Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Инфекционная бурсальная болезнь птиц 11
1.2. Характеристика вируса 12
1.3 Патогенез и связь с другими болезнями 24
1.4. Особенности и проблемы специфической профилактики ИББ 29
1.5.Новые направления в иммунопрофилактике ИББ 42
2. Собственные исследования 46
2.1. Материалы и методы 46
2.1.1. Характеристика использованных материалов 46
2.1.2.Культура клеток 48
2.1.3. Выделение и титрование вируса 48
2.1.4. Серологические методы 50
2.1.5. Контроль на безвредность 50
2.1.6.Контрольна иммуногенность 51
2.1.7. Устойчивость к физико-химическим факторам 52
2.1.8. Реверсибельность и стабильность свойств вируса 52
2.1.9.Проверка на контаминацию 53
2.1.10. Определение инфекционной активности 54
2.1.11.Эффективность иммунизации 55
2.1.12. Отсутствие иммунодепрессивных свойств 55
2.1.13 Методы очистки и концентрирование вируса 55
2.1.14. Проверка стабилизирующих свойств сред высушивания 56
2.1.15. Статистическая обработка результатов 56
2.2. Результаты исследований 57
2.2.1. Сравнительное изучение иммунобиологических свойств вакцинных штаммов вируса ИББ 57
2.2.2.Репродукция вируса в эмбрионах птиц 61
2.2.3. Репродукция в культурах клеток 69
2.2.4. Антигенная активность вакциноого штамма 74
2.2.5. Проверка штамма КБК на стабильность и безвредность 76
2.2.6. Иммуногенная активность вакцинного штамма КБК 80
2.2.7. Иммунодепрессивная активность штамма КБК вируса ИББ 86
2.2.8. Термостабильность и устойчивость к действию различных физико-химических факторов штамма КБК вируса ИББ 90
2.2.9. Гемагглютинирующая активность 95
2.2.10. Морфология и структура штамма КБК вируса ИББ 97
2.2.11 Нуклеотидное секвенирование генома 98
2.2.12. Комиссионная проверка вакцинного штамма КБК 100
2.3. Изучение экспериментальных серий вакцины из штамма КБК в лабораторных условиях 101
2.3.1. Изучение иммуногенности вакцины из штамма КБК при различных методах введения 101
2.3.2.Изучение сроков наступления и продолжительности иммунитета 105
2.3.3. Ассоциированная вакцинация против ИББ и болезни Марека 107
2.3.4. Изучение эффективности вакцины в полевых условиях 111
3. Обсуждение и заключение 117
Практические рекомендации 134
Выводы 135
Список литературы 136
Приложение 156
- Особенности и проблемы специфической профилактики ИББ
- Устойчивость к физико-химическим факторам
- Сравнительное изучение иммунобиологических свойств вакцинных штаммов вируса ИББ
- Изучение иммуногенности вакцины из штамма КБК при различных методах введения
Введение к работе
Актуальность проблемы. Инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) -высококонтагиозная вирусная болезнь птиц, преимущественно 2-15 недельного возраста, характеризующаяся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями и диареей. Вирус ИББ поражает В-лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая тем самым атрофию ее лимфоидных фолликул. В течение последних десяти лет ИББ была зарегистрирована практически в большинстве крупных птицеводческих хозяйств нашей страны.
Экономический ущерб от ИББ очень велик, он обусловлен гибелью ( 20-70%) цыплят при остром течении заболевания, значительной выбраковкой птицы, снижением продуктивности, а также вследствие возникновения вторичных инфекций. Многие крупные промышленные птицеводческие хозяйства в течение ряда лет остаются стационарно неблагополучными по ИББ. Это связано с тем, что вирус ИББ обладает выраженной устойчивостью к факторам внешней среды.
Наиболее эффективным и важным противоэпизоотическим мероприятием, применяемым для ликвидации и профилактики инфекционных болезней, является вакцинация. Для специфической профилактики ИББ во всех странах, в том числе и в России, используют живые и инактивированные вакцины. Как правило, вначале цыплят прививают двукратно живыми вакцинами, а в возрасте 16-20 нед -инактивированной вакциной [140].
Программа профилактики ИББ широко и успешно применялась во многих странах в течение ряда лет. Однако в 1987 г. в Англии, а затем и в других странах, в том числе и в России, появились сообщения о выделении высоковирулентных штаммов вируса ИББ [2, 34, 92]. Эффективность ранее применяемых вакцин против ИББ оказалась недостаточной, это потребовало поиска новых подходов по разработке программ специфической профилактики ИББ. Так, в Бельгии была отменена иммунизация родительского стада инактивированной вакциной против ИББ, что позволило максимально снизить уровень материнского иммунитета в суточном возрасте и применить уже апробированные вакцины на выводе цыплят, которые обеспечивали своевременное формирование напряженного иммунитета до момента заражения птицы полевым вирусом [261].
В ряде стран, в том числе и в России, для профилактики ИББ в неблагополучных хозяйствах стали применять препараты из "жестких" вакцинных штаммов вируса ИББ. Особенностью этих вакцин является способность преодолевать материнский иммунитет и активно конкурировать с полевым вирусом ИББ, что позволяет купировать инфекцию за короткий промежуток времени. Однако вакцины из «жестких» штаммов имеют существенные недостатки, связанные с их высокой реактогенностью, проявляющейся атрофией фабрициевой сумки, поражением почек и отрицательным влиянием на рост и развитие птиц [16, 24, 32, 37]. Кроме того, применение вакцин из "жестких" штаммов ограничивается двумя-тремя партиями, а иммунизацию цыплят рекомендуется проводить, начиная с 10-15- дневного возраста.
В настоящее время в нашей стране для профилактики ИББ используются вакцины из «промежуточных» штаммов вируса ИББ (Д-78, ВНИВИП, Бюр S-706, Winterfield 25-12 и другие). Для изготовления указанных вакцин полуфабрикат получают путем репродукции вакцинного вируса в первичной культуре фибробластов эмбрионов кур. В специальной литературе существуют убедительные данные, свидетельствующие о более низкой иммуногенной активности вакцин, приготовленных из «промежуточных» штаммов, репродуцированных в культуре клеток, по сравнению с эмбриональным вариантом препарата [40, 154].
В связи с изложенным, исследования по выделению новых штаммов, разработке совершенных вакцин против ИББ и внедрение их в ветеринарную практику, несомненно, являются актуальными.
Цель и задачи исследования. Целью исследований являлось создание и оценка иммуногенной активности вакцины и внедрение в практику новой отечественной вирусвакцины против ИББ. В соответствии с этим решали следующие задачи:
• Сравнительная оценка иммунобиологических свойств вакцинных штаммов и изолятов вируса ИББ, выделенных в птицеводческих хозяйствах страны.
• Разработка технологических параметров изготовления и контроля вакцины на основе актуального штамма вируса ИББ.
• Определение эффективности разных методов иммунизации цыплят против ИББ.
• Изучение возможности ассоциированной вакцинации птиц против ИББ и болезни Марека БМ
• Оценка профилактической эффективности новой вакцины в экспериментальных и полевых условиях.
Научная новизна.
• Определены иммунобиологические и генетические свойства вакцинного штамма КБК вируса ИББ, экспериментально подтверждены его преимущества и целесообразность использования в качестве основного специфического компонента новой вакцины. Штамм паспортизирован и депонирован под № 117-ДЕП 15.10.2001г. во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, в качестве производственного.
• Установлены параметры репродукции штамма КБК в эмбрионах СПФ-кур, позволяющие стабильно получать высокоактивный виру ссод ержащий материал.
• Определены оптимальные технологические режимы изготовления и методы контроля лиофилизированной вакцины против ИББ
из штамма КБК, подтверждена её эффективность в лабораторных и полевых условиях.
• Обоснована возможность применения и высокая иммуногенная активность вакцины из штамма КБК для цыплят раннего возраста.
• Показана эффективность однократной сочетанной вакцинации суточных цыплят против ИББ и БМ.
• Вакцина против инфекционной бурсальной болезни птиц из штамма КБК признана изобретением (патент РФ № 2205021 от 27.05.2003 г.).
Практическая значимость. Предложена новая вакцина для иммунопрофилактики ИББ, серийное производство которой организовано в ФГУП «Курская биофабрика» и ООО «Биовет».
Разработаны и утверждены в установленном порядке комплект нормативной документации: «Вирусвакцина против инфекционной бурсальной болезни из штамма КБК сухая» (ТУ 9384-051-00482909-2003 от 07.05.2004); Временное наставление по применению (№ 13-3-04/1071 от 07.05.2004); Регламент производства вакцины от 23.10.2002.
Положения, выносимые на защиту.
• Характеристика иммунобиологических свойств вакцинного штамма вируса ИББ.
• Технологические параметры получения вируссодержащего материала, методов стабилизации контроля живой вакцины против ИББ из штамма КБК.
• Результаты лабораторных и полевых испытаний вакцины против ИББ из штамма КБК.
• Эффективность сочетанной вакцинации суточных цыплят против ИББ и БМ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции по проблемам эпизоотологии и инфекционных заболеваний (Одесса, 2 003), на юбилейной научно-практической конференции, посвященной 35-летию ГУ Прикаспийского зонального научно-исследовательского ветеринарного института (Махачкала,2003), научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (Санкт-Петербург,2004.), международной научно-практической конференции «Современные аспекты разработки, маркетинга и производства ветеринарных препаратов» (Феодосия АР Крым, 2004), на международной юбилейной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве» (Санкт-Петербург-Ломоносов, 2004), на заседаниях специальной комиссии по проблемам вирусных болезней методического и Ученого Советов ВГНКИ (2001-2004), а также на межлабораторном совещании ФГУ «ВГНКИ» (2004 г).
Публикация научных исследований. Основные положения диссертации изложены в комплекте НД на вакцину против ИББ из штамма КБК, а также в 9 научных работах, включая Патент РФ на изобретение.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 169 страницах машинописного текста и содержит традиционные разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 6 рисунками. Список литературы включает 298 источников, в том числе 259 зарубежных.
Особенности и проблемы специфической профилактики ИББ
Профилактика ИББ, как и других инфекционных заболеваний птиц, основана на соблюдении ветеринарно-санитарных правил, особенно строго в племенных птицеводческих хозяйствах. Однако, по мнению многих авторов, обеспечить эпизоотическое благополучие птицепредприятий по ИББ путем проведения одних только ветеринарно-санитарных мероприятий, улучшения условий содержания и кормления птиц крайне сложно [5, 6, 18].
Применение лекарственных препаратов в профилактике ИББ не имело успеха [102], хотя это и понятно, поскольку речь идет о вирусной инфекции, при которой использование средств химиотерапии оправдано лишь для предупреждения развития вторичных инфекций, особенно бактериальной этиологии [85].
В лабораторных условиях положительные результаты по профилактике заболевания были получены при введении птицам сыворотки реконволенсцентов или молозива коров, иммунизированных вирусом ИББ, однако использование данного метода в широких масштабах по борьбе с этой инфекцией не увенчалось успехом [91, 159, 259, 308].
В настоящее время во всех странах признано, что единственно правильным и надежным направлением профилактики данной инфекции является применение вакцинных препаратов [22, 47]. Для специфической профилактики ИББ применяют живые и инактивированные вакцины [48, 61, 64, 100, 127, 128, 137, 153, 173, 194, 197, 231, 255, 271, 274, 298].
Первые попытки по специфической профилактике ИББ предприняли с помощью живой вакцины в виде суспензии фабрициевых сумок цыплят, экспериментально зараженных вирусом [117]. Пероральное или окулярное введение ее цыплятам 3-12-дневного возраста позволило снизить потери, связанные с ИББ, хотя и в данном случае речь идет не о настоящей вакцинации птиц с помощью живой вакцины, а лишь о заражении их под наблюдением ветеринарного специалиста.[167]. C.Snedeker et al [239] при испытании 8-го пассажа вируса ИББ на куриных эмбрионах установили, что у 7-10-дневных цыплят вирус вызывает слабо выраженные признаки заболевания, но иммунитет у птиц формировался достаточно напряженный и сохранялся на протяжении 9 недель.
Успешное создание вакцинных препаратов против того или иного возбудителя и эффективное их использование в практике в значительной мере связано с особенностями пато- и иммуногенеза конкретной инфекции. Основная особенность ИББ состоит в том, что у переболевшей птицы развивается вторичный иммунодефицит [43, 46, 51, 74, 91, 75, 186, 223]. Наиболее уязвимыми при ИББ, как уже указывалось, являются цыплята 3-6-недельного возраста [222, 237].
Трудности создания высокоэффективного препарата при ИББ связаны со сложностью понижения иммунодепрессивного действия пассируемого вируса, не снижая его иммуногенной активности, и определения предельно допустимого уровня пассирования полевого вируса до получения штамма со стабильными авирулентными свойствами [44]. Это положение является принципиально важным и имеет большое практическое значение, так как вакцинация против ИББ, наряду с предупреждением прямых экономических потерь, обусловленных самой болезнью, одновременно обеспечивает сохранность структуры и функции иммунокомпетентного органа птиц в случае воздействия на него полевого вируса [54, 88]. Это, в свою очередь, гарантирует стабильность поствакцинального иммунитета против других инфекционных болезней птиц.
Исследованиями, проведенными R.W.Winterfield et al [270, 272, 275], установлено, что изолят вируса ИББ на уровне 50-го пассажа является слабовирулентным, иммуногенным. Вирус был обозначен как штамм "2512". Окулярное, пероральное и аэрозольное введение штамма цыплятам 7-суточного возраста и старше способствовало выработке вируснейтрализующих антител. Индекс нейтрализации в сыворотке крови в опытной группе цыплят через 21 сутки после их прививки на 2 log был выше, чем в контрольной. Все вакцинированные цыплята были устойчивы к контрольному заражению вирусом ИББ.
Вакцина из штамма "244" получена серийными перемежающимися пассажами на СПФ-эмбрионах кур и новорожденных мышатах. Гомогенат тушек мышат, зараженных вирусом ИББ, при пероральном введении 3-4-суточным цыплятам вызывал напряженный иммунитет продолжительностью не менее 24 недель [75]. D.Lukert etal [196] приводят результаты лабораторных испытаний двух экспериментальных вакцин против ИББ. Первая вакцина авторами получена путем адаптации вируса к культуре клеток почек куриных эмбрионов, а вторая - к гетерологичным клеткам типа "Vero". Изучение иммуногенных и реактогенных свойств полученных вакцин показало, что штамм, аттенуированный на культуре почек эмбрионов кур, обеспечивает защиту птиц, хотя при этом вызывает некоторые поражения фабрициевой сумки, в то время как другой штамм, адаптированный к клеткам "Vero", оказался безвредным, но иммуногенность его была установлена только при внутримышечном введении.
В Италии получен вакцинный штамм путем пассирования полевого вируса на куриных эмбрионах. Полная аттенуация вируса наступила после 60-го пассажа. Введение его цыплятам не вызывало клинику заболевания, изменений в фабрициевой сумке и стимулировало образование вируснейтрализующих антител через 7 суток после дачи вакцины. Результаты многократных пассажей на восприимчивых цыплятах показали стабильность иммуногенных свойств полученного штамма [85, 86].
В ЧССР разработана и широко апробирована вирусвакцина против ИББ из штамма Z-2037 [83, 84]. Аттенуация вируса была достигнута после проведенных 10 пассажей на СПФ-эмбрионах кур и 27 пассажей в культуре куриных фибробластов. Вирус успешно репродуцируется в первичной культуре фибробластов и почек эмбрионов кур, вызывая характерную картину цитопатологии в виде очаговой мелкозернистой дегенерации в цитоплазме пораженных клеток. Биологическая активность штамма составляет 5 Ig ТЦД /мл. Препарат безвреден для всех возрастных групп птиц. Хранение его в лиофилизированном состоянии в течение года не приводит к снижению основных показателей, характеризующих биопрепарат.
Устойчивость к физико-химическим факторам
Устойчивость штамма КБК вируса ИББ к воздействию температуры 37С в течение 7 суток и +50С в течение 1 ч определяли путем титрования вируссодержащеи культуральнои жидкости в культуре ФЭК. Устойчивость вируса к воздействию эфира и хлороформа изучали путем титрования вируссодержащеи культуральнои жидкости на культуре ФЭК после обработки ее жирорастворителями в 20% концентрации. Контролем служила вируссодержащая культуральная жидкость, не подвергавшаяся обработке указанными жирорастворителями. Реверсибельность и стабильность иммунобиологических свойств вакцинного штамма КБК определяли 8 пассажами на цыплятах, полученных от СПФ-кур. Результаты гистологических исследований оценивали по степени интенсивности поражения фабрициевой сумки согласно классификации G.W.Wood et al. [276], в которой предусматривается: 0 - норма; 1 - легкий некроз лимфоцитов, незначительное уменьшение лимфоцитов в отдельных узелках; 2 - легкое генерализованное уменьшение лимфоцитов в узелках; 3 - свыше 50% показывают полную потерю лимфоцитов, появляются слизистые кисты; 4 - остаются только контуры узелков, увеличение соединительной ткани; 5 - потеря общего узнаваемого строения лимфатических узелков, фиброплазия. На всех этапах исследований вируссодержащий материал проверяли на стерильность путем высева по 0,25 мл вирусной суспензии в две пробирки с мясопептонным агаром (МПА), мясопептонным бульоном (МПБ), мясопептонным печеночным бульоном под вазелиновым маслом (МППБ) и среду Сабуро. Питательные среды с посевами выдерживали в течение 10 суток в термостате при 37-38С (среду Сабуро - 20-24С). Контроль на контаминацию микоплазмами проводили на специальных питательных средах. Проверку вируса на отсутствие контаминации гемагглютинирующими вирусами проводили путем постановки реакции гемагглютинации с эритроцитами петуха.
Проверку вируса на отсутствие контаминации вирусом инфекционного бронхита и аденовирусами птиц проводили заражением в аллантоисную полость эмбрионов СПФ-кур 9-10-дней инкубации в объеме 0,2 мл. Предварительно к вируссодержащей жидкости добавляли специфическую иммунную сыворотку кур в равном объеме. Полученную смесь оставляли на контакт в течение 1 ч при комнатной температуре. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубировали в течение 10 дней при 37,5С и относительной влажности 60-70%. Эмбрионы просматривали ежедневно на овоскопе. Погибшие в течение 24 ч после заражения не учитывали. Все эмбрионы, павшие со 2 по 10-й день, а также оставшиеся в живых через 10 дней после инокуляции исследуемого материала, вскрывали и просматривали на наличие изменений, характерных для инфекционного бронхита и аденовирусной инфекции. Контроль на отсутствие вируса оспы и инфекционного ларинготрахеита проводили путем заражения 10-11-дневных эмбрионов на ХАО смесью вируса с иммунной сывороткой в объеме 0,2 мл. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубировали в горизонтальном положении в течение 7 дней при 37,5С и относительной влажности 60-70%. Контроль на отсутствие вируса болезни Марека и энцефаломиелита проводили путем заражения 5-7 дневных эмбрионов в желточный мешок смесью вируса с иммунной сывороткой в объеме 0,2 мл. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубировали в течение 10 дней при 37,5С. Электронно-микроскопические и гистологические исследования проводили совместно с главным научным сотрудником ВНИВИП Бакулиным В. А. Препараты в электронном микроскопе исследовали методом негативного контрастирования. Для проведения патоморфологических исследований кусочки клоакальных сумок фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина и готовили парафиновые срезы. Гистосрезы окрашивали гематоксилин-эозином. Инфекционную активность расплодок штаммов, а также образцов вакцины определяли титрованием на 10-11-суточных СПФ-эмбрионах кур и культурах клеток по общепринятым методикам, титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча. Отсутствие иммунодепрессивных свойств оценивали серологически по уровню поствакцинальных антител к вирусу НБ согласно методике, описанной в работе Алиева А.С [3]. Принцип метода основан на неспособности штаммов вызывать атрофию фабрициевой сумки с проявлением признаков иммунодефицита, выражающегося в ослаблении индукции антител к другим антигенам, в частности, к вирусу НБ. Очистку полученных расплодок проводили методом градиентного центрифугирования, включающим следующие стадии: замораживание-оттаивание, гомогенизация 10-20% вирусной суспензии в TN-буфере (50мМ Трис, рН 7,6, 10 мМ NaCl ) в присутствии 10% трифтортрихлорэтана (фреон 113), низкоскоростное центрифугирование (5 мин. при ЮОООоб./мин на центрифуге "Bekman"), осаждение осветленной вирусной суспензии центрифугированием через 30% раствор сахарозы, приготовленный на TN-буфере (3 часа при 25000 об./мин на центрифуге "Sorvall") с последующей очисткой вируса центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия (1,45 г/см) (6 часов при 23000 об./мин). После диализа очищенный вирус концентрировали ультрацентрифугированием при 48000 об/мин в течение 1 часа; Проверку стабилизирующих свойств сред высушивания определяли методом "ускоренного старения" путем прогревания лиофилизированного вируса при температуре 37С в течение 7 суток. Результаты оценивали по сохранности инфекционной активности. Использовали стандартные методы статистической обработки, общепринятые в биологии [12, 23, 58]. Достоверность различия между средними показателями определяли по критерию Стьюдента уровнем значимости р. При р 0,05 результаты считались недостоверными, при р 0,05 и р _0,01 -достоверными.
Сравнительное изучение иммунобиологических свойств вакцинных штаммов вируса ИББ
В течение ряд лет проведена работа по адаптации к эмбрионам СПФ-кур изолята вируса ИББ с целью получения аттенуированного штамма с высокими иммуногенными свойствами, ареактогенного и безвредного для цыплят любого возраста при различных способах его применения. Исходным материалом послужил гомогенат фабрициевых сумок больных цыплят-бройлеров 30-35-дневного возраста, полученный в 1992 г. на птицефабрике «Сосновская» Челябинской области. Заболеваемость цыплят на птицефабрике среди некоторых партий составляла до 20 % и были отмечены случаи дерматитов в области спины, крыльев и, реже, конечностей. Переболевшие партии цыплят имели крайне низкий уровень антигемагглютининов (1:2-1:8) к вирусу Ньюкаслской болезни через 14-21 день после вакцинации.
При патологоанатомическом вскрытии трупов цыплят и гистологическом исследовании фабрициевых сумок наблюдались изменения, характерные для ИББ. Наличие вирусного антигена в патологическом материале было подтверждено в РДП со специфической иммунной сывороткой.
Вирусологическими исследованиями в лабораторных условиях нами выделен изолят, который был идентифицирован как вирус ИББ. При постановке биопробы на цыплятах чувствительного возраста было установлено, что выделенный изолят вызывал слабо выраженную клиническую картину заболевания, но патологоанатомически были выявлены изменения, свойственные ИББ. В дальнейшем наши исследования были направлены на планомерную адаптацию и аттенуацию выделенного изолята к СПФ-эмбрионам кур путем 50-ти последовательных пассажей. Степень адаптации вируса к эмбрионам СПФ-кур оценивали путем определения биологической активности вируссодержащего материала через 5-, 10-, 20-, 30-, 40- и 50- пассажей (табл.2).
Как следует из данных в табл.2, биологическая активность вируса в гомогенате фабрициевых сумок больных цыплят при первичном выделении на эмбрионах СПФ-кур составляла 2,5 lg ЭИД5о/См3 и по мере увеличения количества пассажей на куриных эмбрионах имела тенденцию к повышению. На 20-ом пассаже титр вируса достиг 6,0 lg ЭИД5о/см3 и сохранялся на этом уровне вплоть до 50-го пассажа, что свидетельствует об адаптации вируса к данной системе. Подтверждением адаптации вируса к СПФ-эмбрионам также служат данные по срокам выживания эмбрионов после заражения вирусом (табл.3).
Известно, что в условиях постоянной смены одной популяции частиц вируса другой, наряду с приспособлением возбудителя к новым условиям, происходит интенсивный отбор, сопровождающийся устойчивой и необратимой изменчивостью патогенных свойств вируса по отношению к естественному хозяину. Следует полагать, что на определенном этапе последовательных пассажей на эмбрионах СПФ-кур выделенный вирус мог снизить свою патогенность для цыплят, сохранив при этом высокие иммуногенные свойства. Для получения ответа на данный вопрос был проведен опыт на 70-ти цыплятах в возрасте 30 дней. Вируссодержащий материал 5-; 10-; 20-; 30-; 40- и 50-го пассажей, разведенный 1:10, вводили интраназально в объеме 0,3 мл на голову. В опыте было использовано 60 цыплят по 10 голов в каждой группе. В контроле оставили 10 цыплят, которым ввели 0,3 мл физиологического раствора. Через 7 суток часть цыплят (по 5 голов) убивали для выявления патологоанатомических и патологоморфологических изменений. У оставшейся части птицы брали кровь на 21-ые сутки опыта для исследования в РН, РДП и ИФА. Результаты данного опыта приведены в табл.4.
При этом установлено, что слабо выраженные клинические признаки заболевания у цыплят отмечаются при введении вируса 10-го пассажа, однако типичные морфологические изменения в фабрициевой сумке отмечаются у цыплят, которым был введен вирус ИББ на уровне 30-ого пассажа. Наиболее существенным моментом этих исследований оказалось отсутствие отрицательного влияния вируса 50-го пассажа на цыплят чувствительного возраста и выраженное проявление его антигенных свойств, что было подтверждено нами серологическими исследованиями.
Эмбрионы СПФ-кур, зараженные исследуемым штаммом на уровне разных пассажей, как правило, погибают на 3-6 день после заражения на хориоаллантоисную оболочку. У павших эмбрионов отмечали разлитые геморрагии на коже, в области головы, шеи и конечностей. Наиболее характерные изменения отмечали на печени в виде некротических очажков желтовато-зеленого цвета, расположенных по всей поверхности и в паренхиме органа.
Биологическая активность штамма вируса ИББ на эмбрионах СПФ-кур на уровне 50-го пассажа составила 6,0-6,5 lg ЭИД so/см3- Заражение культуры клеток вируссодержащим материалом от зараженных эмбрионов показало, что штамм активно репродуцируется в культуре клеток, вызывая четкий цитопатический эффект. Согласно данным литературы, при изготовлении вакцин против ИББ пригодны только эмбрионы СПФ-кур или полученные из них культуры клеток. В связи с отсутствием в России СПФ-кур и ограниченностью получения их из-за рубежа, настоятельно требовалось выяснить возможность культивирования вакцинных штаммов ВИББ на других биологических моделях. Для этого были испытаны эмбрионы разных видов птиц, а также некоторые первичные культуры фибробластов куриных эмбрионов и перевиваемые культуры клеток. Разработка и испытание эффективных средств специфической профилактики заболеваний птиц связаны с наличием в достаточном количестве вируссодержащего материала, обладающего биологическими свойствами эталонного вируса. Наиболее важным условием при этом является подбор чувствительной системы, обеспечивающей высокий урожай вируса и тождество антигенного состава эпизоотического и вакцинного штаммов. Кроме того, успех разработки средств специфической профилактики и их внедрение в производство требует детального изучения основных иммунобиологических свойств возбудителя. В первую очередь следует изучить вопросы культивирования вируса в различных системах и характера изменений в них, наступающих при этом, а также вопросы патогенеза и иммуногенеза при данной инфекции. В дальнейшем для полной гарантии безопасности вакцинного штамма необходимо проведение всесторонних исследований, подтверждающих стабильность биологических и иммуногенных свойств вируса, предлагаемого для производства вакцины. В экспериментах использовали ранее предложенные вакцинные штаммы Cu-1M, ST, Д-78 и предлагаемый нами штамм КБК. Целью опытов являлось выяснение репродуктивной способности штаммов при пассировании их в эмбрионах кур, уток в сравнении с эмбрионами СПФ- кур.
Изучение иммуногенности вакцины из штамма КБК при различных методах введения
В отечественной и зарубежной литературе нет единого мнения в оценке эффективности разных методов вакцинации против ИББ [139, 215]. В этой связи были проведены исследования по оценке эффективности различных методов вакцинации против ИББ.
Для определения оптимальной дозы вакцины, обеспечивающей напряженный иммунитет при пероральной, интраназальной, интраокулярной и подкожной иммунизации были сформированы 3 группы птиц (п=10) на каждый метод вакцинации. Иммунизацию проводили однократно исследуемой вакциной в дозах 2.0, 2.5, и 3.0 lg ЭИД 5о/см3. Спустя 3 нед после вакцинации сыворотки крови цыплят исследовали в ИФА и РДП, а цыплят заражали вирулентным штаммом 52/70-М. Наблюдения вели в течение 15 дн. Из данных, приведенных в табл. 26, следует, что для формирования напряженного иммунитета у цыплят при пероральном применении вакцины оптимальной была доза 2,5 lg ЭИД so/см3, при других методах иммунизации - 2,0 lg ЭИД 5(/см3. При подкожном введении вакцинного штамма КБК вируса ИББ в дозе 2,0 lg ЭИД so/см напряженный иммунитет регистрировали у 100% цыплят на 21-е сут. Среднеарифметический титр специфических антител в ИФА тесно связан с методом введения препарата. Интраназальное, окулярное и пероральное применение препарата вызывало накопление антител в ИФА не менее - 850, а подкожное -980.
Среднеарифметическое значение специфических антител в ИФА в сыворотке крови вакцинированных цыплят имеет положительную коррелляцию с дозой вакцины и служит показателем их устойчивости к заражению вирулентным штаммом вируса ИББ. При титре антител в ИФА ниже значения - 500 уровень защиты был невысокий, а при титре 850 и выше наблюдали большую степень устойчивости птицы к заражению вирулентным вирусом. Специфические антитела в ИФА в разведении 850 и выше отмечали при интраназальной, окулярной и подкожной вакцинации в дозе - 2,0 lg ЭИД so/см3, а при пероральном -2,5 lg ЭИД 5(/см3. Аналогичную взаимосвязь выявили между уровнем специфических вируспреципитирующих антител в сыворотке крови цыплят и устойчивостью последних к контрольному заражению вирулентным вирусом. При постановке биопробы все цыплята, сыворотка крови которых (даже в неразведенном виде) положительно реагировала в РДП с антигеном вируса ИББ, проявляли 100 %-ную устойчивость.
Известно, что успех иммунизации птиц зависит не только от вакцины, но и от состояния иммунологической реакции организма птиц на вакцину, которая подвержена влиянию многих факторов. Одним из таких факторов, влияющих на формирование активного иммунитета у цыплят, является наличие пассивного иммунитета и его напряженность. У цыплят, полученных от вакцинированной или переболевшей птицы, вируснейтрализующие антитела в сыворотке крови выявляются до 17-28-дневного возраста [93, 266, 268, 269], которые частично или полностью нейтрализуют вакцинный вирус. В этой связи многие исследователи [150, 215, 225, 244, 245] указывают, что при вакцинации таких цыплят формируется недостаточно напряженный поствакцинальный иммунитет, что требует многократное применение вакцинных препаратов. В этой связи возникла необходимость в оценке иммуногенной активности вакцинного штамма КБК в зависимости от кратности и способа иммунизации. Результаты этих опытов приведены в табл. 27.
Установлено, что только при подкожном методе введения однократное применение вакцины создает напряженный иммунитет и обеспечивает защиту всех вакцинированных цыплят. При контрольном заражении на 14-16-ый дн после второй вакцинации у всех цыплят, кроме иммунизированных пероральным способом, отмечали устойчивость к вирулентному штамму вируса ИББ в 100% случаев. Среднеарифметическое значение титров антител в ИФА при однократном подкожном применении составил 1020, а при всех остальных методах иммунизации не превышало 850 даже при двукратной вакцинации.
Уровень специфических вируспреципитирующих антител в сыворотке крови цыплят при двукратной вакцинации не зависел от метода введения вакцины и составил 3-4 log2, хотя у цыплят, привитых перорально, наблюдали большой разброс титров антител, а в двух случаях результаты были отрицательными.
