма Lactococcus lactis subsp. lactis получить новый штамм с повышенной способностью к низинообразованию;
провести сравнительную характеристику нового и исходного штаммов L.lactis subsp. lactis по физиологическим и биохимическим признакам;
оптимизировать состав ферментационной среды для выращивания L.lactis путем замены сухого обезжиренного молока на соевую муку, альтернативно более дешевый азотный субстрат;
оптимизировать процесс приготовления ферментационной среды для выращивания МКБ с целью повышения выхода целевого продукта и сокращения времени, затрачиваемого на ультрафильтрацию в условиях промышленного производства низина.
Научная новизна.
1. Определены условия поддержания, штамма в продуктивном состоянии1 в течение длительного времени.
2'. Получен оригинальный штамм Lactococcus lactis subsp. lactis Bcr 75, устойчивый к антибиотику бацитрацину (BcrR-20 мкг/мл), характеризующийся повышенной способностью к низинообразованию при сокращенной продолжительности ферментации.
3. Впервые обнаружено, что мутация устойчивости к бацитрацину L.lactis
привела к:
повышению продукции низина в процессе ферментации;
увеличению скоростей потребления лактозы
устойчивости к 2-деоксиглюкозе и катаболитной репрессии;
устойчивости к окислительному стрессу.
Установлено, что механизм катаболитной репрессии причастенік регуляции, биосинтеза, низина (на примере мутанта, устойчивого к 2-деоксиглюкозе),1 и ослабление катаболитной репрессии - одна из причин повышения продукции низина штаммом L. lactis BcrR75.
Разработан способ подготовки альтернативной среды для выращивания L.lactis, содержащей протеолизат соевой муки, при котором сокращается время приготовления среды и обогащается состав среды необходимыми культуре питательными компонентами.
8 Практическая значимость.
Модифицирован способ поддержания L. Lactis в стабильном продуктивном состоянии длительное время.
Подобрана альтернативная ферментационная среда для L.lactis, содержащая гидролизат соевой муки, что позволяет избежать использования дорогостоящего сырья - молока, и снизить стоимость питательной среды в 4 раза. Себестоимость продукта от использования новой ферментационной среды в технологии получения низина снизилась на 13%.
Подобран эффективный способ подготовки питательной среды для культивирования продуцента низина, при котором сокращается время приготовления среды и обогащается состав среды питательными компонентами.
Замена на стадии осветления ферментационной среды ультрафильтрации 15кДа на микрофильтрацию 0,14 мкм привела к увеличению выхода низина на 25% за счет дополнительного обогащения питательной среды пе-тидами и сокращения времени фильтрации в 1,5 раза.
Новый штамм L.lactis subsp. lactis BcrR75, способный за 15-16 часов ферментации синтезировать до 10-12 тыс. МЕ/мл низина А, апробирован при промышленном производстве низина на предприятии ООО «Фир-ма»Макофарм» (г. Лотошино). Себестоимость продукта от использования нового штамма в технологии получения низина снизилась на 27%.
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы докладывались: на 10 и 11-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых: Биотехнология-наука XXI века, Пущино, 2006, 2007 гг.; на Всеросиискои выставке научно-технического творчества молодежи НТТМ, Москва, 2007 г., на научной конференции студентов и молодых ученых МГУИЭ, Москва, 2008.
9 Публикации.
По теме диссертации опубликовано: 7 печатных работ, из них 1 - статья в сборнике научных трудов МГУИЭ, 1 статья в журнале «Масложировая промышленность», тезисов докладов (5) на научных конференциях.
Данные исследования выполнены в соавторстве с к.б.н. Сергеевой А.В., к.б.н. Мироновым В.А., д.т.н., проф. Бирюковым В.В. и др.
Соискателем были выполнены: постановка задач исследований, основные экспериментальные исследования, обработка данных и обобщение результатов. В селекционных работах и определении биохимических характеристик принимали участие Кудрина Н.И., Петрищева О.А. Обсуждение результатов проводилось совместно с Сергеевой А.В., Мироновым В.А., Бирюковым В.В. Вклад соискателя в работу является определяющим.
Биогенез и свойства низина
Низин - это антибактериальное вещество, бактериоцин, белковой природы, продуцируемое определенными штаммами молочно кислых бактерий Lacto-coccus lactis. Низин принадлежит к первому классу бактериоцинов - лантибио-тикам типа «А» [55, 59, 99,192].
Лантибиотики помимо обычных аминокислот содержат остатки редко встречающихся аминокислот лантионина и 3-метиллантионина, связанных тио-эфирными связями. Поэтому эти бактериоцины именуются «лантибиотиками» [89, 163, 182].
Лантибиотики — рибосомально синтезируемые пептиды, которые образуют поры в цитоплазматической мембране или ингибируют ферменты.
К особенностям лантибиотиков можно отнести 1) принцип их биологического действия, 2) биосинтез, в который вовлечены уникальные ферменты, 3) защита от продуцируемого продукта и 4) применение. На основании структуры и биологического действия лантибиотики подразделяют на 2 подкласса: тип «А» и тип «В» [73, 75, 85, 86, 99, 123, 158].
Лантибиотики типа «А» - это удлиненные полипептиды, бактерицидная активность которых основана на первичном нарушении структуры мембран. Типичными представителями этой группы лантибиотиков являются низин [71], субтилин [70], эпидермин [10] и галлидермин [90]. Существуют три варианта низина - низин А, низин Z и недавно открытый низин Q [124, 197]. Низин А и низин Z отличаются всего лишь одной аминокислотой; в позиции 27 аминокислотной последовательности низин А содержит гистидин, а низин Z - аспарагин [124]. Низин Q и низин А отличаются четырьмя аминокислотами: в положении 15 валин вместо аланина, в положении 21 лейцин вместо метионина, в положении 27 аспарагин вместо гистидина и в положении 30 валин вместо изолеицина, соответственно. Низин Q и низин Z отличаются таким же способом, за исключением того, что в положении 27 оба они содержат аспарагин [197].
Штаммы, использованные в работе
Культурально-морфологическая характеристика штамма Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ В-7966.
На мясопептонном агаре культура образует мелкие выпуклые блестящие колонии серовато-беловатого цвета с ровными краями диаметром до 0,5мм. Клетки овальные кокки до 0,7 х 0,7; 0,7 х 0,9; 1,05 х 1,05 мм в диаметре, реже одиночные, в основном образующие диплококки или цепочки до 4-6-8 клеток. Бактерии грамположительные, спор не образуют, неподвижные, желатину не разжижают, нитраты не восстанавливают, каталазо- и оксидазоотрицательные, сбраживают из углеводов: глюкозу, лактозу, галактозу, ксилозу, сахарозу, мальтозу, арабинозу, слабо - маннозу, рамнозу; из спиртов - сорбит, глицерин; слабо — маннит. Индола, сероводорода - не образует. Молоко быстро свертывают, не пептонизируют, продолжительность свертывания молока при внесении 1% инокулята - 13-14 часов. Факультативный анаэроб, температура выращивания 28-31 С, рН среды 6,8-7,0. Содержание Г+Ц в ДНК варьируется в пределах 33-42 мол.%.
Агаризованные среды для проведения селекционной работы, поддержания и хранения культуры Lactococcus lactis subsp. lactis.
Среда MRS
Среда MRS является полноценной агаризованной средой для поддержания и хранения штамма.
Состав среды MRS (в г/л): мясной пептон (Hi-Media) - 1,0; мясной экстракт (Hi-Madia) - 1,0; дрожжевой экстракт (Франция) - 0,5; глюкоза (ТУ 2.2.9.1313-03) - 2,0; натрия ацетат (чда, ГОСТ 199-78) - 0,5; твин 80 (Испания) - 0,1; гидрофосфат калия (ч, ГОСТ 2493-75) - 0,2; аммоний лимоннокислый 2-замещенный (чда, ТУ 6-09-01-755-89)- 0,2; сульфат магния - 0,02; сульфат марганца (ч, ГОСТ 435-77) - 0,005; агар бактериологический (Испания)- 1,5; вода дистиллированная до 1л; рН до стерилизации 6,4±0,2 (здесь и далее доводят 10% раствором гидроксида натрия). Стерилизация 0,8 ати 30 минут.
Среда Ml 7
Среда Ml7 (Merck, Германия) использовалась для селекции штаммов, устойчивых к антибиотику бацитрацину.
Состав среды Ml7 (в г/л): соевый пептон - 5,0; мясной пептон - 2,5; казеиновый пептон - 2,5; дрожжевой экстракт — 2,5; мясной экстракт - 5,0; D(+) лактоза - 5,0; аскорбиновая кислота - 0,5; Na-P-глицерофосфат - 19,0; сульфат магния - 0,25; вода дистиллированная до 1л; рН до стерилизации 7,2±0,2 (здесь и далее доводят 10% раствором гидроксида натрия). Стерилизация 0,8 ати 30 минут.
Посевная среда.
Состав посевной среды (г/л): молоко сухое обезжиренное (ГОСТ 10970-87) -120; раствор низина 1мг/мл - 20; вода дистиллированная до 1л; рН до стерилизации — 7,0±0,1. Стерилизация 0,5 атиЗО минут.
Ферментационная среда (Фк)
Состав ферментационной среды (г/л): молоко сухое обезжиренное (ГОСТ 10970-87)- - 30; сыворотка сухая кислая (ТУ 9229-014-05268977-98) - 40; про-теолитический фермент алкалаза (Novozimes) - 1; мел химический осажденный (ч, ГОСТ 4530-76)- 50; вода водопроводная до 1л; рН среды до стерилизации -7,5 ±0,1. Гидролиз 4 часа при 30С. Стерилизация 0,8 ати 30 минут.
Модельная ферментационная среда (Фк-мод)
Состав модельной ферментационной среды (г/л): мука соевая (ТУ 9293-001-48386138-99) - 40; сыворотка сухая нейтральная (ТУ 9229-014-05268977-98) -40; протеолитический фермент протосубтилин - 8,4; мел химический осажденный (ч, ГОСТ 4530-76) - 50; вода водопроводная до 1л; рН среды до стерилизации - 7,5 ± 0,1. Гидролиз 4 часа при 30С. Стерилизация 0,8 ати 30 минут.
Схема экспериментальных исследований
В исследованиях был использован штамм L.lactis ВКПМ В-7699 - продуцент низина из коллекции молочнокислых культур, предоставленный ООО ПКФ «БИГОР». Хранение и поддержание культуры в активном состоянии осуществлялось 2-мя способами: лиофилизацией клеток в защитной среде и прямым пассажем в обезжиренном молоке с последующим хранением в холодильнике при температуре 5-10С. Для приготовления партии лиофильно высушенной культуры необходимы специальное оборудование и квалифицированный оператор. Применение метода прямых пассажей в обезжиренное молоко связано с ежемесячным повторением процедуры, что связано с излишними трудозатратами. В связи с вышесказанным была разработана новая модификация способа хранения культуры.
Были испытаны три варианта питательных сред для хранения молочнокислых бактерий:
Среда MDT-бульон [14] Среда MRS-бульон [55] Среда MRS-агаризованная [43], а
в качестве контрольной среды - обезжиренное молоко с добавлением дрожжевого экстракта в количестве 0,02%.
Односуточная культура, выращенная на молоке, использовалась в качестве посевного материала. Количество посевной культуры составляло 10% от объема среды. Ферментации проводили в колбах Эрленмейера. Для ферментации использовали молочную среду, обработанную протеолитическим ферментом алкал азой.
Активность низина определяли биологическим методом (методом диффузии в агар), используя тест-культуру Bacillus coagulans.[7]
Количество жизнеспособных клеток определяли методом поверхностного культивирования высевом на агаризованную среду Ml 7 в чашках Петри.
Количество клеток исходной культуры составляло 5хЮ9КОЕ/мл.
Культуры инкубировали в глубинных условиях в качалочных колбах и в поверхностных условиях (на агаризованных средах в виде «косяков») при 30С в течение 24 часов. Затем культуры оставляли на хранение:
1. Варианты, выращенные на «косяках» и на молоке, хранили при 4С.
2. Изі вариантов, выращенных на MRS-бульоне и MDT-бульоне, готовили глицериновые суспензии, которые хранили в морозильной камере при t = -18C.
Жизнеспособность и низинобразующая способность исследуемых культур проверяли через 10 дней, 1 месяц и 2 месяца хранения.
В качестве контроля использовали односуточную культуру, выращенную на молоке с дрожжевым экстрактом при 30С в течение 24 часов.
В образцах культуры, хранящихся на агаризованной среде, при ежемесячном пересеве наблюдалось падение количества жизнеспособных клеток (данные не представлены). Поэтому этот вариант хранения культур далее не исследовался. Результаты исследований с образцами, выращенными на качалке, представлены в таблице 2:
Похожие диссертации на Интенсивная технология получения низина с использованием мутантного штамма Lactococcus lactis
