Введение к работе
Актуальность проблемы. Эпидемиологическая ситуация по клещевому энцефалиту (КЭ) в Российской Федерации продолжает оставаться напряженной, несмотря на 70-летнюю историю изучения этого заболевания, активную разработку мер профилактики и борьбы с ним. Так, по состоянию на 2008 год 46 из 83 субъектов РФ были признаны эндемичными по КЭ частично либо полностью (Письмо Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека от 13 января 2009 г. № 01/176-9-32 "О перечне эндемичных территорий по клещевому вирусному энцефалиту в 2008 году"). Результаты молекулярно-эпидемиологических исследований последних лет показали циркуляцию на территории Российской Федерации (РФ) трех основных подтипов вируса клещевого энцефалита (ВКЭ): дальневосточного, европейского и сибирского (урало-сибирского) (Злобин В.Й. и др., 2002; Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. и др., 2004). Показано широкое распространение сибирского подтипа ВКЭ на европейской и азиатской территории России (Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С. и др., 2004; Верхозина М.М., Злобин В.И., Демина Т.В. и др., 2007), на территории европейских стран (Адельшин Р.В., Злобин В.И., Беликов СИ. и др., 2006; Колясникова Н.М., 2008).
Обнаружение трех подтипов ВКЭ послужило стимулом к возобновлению дискуссии о единстве или множественности клещевых энцефалитов, начатой М.П. Чумаковым (1944) и продолженной в 1950-х годах ведущими учеными (Дискуссия о природе клещевых энцефалитов на заседании редакционного совета журнала "Вопросы вирусологии", 1957). По мнению Вотякова В.И. и соавт. (2002), генетические различия между подтипами ВКЭ на нуклеотидном и аминокислотном уровнях соответствуют таковым для выделения трех самостоятельных видов вируса и трех нозологических форм. Сравнивая характеристику трех подтипов ВКЭ, авторы утверждают, что штаммы дальневосточного, европейского и урало-сибирского подтипов способны вызывать качественно отличную клиническую картину заболевания (Вотяков и др., 2002). Однако, дискуссия ведется на основе недостаточного изучения патогенного потенциала сибирского подтипа ВКЭ. Так, данные, характеризующие течение инфекции при инфицировании сибирским подтипом ВКЭ, представлены по материалам Восточной Сибири и Приангарья (Борисов В.А., 1997), но на указанных территориях отмечается циркуляция одновременно двух подтипов ВКЭ -сибирского и дальневосточного (Трухина А.Г., 1989; Андаев Е.И., Трухина А.Г., Карань Л.С. и др., 2006; Погодина В.В., Карань Л.С, Колясникова Н.М., Левина Л.С, Маленко Г.В., Гамова Е.Г. и др., 2007). Кроме того, показано, что с дальневосточным подтипом ВКЭ могут быть связаны как очаговые, так и легкие формы заболевания (Кулакова Н.В., Беликов СИ., Леонова Г.Н., Борисевич В.Г., 2002). На современном уровне дискуссионные вопросы об этиологической связи различных подтипов ВКЭ с разнообразными клиническими формами КЭ должны решаться на основе молекулярно-биологического исследования возбудителей. Это относится, прежде всего, к
оценке патогенного потенциала сибирского подтипа. В настоящее время лишь немногие научные коллективы проводят генотипирование штаммов, изолированных от больных людей. Помимо ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (Москва), такая работа ведется во Владивостоке (Кулакова Н.В., Беликов СИ., Леонова Г.Н., Борисевич В.Г., 2002; Леонова Г.Н., Беликов СИ., Джиоев Ю.П. и др., 2002), Новосибирске (Ternovoy V.A., Kurzhukov G.P., Sokolov Y.V. et al., 2003; Локтев В.Б., Терновой B.A., Нетесов СВ., 2007), Иркутске (Андаев Е.И., Трухина А.Г., Карань Л.С. и др., 2006).
В настоящее время для диагностики КЭ широко используется метод иммуноферментного анализа (ИФА), позволяющий выявить антиген возбудителя, а также антитела классов М и G. Отдельного рассмотрения заслуживает диагностическая технология, сконструированная с целью повышения не только чувствительности и специфичности, но и мультиплексности разрабатываемых тестов, разработанная в ГНЦ ФГУП ТосНИИ БП" - фосфоресцентний твердофазный микроанализ (ФОСФАН) (Осин Н.С., Помелова В.Г., Быченкова Т.А., 2006). Она позволяет определять антиген и антитела класса М и G к ВКЭ, а также к другим вирусам комплекса КЭ, флавивирусам и другим вирусам. Метод основан на взаимодействиях по принципу "антиген-антитело". Все перечисленные тест-системы и технологии для выявления антигена ВКЭ и антител к вирусу КЭ изготовлены на основе штаммов дальневосточного подтипа возбудителя.
Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение патогенного потенциала доминирующего в России сибирского подтипа вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) на клиническом материале в сопоставлении с дальневосточным подтипом с использованием вирусологических и молекулярно-биологических методов. Для достижения поставленной цели нужно было решить следующие задачи:
Сформировать коллекции штаммов, изолированных от больных клещевым энцефалитом (КЭ) и погибших пациентов в разных регионах России и ряде зарубежных стран.
Провести ретроспективное вирусологическое исследование и генотипирование коллекционных штаммов, изолированных от больных КЭ и погибших людей.
Провести вирусологическое изучение и генотипирование современных штаммов вируса КЭ, генотипирование изолятов РНК.
Изучить особенности штаммов ВКЭ, выделенных при инаппарантной инфекции, лихорадочных и менингеальных формах КЭ.
Изучить особенности штаммов ВКЭ, выделенных при очаговых формах КЭ с летальным исходом.
Изучить особенности штаммов ВКЭ, выделенных при хроническом КЭ.
Провести изучение микст-штаммов ВКЭ, изолированных от больных и погибших людей.
Изучить эффективность лабораторной диагностики КЭ в регионе доминирования сибирского подтипа (Кемеровская область) с использованием тест-систем, изготовленных на основе штаммов
дальневосточного подтипа, для выявления антигена и антител IgM и
IgG методами ИФА при помощи коммерческих тест-систем и
экспериментальных иммуночиповых тест-систем ФОСФАН. Клиническая диагностика не входила в задачи настоящего исследования и осуществлялась врачами-неврологами и инфекционистами районных и областных лечебных учреждений. Автор также не принимала непосредственного участия во взятии материала от больных и умерших людей.
Научная новизна. Впервые дана характеристика патогенного потенциала сибирского подтипа ВКЭ на основе изучения и генотипирования штаммов и изолятов, выделенных от больных и погибших людей с подтверждением этиологической связи с подтипом возбудителя. Доказана связь сибирского подтипа ВКЭ со всеми известными клиническими формами КЭ.
Впервые проведено сравнительное изучение этиологической роли сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ в развитии всего разнообразия клинических форм заболевания. Не установлено принципиальных различий между этими подтипами по спектру вызываемых ими клинических форм.
Доказана роль сибирского подтипа ВКЭ в развитии летальных случаев КЭ на территории Вологодской, Ярославской и Свердловской областей в 2008 году и более ранние годы. Установлено, что отягощающими факторами при развитии очаговых летальных форм КЭ являются особенности как макроорганизма (старший возраст, отсутствие вакцинации, сопутствующие заболевания и др.), так и процесса заражения (множественные укусы и длительное присасывание клещей), и свойства возбудителя (высокая нейроинвазивность и вирулентность штаммов, тропизм к различным структурам ЦНС человека).
Установлено, что сибирский подтип ВКЭ в большей степени ассоциирован с хроническими формами заболевания, что подтверждается изоляцией и генотипированием штаммов от больных, а также пролонгированным течением патологического процесса у экспериментально зараженных сирийских хомяков.
На основе исследования локализации вирусной РНК в клиническом материале установлено, что сибирский подтип ВКЭ поражает структуры ЦНС и мозговые оболочки.
Впервые микст-штаммы ВКЭ, сочетающие последовательности генов Е и NS1 сибирского и дальневосточного, либо сибирского и европейского подтипов возбудителя, изолированы от больных КЭ и умерших людей.Показана роль микст-штаммов в этиологии различных форм КЭ (менингеальной, менингоэнцефалитической, хроническом КЭ, в том числе кожевниковской эпилепсии).
Впервые на основе экспериментальных и клинических данных получены доказательства необоснованности выделения заболевания,
вызванного сибирским подтипом ВКЭ, в отдельную нозологическую единицу.
Впервые генетическими методами изучены особенности популяции ВКЭ на мало исследованной на современном этапе территории -Прокопьевском районе Кемеровской области. При доминировании сибирского подтипа ВКЭ установлена циркуляция дальневосточного и его роль в этиологии заболевания.
Исследования, проведенные в зоне доминирования сибирского подтипа ВКЭ (Кемеровская обл.), показали, что на данной территории в лабораторной диагностике с целью детекции в сыворотках крови антигена ВКЭ, антител классов IgM и IgG могут применяться коммерческие тест-системы, приготовленные из штаммов дальневосточного подтипа ВКЭ.
Практическая значимость работы. Показана роль сибирского подтипа в этиологии широкого спектра клинических проявлений заболевания, от инаппарантной инфекции до острых летальных форм КЭ. В ходе работы было продолжено накопление материала по предмету дискуссии о единстве и множественности клещевого энцефалита. Данных за целесообразность выделения трех отдельных нозологических единиц вместо одной (клещевой энцефалит) получено не было.
Показано, что в зоне доминирования сибирского подтипа ВКЭ может быть эффективно проведена комплексная лабораторная диагностика КЭ при помощи коммерческих и экспериментальных и тест-систем, изготовленных на основе дальневосточного подтипа вируса.
В ходе работы диссертантом были выделены, закреплены и изучены 3 новых штамма ВКЭ,
Внедрения: в международную электронную базу данных GenBank ( были депонированы нуклеотидные последовательности полноразмерного гена белка Е 36 штаммов ВКЭ, выделенных от людей: № FJ214111, FJ214112, FJ214132, FJ214133, FJ214120, FJ214121,FJ214113, FJ2I4114, FJ214115, FJ214116, FJ214117, FJ214II8, FJ214119, FJ214134, FJ214137,
Основные положения, выносимые на защиту.
Штаммы сибирского и дальневосточного подтипов ВКЭ изолированы при всех клинических формах КЭ и инаппарантной инфекции.
Сибирский подтип ВКЭ способен вызывать тяжелые очаговые формы КЭ с летальным исходом в регионах РФ (Ярославская, Вологодская, Свердловская, Челябинская, Кемеровская, Иркутская области, Красноярский край и Читинская область). Отягощающими факторами в развитии очаговых летальных форм КЭ являются особенности макроорганизма (старший возраст, отсутствие вакцинации, сопутствующие заболевания и др.), процесса заражения (множественные укусы и длительное присасывание клещей) и свойства возбудителя (высокая нейроинвазивность и вирулентность штаммов, тропизм к различным структурам ЦНС человека).
Сибирский подтип ВКЭ в значительной степени связан с хроническими формами КЭ у людей, что подтверждается в опытах на сирийских хомяках.
Выделение заболевания, вызванного сибирским подтипом ВКЭ, в отдельную форму, необоснованно. Это подтверждено рядом клинических и экспериментальных данных.
В Прокопьевском районе Кемеровской области (эндемичная по КЭ административная территория РФ), где доминирует сибирский подтип ВКЭ, возможно эффективное применение коммерческих тест-систем для детекции антигена ВКЭ и антител к возбудителю, изготовленных на основе дальневосточного подтипа ВКЭ, а также использовшше экспериментальных иммуночиповых тест-систем "IgM-ВКЭ-ФОСФАН" и "IgG-ВКЭ-ФОСФАН", также изготовленных на основе штаммов дальневосточного подтипа ВКЭ.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции "Вакцинология 2006. Совершенствование иммунологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней" (Москва, 2006), Всероссийской научной конференции "Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита" (к 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита) (г. Москва, 2007 г.), Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием "Актуальные проблемы клещевых нейроинфекций" (г. Кемерово, 2008 г.), конференции молодых ученых ЙПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН (г. Москва, 2009 г.).
Апробация диссертационной работы состоялась 17.06.2009г. на заседании межлабораторного Ученого совета Учреждения Российской Академии Медицинских Наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и указателя литературы, состоящего из 168 работ отечественных и 65 работ зарубежных авторов. Диссертация изложена на 227 страницах машинописного текста, иллюстрирована 35 таблицами и 44 рисунками.
