Введение к работе
Высокий риск инфицирования, широкое распространение и тяжесть заболевания делают клещевой энцефалит (КЭ) одной из самых актуальных природно-очаговых вирусных инфекций в России. Для заболеваемости этой инфекцией характерна цикличность, и с 2000 года наблюдается снижение числа регистрируемых случаев КЭ по сравнению с 1999 годом, когда в России было зарегистрировано 10000 случаев. Несмотря на это, эпидемиологическая ситуация остается напряженной. КЭ распространен на территории 50 субъектов РФ. Число регистрируемых случаев в последние годы превышает 2000, около трети которых протекает с остаточными осложнениями разной степени тяжести, часто приводящими к инвалидности. У 1-5 % пациентов КЭ переходит в хроническую форму. Предыдущие 20 лет характеризовались повсеместным увеличением численности клещей-переносчиков вируса КЭ (ВКЭ), расширением ареала инфекции, увеличением группы риска за счет городских жителей до практически всего населения, проживающего на эндемичных территориях, а также большим числом смешанных вирусных и бактериальных переносимых клещами инфекций.
Цикличность и географическая неравномерность заболеваемости КЭ определяются многими факторами, в том числе числом и видом клещей-переносчиков, их зараженностью ВКЭ, числом и видами прокормителей, количеством восприимчивого населения, свойствами циркулирующего вируса и наличием в клещах возбудителей сопутствующих инфекций.
Постоянный комплексный мониторинг эпидемиологической и эпизоотологической ситуации в очагах и понимание связи эпизоотологических характеристик и заболеваемости КЭ могут дать информацию, позволяющую делать как краткосрочные прогнозы, так и разрабатывать сценарии изменения риска заболеваний КЭ в зависимости от изменения климата, проведения профилактических мероприятий, антропогенного и других воздействий на биоценоз, а также предсказать появление новых эпидемически важных вариантов ВКЭ. Очевидно, что для этого необходимо изучение механизмов взаимодействия всех звеньев паразитарной системы: прокормитель-клещ-вирус.
В последнее время, благодаря усилиям нескольких научных коллективов отмечаются большие успехи в области молекулярной эпидемиологии КЭ. Установлены ареалы трех генотипов ВКЭ, получены предварительные данные, указывающие на возможную циркуляцию в природе новых генетических вариантов этого вируса. Тем не менее, полученной информации недостаточно для объяснения различных уровней заболеваемости в разных регионах России, остаются открытыми вопросы о том, какие факторы определяют активность очагов, цикличность подъема заболеваемости, и существует ли связь между уровнем заболеваемости и вирулентностью циркулирующих вариантов ВКЭ в данном регионе.
Современный прогресс в молекулярной биологии и вирусологии позволяет изучать вирус на популяционном уровне, оценивать гетерогенность популяции и влияние этой гетерогенности на основные характеристики вируса, в том числе и патогенетические.
Настоящая работа посвящена изучению механизмов микроэволюции ВКЭ. Популяционный подход при изучении арбовирусов, специфики поведения вирусной популяции при чередовании хозяев (членистоногие-прокормители) дает новую информацию, позволяющую объяснить зависимость вирулентности вируса и активности очагов от различных характеристик биоценоза.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучение механизмов микроэволюции популяции ВКЭ. ЗАДАЧИ РАБОТЫ:
- на основе данных филогенетического анализа оценить основные факторы, определяющие эволюцию ВКЭ;
- на модели одного штамма ВКЭ изучить геном и свойства вариантов вируса, имеющих селективные преимущества при репродукции в клещах и млекопитающих;
- исследовать начальные этапы взаимодействия ВКЭ с клетками и их роль в изменчивости этого вируса;
- описать патогенез и формирование иммунного ответа при инфекции, вызванной вариантами вируса, адаптированными к клещам и млекопитающим;
- описать механизмы изменения генетической структуры популяции при смене хозяина.
Впервые показано, что на поверхности клеток существует два типа рецепторов для ВКЭ, обеспечивающих высоко- и низкоаффинное связывание вирионов.
Впервые изучены молекулярные основы адаптации ВКЭ к клещам и млекопитающим и предложена схема, объясняющая быструю переадаптацию вируса при чередовании хозяев. Впервые показано, что адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, приводящих к комплексному изменению антигенной структуры основного гликопротеина Е и повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки, которые служат низкоаффинным рецептором для вирионов ВКЭ.
Впервые изучены механизмы восстановления низкой аффинности связывания вирионов с ГАГ у мутантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. Впервые показано, что при репродукции вируса с ГАГ-связывающим фенотипом в клетках млекопитающих могут возникать варианты ВКЭ, способные вызывать все формы инфекции (инаппарантную, острую и персистентную).
В результате проделанной работы впервые в экспериментах на мышах охарактеризована инаппарантная форма КЭ, вызванной периферическим введением адаптированного к клещам варианта ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. При данной инфекции нет виремии, не выявляется вирус и вирусная РНК в центральной нервной системе (ЦНС), не выявляются антитела (АТ) к основному гликопротеину Е при синтезе в небольших количествах АТ к неструктурному белку NS1 и формируется длительный протективный иммунитет.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
Настоящая работа является первым комплексным исследованием, позволяющим оценить поведение популяции переносимого клещами арбовируса при чередовании хозяев (клещ-млекопитающее). Для экспериментально полученных вариантов ВКЭ, имеющих селективное преимущество при размножении в клещах и млекопитающих, проведено сравнение геномов, свойств вирионов, характеристик репродукции в клетках, патогенетических характеристик и особенностей иммунного ответа в экспериментах на лабораторных мышах и показаны механизмы изменения структуры популяции ВКЭ при смене хозяина.
Выявлено, что адаптация ВКЭ к клещам может приводить к значительному изменению антигенной структуры белка Е. Это необходимо учитывать при разработке и применении вакцинных препаратов, а также при оценке природной изменчивости антигенной структуры ВКЭ.
Показано, что при переадаптации ВКЭ от клещей к млекопитающим в популяции вируса появляются варианты, различающиеся по патогенетическим характеристикам.
Накопленная информация показывает, что длительная циркуляция ВКЭ в организме клеща может приводить к селекции низковирулентных вариантов, обеспечивающих скрытую иммунизацию млекопитающих против вирулентного вируса без синтеза АТ к белку Е. Полученные данные следует учитывать при создании диагностических препаратов, при прогнозировании тяжести течения и исхода заболевания, а также при изучении уровня сероконверсии у людей и прокормителей.
Приведенные данные относятся к изучению механизмов микроэволюции ВКЭ и патогенеза при разных формах КЭ с учетом гетерогенности популяции, которое являются одним из приоритетных направлений фундаментальных исследований в области инфекционной патологии.
Материалы исследований были использованы при составлении Санитарно-эпидемиологических правил 3.1.3.2352-07 «Профилактика клещевого вирусного энцефалита», включены в программу лекций на кафедре вирусологии биологического факультета МГУ им. М.И.Ломоносова.
Определена первая полная нуклеотидная последовательность генома штамма ВКЭ прибалтийской группы сибирского генотипа (GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank, № DQ486861).
Разработан корректный методический подход, позволяющий оценить наличие персистенции вируса в ЦНС (Вопросы вирусологии, 2006).
- на поверхности клеток существует два типа рецепторов для ВКЭ, обеспечивающих высоко- и низкоаффинное связывание вирионов;
- популяция ВКЭ испытывает разное селективное воздействие при репродукции в клещах и млекопитающих, адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки, которые служат низкоаффинным рецептором для этого вируса;
- адаптированный к клещам вариант ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом при периферическом введении лабораторным мышам вызывает инаппарантную инфекцию, которая характеризуется формированием длительного протективного иммунитета без выраженного синтеза антител (АТ) к основному вирусному гликопротеину Е;
- варианты одного штамма ВКЭ, полученные на разной стадии адаптации к клещам и переадаптации к млекопитающим, могут вызывать все формы КЭ: острую, инаппарантную и хроническую;
- ВКЭ может существовать в виде гетерогенной стабильной по составу популяции, содержащей варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции либо в клещах, либо в млекопитающих, соотношение которых в популяции меняется при чередовании хозяев в процессе циркуляции;
- при определенных условиях в популяции ВКЭ могут быстро (за один пассаж) возникать новые мутанты с более высокой приспособленностью к репродукции в данной системе, при этом скорость изменения генетической структуры популяции ВКЭ и разнообразие мутантов определяется характеристикой хозяина и наличием эффекта "бутылочного горлышка".
Работа была апробирована на заседании межлабораторного Ученого совета ГУ ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН 20 февраля 2009 года.
Материалы диссертации представлены на заседании Ученого совета ГУ ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН (2007), на научной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова (Москва, 1999), на региональных научно-практических конференциях (Якутск, 2007; Красноярск, 2008; Пермь, 2008), на Всесоюзных и Всероссийских научно-практических конференциях (Иркутск, 1990; Алма-Ата, 1991; Ярославль, 1992; Ижевск, 1998; Новосибирск, 2002; Пермь, 2003; Самара, 2004; Красноярск, 2005), на Международных конференциях по арбовирусам и арбовирусным инфекциям (Москва, 1989), по проблемам инфекций в клинической медицине (Санкт-Петербург, 2002), по ликвидации и элиминации инфекционных болезней (Санкт-Петербург, 2003), по возникающим болезням и выживанию (IMED Вена-Австрия, 2007), на VIII и Х Международных конгрессах по вирусологии (Берлин-Германия, 1990; Иерусалим-Израиль, 1996), на III Совместном совещании европейского общества борьбы с вирусными заболеваниями и европейской группы по быстрой вирусной диагностике (Страсбург-Франция, 1991), на V Интернациональном симпозиуме по (+)РНК содержащим вирусам (Флорида, 1998), на IV Конгрессе Европейского общества по инфекционным болезням (ESEI Лиссабон-Португалия, 2007); на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), и на IV Всероссийском съезде общества паразитологов (Санкт-Петербург, 2008); на расширенных пленумах проблемных комиссий по клещевым и другим вирусным энцефалитам (Москва, 2003) и арбовирусам (Астрахань, 2006), на Бюро Отделения профилактической медицины РАМН (Москва, 2008).
По результатам работы опубликовано 14 статей в реферируемых научных журналах, из них 3 за рубежом, 1 монография и 10 статей в научных сборниках.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ
![Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс]](/i/i/4440/193595.png "Особенности экспериментальной инфекции, вызванной вариантами вируса клещевого энцефалита с высокой и низкой нейроинвазивностью [Электронный ресурс] Кондратьева Ярослава Юрьевна")
