Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 10
II.I. Общее строение вириона вируса гриппа и функции вирусных белков 10
II.2. Гемагглютинин вирусов гриппа А, его структура и функции 18
II.2.1. Рецептор связывающий сайт 20
II.2.2. Пептид слияния 22
II.2.3. Участок нарезания гемагглютинина (протеолитисеский сайт) 25
II.2.4. Антигенная структура гемагглютинина 27
II.3. Изменения гемагглютинина в процессе адаптации вирусов гриппа к новому хозяину (на примере адаптации к легким мышей)
III. Материалы и методы 44
III.1. Вирусы 44
III.2. Клетки 45
III.3. Моноклональное антитело С179 46
III.4. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) 46
ІII.5. Нейтрализация инфекционности вирусов в культуре клеток 46
III.6. Пассирование вируса в легких мышей 47
III.7. Титрование инфекционности вирусов на куриных эмбрионах 48
III.8. Титрование инфекционности вирусов на мышах 48
III.9. Получение радиоактивно меченых вирусспецифических белков для реакции радиоиммунопреципитации
III.10. Получение вирусспецифических белков, радиоактивно меченых в пульс - чейз условиях.
III.11. Радиоактивное мечение вирусспецифических белков в присутствии туникамицина
III.12. Реакция радиоиммунопреципитации (РИП) 50
III. 13. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 51
III.14. Определение нуклеотидной последовательности гена НА 51
III.15. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностейгенов НА
III.16. Сравнение аминокислотных последовательностей НА различных штаммов и анализ локализации замен на 3-мерной структуре НА подтипа
III. 17. Пассивная иммунизация мышей МКА С179 и экспериментальная инфекция
IV. Результаты 58
IV. 1. Взаимодействие МКА С179 с вирусами гриппа подтипа Н5 и Н6 58
IV.1.1. Нейтрализация вирусов подтипов Н5 и Н6 моноклональным антителом С179 в культуре клеток
IV.1.2. Распознавание НА подтипов Н5 и Нб МКА С179 в реакции радиоиммунопреципитации (РИЛ) 59
IV.1.3. Влияние созревания НА подтипа Н6 на его распознавание МКА С179вРИП IV. 1.4. Взаимодействие МКА С179 с НА подтипа Н6, меченным в 62
присутствии туникамицина, в РИЛ
IV.1.5. Сравнение аминокислотных последовательностей участков, распознаваемых МКА С179, в НА подтипов HI, Н2, Н5
IV. 1.6. Потенциальные сайты гликозилирования в НА подтипов HI, Н2, Н5 и Нб
IV.2. Адаптация птичьего штамма вируса гриппа A (H5N2) к легким мышей.
IV.2.1. Репродукция вируса в легких мышей в ходе адаптации. 69
Вирулентность адаптированного варианта Mal.dk/PA/84-MA
IV.2.2. Антигенные свойства НА вирусов Mal.dk/PA/84 и Mal.dk/PA/84-MA. Резистентность к а- и р-ингибиторам гемагглютинации
IV.2.3. Анализ первичной структуры НА вирусов Mal.dk/PA/84 и Mal.dk/PA/84-MA IV.2.4. Реакции in vitro МКА С179 с адаптированными к мышам вариантами птичьих штаммов с подтипами НА Н5 и Н2
IV.3. Эксперименты in vivo по профилактике и лечению летальной 79
- Общее строение вириона вируса гриппа и функции вирусных белков
- Нейтрализация инфекционности вирусов в культуре клеток
- Распознавание НА подтипов Н5 и Нб МКА С179 в реакции радиоиммунопреципитации (РИЛ)
Введение к работе
Поверхностный гликопротеид гемагглютинин (НА) является основным антигенным компонентом вирусов гриппа. Вируснеитрализующие антитела, индуцированные гемагглютинином, составляют основу гуморального иммунитета, защищающего организм человека от гриппозной инфекции [Murphy and Webster, 1990]. Антигенная структура гемагглютинина подвержена постоянным изменениям в результате селективного давления иммунной системы организма-хозяина. Это приводит к селекции вариантов вируса, способных избегать нейтрализующего эффекта антител и преодолевать специфическую иммунную защиту человека. Этот же механизм, названный антигенным дрейфом, снижает эффект от противогриппозной вакцинации, основанной, главным образом, на применении цельных и субъединичных инактивированных и живых вакцин [Kilbourne, 1987]. В ситуации же, приводящей к появлению пандемических штаммов вируса гриппа, когда вирус с новым антигенным подтипом НА попадает в человеческую популяцию (антигенный шифт) [Murphy and Webster, 1990; Webster et al., 1992], существующие вакцины могут оказываются неэффективными. Эти факты говорят о необходимости поиска новых подходов для создания вакцин и противогриппозных препаратов с широким спектром активности [Kilbourne, 1999]. Одним из таких подходов может быть поиск и характеризация консервативных антигенных и нейтрализующихся детерминант в молекуле гемагглютинина вируса гриппа, и приготовление соответствующих антител. Такие консервативные детерминанты могли бы входить в состав противогриппозных вакцин, а антитела использоваться для экстренной пассивной иммунизации при противоэпидемических мероприятиях.
Молекулярные исследования антигенной структуры НА показали, что участки, взаимодействующие с антителами, расположены главным образом в НА1-глобулярном домене [Wiley and Skehel, 1987]. Аминокислотные последовательности данных сайтов чрезвычайно вариабельны и различаются не только между подтипами гемагглютинина, но и внутри одного подтипа. С другой стороны, в НА2-субъединице НА были обнаружены консервативные, детерминанты [Graves et al., 1983; Laver et al., 1980; Raymond et al., 1986; Verhoeyen et al., 1980]. Эти данные позволяют предположить, что консервативные антигенные сайты в молекуле НА могут индуцировать антитела с широкой перекрестнонейтрализующей активностью.
Данное предположение было подтверждено исследованиями Y. Okuno и соавт. [Okuno et al., 1993; 1994], которые получили и охарактеризовали моноклональное антитело (МКА) к НА подтипа Н2, обладающее нейтрализующей активностью в отношении штаммов вирусов гриппа подтипов Н2 и HI. Показано, что данное МКА (С 179) распознает конформационный эпитоп в стержневом регионе молекулы НА, консервативный у вирусов гриппа А подтипов Н2 и HI.
Известно, что вирусы гриппа птиц с подтипом НА Н5 и Н6 филогенетически близки к штаммам HI и Н2 подтипов [Air, 1981; Nobusawa et al., 1991]. В данной работе вирусы гриппа HI, Н2, Н5 и Н6 подтипов были исследованы в реакциях с МКА С179. Так же в экспериментах на животных были изучены протективный и терапевтические эффекты этого антитела при летальной бронхопневмонии, вызванной адаптированными к мышам штаммами вируса гриппа с подтипами гемагглютинина HI, Н2 и Н5.
Целью настоящей работы было исследование консервативного эпитопа в стержневом регионе гемагглютинина вирусов гриппа А, общего для филогенетически близких подтипов, и выявление в экспериментах на животных профилактического и лечебного действия моноклонального антитела С179, распознающего этот эпитоп.
Для достижения поставленной цели в ходе исследования решались следующие задачи:
1. Сравнительное исследование взаимодействия моноклонального антитела С179, распознающего консервативный эпитоп в стержневом регионе гемагглютинина, с гемагглютининами подтипов HI, Н2, Н5 и Нб и выявление структурных основ и особенностей его взаимодействия с гемагглютининами разных подтипов.
Получение и характеризация высокопатогенного для мышей, пневмовирулентного варианта вируса гриппа птиц подтипа Н5.
Изучение влияния адаптации вирусов гриппа птиц подтипов Н2 и Н5 к млекопитающим на структуру конформационного эпитопа в стержневом регионе гемагглютинина и его распознавание моноклональным антителом С179.
Определение эффективности моноклонального антитела С179 для защиты и лечения экспериментальной бронхопневмонии, вызванной у мышей вирусами гриппа с подтипами гемагглютинина HI, Н2 и Н5.
Научная новизна и практическая ценность работы.
В результате исследования вирусов гриппа А подтипов Н5 и Н6 в реакциях с МКА С179 обнаружен общий конформационный эпитоп в стержневом регионе НА, аналогичный описанному ранее для вирусов подтипов HI и Н2. Показано, что взаимодействие МКА с гемагглютинином штаммов HI, Н2 и Н5 подтипов нейтрализует инфекционность вирусов. Для вирусов подтипа Н6 показано, что гликозилирование молекулы НА влияет на распознавание МКА С179 конформационного эпитопа и препятствует их нейтрализации.
Для моделирования гриппозной инфекции на мышах получен и охарактеризован адаптированный к мышам вариант непатогенного птичьего штамма с подтипом гемагглютинина Н5. Изучен процесс адаптации непатогенного вируса гриппа птиц к млекопитающему. Определены изменения в НА, сопровождающие преодоление межвидового барьера и приобретение вирулентности для нового хозяина.
Показано, что адаптация вирусов гриппа А птиц с подтипами НА Н2 и Н5 к млекопитающим, приводит к изменениям в аминокислотной последовательности одного из участков конформационного эпитопа в стержневом регионе НА, не влияя на его распознавание МКА С179 и нейтрализацию вирусов.
В экспериментах на животных показано, что применение МКА С179 эффективно для профилактики и лечения летальной бронхопневмонии, вызываемой вирусами гриппа А подтипов HI, Н2 и Н5.
Поскольку вирусы гриппа с подтипом Н2 могут рассматриваться в качестве вероятного донора гена НА для возможного нового пандемического штамма [Webster et al., 1992; Shafer et al., 1993; Govorkova and Smirnov, 1997; Makarova et al., 1999], а вирус подтипа H5 вызвал локальную вспышку среди людей с высоким процентом летальности в 1997 г. [Jong de et al., 1997; Claas et al., 1998; Subbarao et al., 1992], исследования вирусов этих подтипов представляют интерес в практическом аспекте. Полученные данные демонстрируют наличие консервативного перекрестно-нейтрализующегося эпитопа в НА подтипов HI, Н2 и Н5 и показывают эффективность МКА к нему для профилактики и лечения экспериментальной инфекции, вызванной штаммами этих подтипов. Поиск других таких консервативных детерминант может быть одним из перспективных направлений в создании профилактических и лечебных противогриппозных препаратов с широким спектром активности.
Положения, выносимые на защиту. 1. Гемагглютинин вирусов гриппа A, HI, Н2, Н5 и Н6 подтипов, содержит общий, консервативный конформационный эпитоп в стержневом регионе, который распознается МКА С179. Для вирусов гриппа HI, Н2 и Н5 подтипов данный эпитоп является нейтрализующим. Гликозилирование молекулы НА подтипа Н6 влияет на распознавание эпитопа и препятствует нейтрализации вирусов этого подтипа МКА С179.
Серийное пассирование непатогенного вируса гриппа птиц с подтипом НА Н5 в легких мышей приводит к его адаптации и приобретению вирулентности. Процесс адаптации сопровождается постадийными изменениями первичной структуры НА и его антигенносте.
Адаптация вирусов гриппа птиц Н2 и Н5 подтипов к млекопитающим приводит к изменению первичной структуры одного из участков конформационного эпитопа в стержневом регионе НА.
Применение МКА С179 эффективно для профилактики и лечения экспериментальной летальной бронхопневмонии у мышей, вызванной адаптированными вариантами штаммов вируса гриппа подтипов НІ, Н2 и Н5.
Общее строение вириона вируса гриппа и функции вирусных белков
Данный раздел диссертации представляет собой анализ литературных данных о структуре вириона вируса гриппа А, функциях его белков. Большая часть обзора посвящена структуре и функциям гемагглютинина вируса гриппа. Особое внимание уделено изменениям гемагглютинина, происходящим в процессе адаптации вируса к новому хозяину, сопровождающимся приобретением вирулентности.
Вирусы гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae. На основании антигенных свойств главных внутренних белков их разделяют на типы А, В и С. Вирионы вируса гриппа А представляют собой в основном сферические частицы диаметром 80-120 нм, но встречаются также нитевидные, филаментозные и гигантские сферические формы [Smirnov et al., 1991; Roberts et al., 1998]. Вирусные частицы имеют внешнюю оболочку, состоящую из липидного бислоя в который внедрены вирусные гликопротеиды гемагглютинин и нейраминидаза, а также негликозилированный белок М2 [Zebedee and Lamb, 1988]. Внутренний слой оболочки образован матриксным белком [Nermut, 1972; Schulze, 1972]. Внутренняя структура частицы представлена рибонуклеопротеидом, который содержит вирусную РІЖ (геном вируса). Геном вирусов гриппа А состоит из восьми сегментов одноцепочечной РНК, которая является негатив но-нитевой, т.е. комплементарной по отношению к мРНК-последовательности. РНК ассоциирована с нуклеокапсидным белком (NP). Рибонуклеопротеид также содержит три вирусных полимеразных белка (РВ1, РВ2, PA) [Murti et al., 1988].
Сегменты РНК обозначают порядковыми номерами согласно их положению при электрофорезе в полиакриламидном геле: сегмент с наименьшей подвижностью (самый большой по мол. массе) обозначается как сегмент 1, а наиболее быстро мигрирующий (самый маленький по мол. массе) сегмент обозначается как сегмент 8. Восемь сегментов РНК вирусов гриппа А кодируют десять распознаваемых генных продуктов [Lamb, 1983]: белки РВ1, РВ2 и РА (компоненты РНК-зависимой РНК-полимеразы), гликопротеиды вирусной оболочки гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), белок нуклеокапсида NP, матриксный белок Ml, трансмембранный белок М2, неструктурный белок NS1 и белок NS2.
Белки полимеразного комплекса кодируются первыми тремя сегментами генома вируса гриппа А. РНК-сегмент 1 кодирует белок РВ2 который входит в состав белкового комплекса, обеспечивающего вирусную РНК-зависимую РНК-полимеразную активность. Белок РВ2 инициирует транскрипцию вирусной мРНК, распознавая и связывая "кэп" - 5 -концевую структуру мРНК клетки-хозяина (метилированный гуанозин, присоединенный пирофосфатной связью), а также отрезая фрагмент в 10-13 нуклеотидов мРНК клетки-хозяина, к которому присоединен "кэп", для использования этого фрагмента в качестве праймера при синтезе вирусной мРНК [Bouloy et al., 1978; Krug, 1981; Plotch et al., 1979].
Нейтрализация инфекционности вирусов в культуре клеток
Реакцию нейтрализации проводили in vitro стандартным методом, в основе которого лежит подавление МКА цитопатического действия (ЦПД) вирусов в клетках MDCK.
Вирусы были серийно разведены средой DMEM для получения инфекционной дозы 100 ЦПД50 ( 70 БОЕ), и смешаны с различными концентрациями антитела С179. Конечные концентрации МКА были равны 100, 10, 1 и 0,5 мкг/мл. Смесь вирусов с МКА С179 инкубировали при 37С в течение 45 мин. Затем смесь разводили серийными 10-кратными разведениями в среде DMEM, содержащей 0,2% бычьего сывороточного альбумина (Calbiochem, Германия) и 1 мкг/мл трипсина (Sigma, США), и добавляли к отмытому от сыворотки монослою клеток MDCK в 96-луночной панели (100 мкл/лунка). ЦПД определяли в световом инвертированном микроскопе после 72 часов инфекции при 37С в С02-инкубаторе (5% С02).
Распознавание НА подтипов Н5 и Нб МКА С179 в реакции радиоиммунопреципитации (РИЛ)
Взаимодействие МКА С179 с НА подтипа Н5 в РИЛ соответствовало результатам нейтрализации (рис. 4). МКА С179 преципитировало НА подтипа Н5 так же эффективно, как НА подтипа Н2. Другая ситуация наблюдалась при исследовании вирусов с НА подтипа Н6: МКА С179 распознавало НА штамма Mal.dk/Alb./85, который не нейтрализовался данным МКА в культуре клеток и не реагировало с НА вируса Shearw./Austral./72 инфекционность которого МКА частично нейтрализовало (рис. 5; таб. 2). НА подтипа Н7 не преципитировался С179, что подтверждало специфичность реакции (рис. 4, 5). Как видно из авторадиограмм на рисунках 4 и 5, гемагглютинин исследуемых штаммов представлен на них либо широкой диффузной полосой, либо двумя размытыми полосами. Из исследований Е.И. Склянской и соавт. [Sklyanskaya et al., 1980] известно, что при радиоактивном мечении в культуре клеток, НА вирусов гриппа может быть представлен двумя формами: зрелой и не зрелой. При этом в электрофорезе в ПААГ зрелая и незрелая формы могут быть представлены как одной диффузной полосой, так и двумя полосами с незначительной, но определяемой визуально разницей в подвижности. Верхняя часть диффузной полосы (так же как и верхняя полоса, при наличии двух полос) соответствует более тяжелой зрелой форме НА, тогда как легкая, незрелая форма НА соответствует нижней части диффузной полосы или нижней полосе (если НА представлен двумя полосами). У штаммов подтипов Н5 и Н2 МКА преципитирует как зрелую, так и не зрелую формы НА (рис. 4), тогда как у вируса подтипа Н6 Mal.dk/Alb./85, МКА С179 преципитирует только незрелую форму НА (рис. 5).
Результаты РИЛ показывают, что, во-первых, МКА С179 распознает НА подтипа Н5 также как и НА подтипа Н2. Во-вторых, в случае с НА подтипа Н6, МКА реагирует только с незрелой формой НА штамма Mal.dk/Alb./85 и не распознает НА вируса Shearw./Austral./72, что позволило нам сделать предположение о том, что созревание НА может влиять на доступность конформационного эпитопа в НА подтипа Н6.
![Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам [Электронный ресурс]](/i/i/4453/177401.png "Чувствительность эпидемических штаммов вирусов гриппа А и В к химиопрепаратам [Электронный ресурс] Шевченко Елена Сергеевна")