Введение к работе
Актуальность работы. Появившиеся впервые в 1997 году в популяции людей высоко патогенные вирусы гриппа птиц A/H5N1 продолжают распространяться из Азии в Европу и Африку, представляя несомненную угрозу для человечества. (WHO, 29 August 2013). В настоящее время показано, что циркулирующему вирусу достаточно приобрести всего 2-4 мутации в основном поверхностном белке - гемагглютинине (НА), чтобы приобрести способность к аэрозольной трансмиссии среди млекопитающих (Russel et al., 2012). Следствием таких мутаций станет появление штамма, способного вызвать масштабные вспышки, эпидемию или даже пандемию. Вакцинопрофилактика является основным механизмом предотвращения широкого распространения гриппозной инфекции, а главным компонентом противогриппозных вакцин и основной мишенью нейтрализующих вирусспецифических антител является вирусный белок НА. Большинство существующих лицензированных вакцин против вируса гриппа A/H5N1 получают на основе реассортантных вирусов, содержащих поверхностные антигены НА и NA от птичьих вирусов, а остальные гены от донора репродуктивности, вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). В случае возникновения предпандемической ситуации потребуется быстрая наработка вакцины в количестве, необходимом для вакцинации населения всего земного шара. Однако данные реассортанты характеризуются сниженной репродуктивной активностью в куриных эмбрионах (КЭ), являющихся основным субстратом для производства вакцин, и низким содержанием НА в очищенных препаратах (Horimoto et al., 2006, Harvey et al., 2008). Причина этих феноменов до последнего времени оставалась неизвестной. Мы предположили, что одной из причин низкой репродуктивной активности реассортантов может быть несоответствие генов донора репродуктивности и птичьего вируса A/H5N1. Вторым фактором может являться НА высокопатогенных вирусов гриппа птиц, который характеризуется высоким значением рН активации и отличается по этому параметру от всех вирусов гриппа человека (Scholtissek, 1985). Повышенное значение рН, при котором происходит изменение конформации НА, необходимой для обеспечения слияния вирусной и эндосомальной мембран, непосредственно связано с низкой стабильностью нативной структуры НА (Carr et al., 1997).
В данной работе исследуется возможность использования альтернативного донора для получения реассортантов A/H5N1 для производства гриппозных вакцин и изучается возможность повышения количества нативного НА в препаратах ИГВ путем понижения рН активации НА и повышения, таким образом, его стабильности.
Цель исследования: Конструирование и изучение репродуктивных свойств реассортантов A/H5N1, полученных на основе различных доноров, и оценка влияния стабильности гемагглютинина реассортантов A/H5N1 на его содержание в препаратах очищенных вирусов.
Задачи исследования:
-
Конструирование реассортантов, содержащих НА и NA высоко патогенных вирусов гриппа A/H5N1, на основе донора репродуктивности A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с комбинированной структурой генома.
-
Конструирование реассортантов A/H5N1, содержащих мутацию К5821 во второй субъединице НА, и оценка влияния данной мутации на стабильность вирусов и содержание нативного НА в инактивированных вакцинных препаратах.
-
Получение реассортантного штамма A/H5N1 на основе нового высокорепродуктивного и холодоадаптированного донора А/Гонконг/1/68/162/35(НЗШ).
-
Изучение безопасности и специфической активности прототипов живой (ЖГВ) и инактивированной (ИГВ) вакцин, полученных из реассортантного штамма A/H5N1 на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) в модельных экспериментах на животных.
Научная новизна работы.
В результате проведенной работы впервые продемонстрировано влияние рН активации НА высоко патогенных вирусов гриппа птиц A/H5N1 и стабильности нативной конформации молекулы НА на количественное содержание НА в препаратах очищенных инактивированных вирусов.
Впервые в качестве донора внутренних генов для получения реассортанта A/H5N1 был использован холодоадаптированный и высокорепродуктивный штамм А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2). Показана высокая репродуктивная активность, безвредность, иммуногенность и защитная эффективность реассортанта Ast/HK, что подтверждает возможность использования вируса А/Гонконг/1/68/162/35 в качестве единого донора для производства штаммов для ИГВ и ЖГВ.
Практическая значимость работы.
В рамках проведенной работы определен параметр, а именно, стабильность НА, критически влияющий на качество ИГВ. Показана возможность повышения стабильности НА вирусов гриппа A/H5N1 путем введения модифицирующих мутаций во вторую субъединицу НА. Сконструированы реассортантные штаммы Ast58/PR8 и Kur58/PR8, обладающие высокой репродуктивной активностью в КЭ и стабильным НА, которые могут быть использованы для производства ИГВ против потенциально пандемических вирусов гриппа A/H5N1. Получен реассортант Ast/HK, обладающий помимо высокой репродуктивности, фенотипическими признаками аттенуации, который может быть рекомендован как единый вакцинный кандидат для производства ЖГВ и ИГВ против вирусов гриппа A/H5N1.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Использование донора A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с
комбинированной структурой генома при конструировании реассортантов с
поверхностными антигенами высокопатогенных вирусов гриппа птиц
A/H5N1, выделенных на территории России и Казахстана, обеспечивало
преимущество созданных реассортантов перед вакцинным вирусом NIBRG-
14 по репродуктивной активности в КЭ.
-
Понижение рН активации НА путем введения точечной мутации К58—>1 в НА2 повысило устойчивость реассортантов A/H5N1 к воздействию кислой среды и повышенной температуры, и привело к увеличению содержания нативного и иммунокомпетентного гемагглютинина в очищенных инактивированных вирусных препаратах.
-
Реассортантный штамм с поверхностными антигенами высокопатогенного вируса A/H5N1, созданный на основе нового донора А/Гонконг/1/68/162/35, унаследовал от донора свойства аттенуации и превосходил по репродуктивной активности скорости в КЭ реассортант на основе донора A/Puerto Rico/8/34.
-
Экспериментальные препараты ИГВ и ЖГВ, полученные из реассортантного штамма A/H5N1, созданного на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35, обладали высокой иммуногенной и протективной активностью у лабораторных животных. Препарат ЖГВ при интраназальном введении стимулировал выработку мукозальных вирусспецифических антител, обеспечивая полноценную защиту от инфекции.
Личный вклад автора состоит в самостоятельном планировании и проведении всех лабораторных исследований, анализе и статистической обработке полученных результатов. Автором лично получены высокорепродуктивные реассортантные штаммы A/H5N1, а также апробированы прототипы вакцинных препаратов на их основе. Вклад соавторов заключается в антигенной характеристике вирусов гриппа A/H5N1 с диагностическими постинфекционными сыворотками хорьков, а также в получении электронных микрофотографий очищенных вирусов гриппа.
Внедрение результатов работы. Сконструированные автором реассортантные штаммы Ast/HK, Ast58/PR8, Kur/PR8, Kur58/PR8 депонированы в Государственную коллекцию вирусов Российской Федерации на базе ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздрава России под номерами 2626, 2734, 2735, 2736 соответственно. Штамм Ast/PR8 депонирован в коллекцию микроорганизмов НИИ проблем биологической безопасности Республики Казахстан под номером №М-12-09/D. Реассортантный штамм Ast/PR8 использован для производства моновалентной H5N1 инактивированной цельновирионной вакцины с алюминием «KAZFLUVAC», которая была зарегистрирована в качестве профилактического средства защиты населения в возрасте от 18 до 60 лет от
гриппа А подтипа H5N1 (регистрационное удостоверение РК-БП-3№019910 от 28.05.2013).
Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на Международной научной конференции студентов и молодых учёных «Молодёжь — медицине будущего» (Одесса, Украина, 28-29 апреля 2011 года), Международной конференции «The Fourth ESWI Influenza Conference» (Мальта, 11-14 сентября 2011 года), II всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 12 - 14 ноября 2012 года), Конференции молодых специалистов «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» (Санкт-Петербург, 24-25 октября 2012 года), Международной конференции «Options for the Control of Influenza VIII» (Кейптаун, ЮАР, 5-10 сентября 2013 года).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 1 научный обзор и 5 статей в реферируемых журналах и сборниках научных статей (из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК), 1 заявка на изобретение РФ и 6 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 144 страницах текста, включая 14 таблиц, 32 рисунка и 4 приложения. Список цитируемой литературы содержит 192 источника. Из них 18 отечественных и 174 иностранных.
Работа поддержана грантом правительства Санкт-Петербурга 2009 года для студентов и аспирантов № 2.6/30-04/083, субсидией правительства Санкт-Петербурга 2012 года для молодых ученых № 34/13-07/50МУ, а также грантом ФГБУ «Российский фонд фундаментальных исследований» для молодых ученых № 12-04-31397.
