Введение к работе
Актуальность проблемы
Одним из наиболее распространенных вирусов, патогенных для человека и животных, является вирус гриппа А. Вирус гриппа А, в отличие от вирусов гриппа В и С, способен вызывать не только локальные вспышки и сезонные эпидемии, но и глобальные пандемии, охватывающие весь земной шар и случающиеся с интервалом 10-40 лет, поражая миллионы и десятки миллионов человек. Вирус гриппа А имеет широкий круг хозяев и отличается значительной вариабельностью. Вариабельность характерна для всех белков вируса гриппа А, но наиболее вариабельны поверхностные гликопротеины вириона, гемагглютинин (НА) и нейраминидаза (NA), определяющие иммунный ответ. Известны два пути изменения этих белков. Первый - антигенный дрейф, присущий в основном вирусам гриппа человека. В человеческой популяции на вирус давит коллективный иммунитет. В таких условиях мутации, позволяющие вирусу преодолеть иммунитет, дают ему серьезное преимущество и закрепляются. В итоге антигенные варианты сменяют друг друга. Второй путь - антигенный сдвиг или шифт (от англ. shift), то есть изменение антигенной формулы из-за замены гена и соответствующего белка в результате реассортации генов. Если два вируса гриппа А заражают одну и ту же клетку, то в вирусном потомстве многие вирусные частицы окажутся реассортантными, то есть получившими часть генов от одного вируса-родителя, а часть - от другого. К вирусу гриппа, получившему ген НА (или НА и NA) от вируса гриппа птиц, который ранее не циркулировал в человеческой популяции, у населения нет иммунитета.
В настоящее время описаны 16 антигенных подтипов НА (Н1-Н16) и 9 подтипов NA (N1-N9) вируса гриппа А. Разные подтипы вируса гриппа поражают не только птиц, но и свиней (HI, НЗ), лошадей (НЗ, Н7), тюленей (Н4, Н7), норок (НЮ). У птиц, являющихся главным природным резервуаром вируса гриппа А, выделяют вирусы всех подтипов НА, однако у разных видов те или иные подтипы встречаются с разной частотой. Возможно, что многообразие вариантов подтипов НА, циркулирующих в природе, этим не ограничивается.
Основной мишенью для вирус-нейтрализующих антител, которые играют главную роль в защите от гриппозной инфекции, является НА. В человеческой популяции к настоящему времени циркулируют вирусы гриппа А, НА которых относятся к двум подтипам: HI и НЗ. Другие подтипы НА (Н2, Н4-Н16) в настоящее время не циркулируют в человеческой популяции. Поэтому люди не обладают иммунной защитой против вирусов подтипов Н4-Н16, а против вируса подтипа Н2 иммунитетом обладают лица старше 42 лет, так как подтип Н2 циркулировал с 1957 по 1968 гг. Нельзя исключить, что вирус гриппа А
любого подтипа, отсутствующего в человеческой популяции, может быть источником гена НА вирусов будущих пандемий.
Подтип Н5 находится в центре внимания вирусологов после осени 1997 г., когда в Гонконге была отмечена первая серия заболеваний человека в результате заражения высокопатогенным вирусом гриппа птиц H5N1. Из 18 человек, зараженных вирусом гриппа A/Hong Kong/156/97 подтипа H5N1, 6 погибли. Было установлено, что вирус передавался от кур к человеку, передачи от человека к человеку зарегистрировано не было. Секвенирование генов вирусов, выделенных от человека и от птиц, показало, что все гены вируса, выделенного от человека, были им получены от вируса, вызвавшего эпизоотию у кур.
В 2003 году в Юго-Восточной Азии вновь были зафиксированы случаи заражения людей вирусом гриппа А подтипа H5N1. С 2004 года в Таиланде, Вьетнаме, Камбодже, Индонезии и Китае зарегистрированы заболевания людей с высокой летальностью, вызванные этим вирусом. В 2005 году эпизоотии среди птиц, вызванные вирусом H5N1 отмечены в России, Украине и в Центральной Европе. В 2006 году эпизоотии были зафиксированы в Турции и в странах Африки, имеются случаи заражения людей с летальным исходом. По данным ВОЗ к настоящему моменту заболело 489 человек, из них умерло 289. Люди, как правило, заражались вирусом H5N1 только от птиц, массовая передача этих вирусов от человека к человеку пока еще не зарегистрирована. Имеются основания полагать, что для приобретения вирусом способности распространяться среди людей достаточно нескольких мутаций. Другим фактором, повышающим вероятность приобретения вирусом подтипа H5N1 способности к распространению среди людей, может быть его скрещивание с вирусом гриппа человека. В связи с отсутствием у людей антител к НА вирусов подтипа Н5 и активной циркуляцией этих вирусов в природе, вирусы этого подтипа обладают потенциалом пандемических агентов. При возникновении пандемии, вызванной высоковирулентными вирусами гриппа, относящимися к подтипу Н5, последствия могут оказаться гораздо более тяжелыми, нежели при прежних пандемиях. Вирусы этого подтипа часто обладают особыми свойствами, которые позволяют им поражать многие ткани организма и вызывать у птиц тяжелейшую, обычно смертельную инфекцию. Те вирусы, которые оказались способны заражать человека, также вызывали заболевание с необычно высокой смертностью.
Для всех подтипов НА известна аминокислотная последовательность, но в остальном разные подтипы НА исследованы в разной степени. Лишь немногие из 16 подтипов НА были охарактеризованы в отношении местоположения и структуры антигенных участков (сайтов) в трехмерной модели молекулы НА. Картирование антигенных сайтов молекулы НА подтипа НЗ впервые было осуществлено в 1981 г. [Wiley et al., 1981]. На протяжении последующих
20 лет трехмерная структура молекулы НА была известна только для подтипа НЗ. Поэтому первые попытки картирования антигенных сайтов для подтипов HI и Н2, а также ориентировочного картирования НА подтипа Н5, осуществлялись с использованием кристаллографической модели НЗ. После того, как в 2001 г. была получена рентгено-кристаллическая структура НА подтипа Н5, в Лаборатории физиологии вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского было проведено детальное антигенное картирование молекулы НА подтипа Н5. Картирование проводилось с помощью селекции мутантов, резистентных к моноклональным антителам (эскейп-мутантов) и их характеристики посредством перекрестных иммунологических реакций и секвенирования НА. В ходе этих исследований была выявлена вариабельность вирулентности эскейп-мутантов, коррелирующая с определенными аминокислотными заменами в НА.
После начала широкого распространения высокопатогенного вируса подтипа H5N1 возникла необходимость получения данных об особенностях антигенной структуры его НА. Вирус H5N1 обладает значительной вариабельностью. Известно, что разные варианты вируса различаются как по антигенной специфичности НА, так и по уровню вирулентности. Однако до начала наших исследований в научной литературе отсутствовали какие-либо данные о картировании антигенных сайтов в структуре молекулы НА вирусаH5N1, атаюке о зависимости изменений вирулентности от антигенной вариабельности. Актуальность исследования этих проблем обусловлена необходимостью углубления знаний о высокопатогенном вирусе гриппа H5N1, обладающем пандемическим потенциалом. Получение информации по этой проблеме создает базис для подхода к разработке профилактического и лечебного применения моноклональных антител, а также для прогноза антигенного дрейфа в случае начала циркуляции вируса H5N1 в человеческой популяции и для подбора противопандемических вакцинных штаммов.
Цели и задачи исследования:
Провести картирование распределения антигенных сайтов в трехмерной структуре молекулы НА вируса гриппа подтипа H5N1. Выявить особенности структуры антигенных сайтов НА вируса H5N1 по сравнению с НА ранее охарактеризованных вирусов подтипа Н5. Охарактеризовать эпитопы НА, взаимодействующие с моноклональными антителами, полученными против вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1). Выявить влияние аминокислотных замен в НА подтипа Н5, меняющих его антигенные свойства, на вирулентность вируса.
Для достижения поставленных целей было необходимо решить следующие задачи:
-
Получить эскейп-мутанты вируса гриппа А подтипа H5N1, резистентные к моноклональным антителам, и определить их перекрестную реактивность с моноклональными антителами
-
Провести анализ результатов секвенирования генов гемагглютинина всех эскейп-мутантов с целью выявления локализации мутаций, определяющих их устойчивость к моноклональным антителам
-
Охарактеризовать панель моноклональных антител против вируса гриппа A/Vietnam/1203/04 по распознаваемым ими в молекуле НА эпитопам
-
Осуществить антигенное картирование молекулы гемагглютинина с использованием трехмерной модели гемагглютинина подтипа Н5
-
Охарактеризовать полученные эскейп-мутанты по их вирулентности для мышей и провести реадаптацию низковирулентных эскейп-мутантов
-
Провести реассортационный анализ низковирулентных эскейп-мутантов и их реадаптированных вариантов для выяснения влияния аминокислотных замен в НА вируса подтипа Н5 на вирулентность
Научная новизна и практическое значение работы
Данная работа расширяет представление об особенностях антигенной структуры молекулы гемагглютинина подтипа Н5, и об участках молекулы гемагглютинина, которые определяют вариации антигенной специфичности в процессе эволюции.
Полученные данные впервые описывают распределение антигенно значимых участков в трехмерной структуре молекулы НА вируса гриппа подтипа H5N1.
Проведенный анализ влияния аминокислотных замен в НА на вирулентность вируса впервые достоверно демонстрирует снижение вирулентности под действием мутаций, меняющих антигенную специфичность НА подтипа Н5, и восстановление вирулентности при дополнительных мутациях в НА, приобретенных при пассировании вируса на животных.
Работа имеет преимущественно теоретический характер, но полученные данные в будущем должны будут приниматься во внимание при решении практических проблем. В связи с продолжающейся эволюцией высокопатогенных вирусов подтипа H5N1 и их выраженной патогенностью для человека, данные по картированию молекулы НА вируса подтипа H5N1 будут важны для оценки характера изменений НА у циркулирующих штаммов в аспекте их влияния на антигенную специфичность. Это может быть
существенным для подбора штаммов, которые будут использованы в производстве вакцин. Результаты исследования вариаций антигенносте при аминокислотных заменах в антигенных сайтах важны для раннего выявления штаммов, имеющих высокий потенциал патогенности.
Основные положення, выносимые на защиту
-
Антигенное картирование молекулы гемагглютинина (НА) высокопатогенного вируса гриппа H5N1 с использованием трехмерной модели гемагглютинина подтипа Н5 выявило локализацию, протяженность и структуру двух антигенных сайтов в трехмерной структуре молекулы НА вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1).
-
Моноклональные антитела против НА вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1) имеют ряд особенностей, отличающих их от охарактеризованных ранее моноклональных антител против НА подтипа Н5.
-
Некоторые моноклональные антитела против НА подтипа Н5 способны распознавать аминокислотные позиции, локализованные в двух разных антигенных сайтах.
-
У эскейп-мутантов, имеющих аминокислотную замену S145F в НА, выявлено резкое снижение вирулентности для мышей. Вирулентность восстанавливается в результате реадаптации низковирулентных эскейп-мутантов посредством пассажей на мышах при интраназальном заражении.
-
Роль аминокислотной замены S145F в НА для снижения вирулентности подтверждена реассортационным анализом, проведенным с использованием скрещивания и с применением сайт-специфического мутагенеза. Восстановление вирулентности при пассировании низковирулентных эскейп-мутантов может быть обусловлено как дополнительными мутациями в гене НА, так и изменениями в других генах.
-
Аминокислотные замены в НА эскейп-мутантов вируса A/Vietnam/1203/04 (H5N1), совпадают с аминокислотными заменами у природных высокопатогенных изолятов H5N1, относящихся к разным ветвям филогенетического дерева, что указывает на существенное значение вариаций, охарактеризованных в настоящей работе, для эволюции иммунологических свойств и вирулентности вирусов подтипа H5N1.
Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на XIV Международном конгрессе по вирусологии, Стамбул, Турция, 2008 г.; II Ежегодной конференции молодых ученых НИИ
вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН, Москва, 2009 г.; 28й Ежегодной конференции Американского Общества Вирусологов, Ванкувер, Канада, 2009 г.
В завершенном виде результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного совета НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН 21 апреля 2010 года.
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 3 научных работы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, и 2 - в материалах международного конгресса и конференции.
Объем и структура диссертации
Диссертация написана на 133 печатных страницах, состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Диссертация содержит 4 схемы, 14 таблиц и 5 рисунков. Список использованной литературы содержит 218 отечественных и зарубежных источников.
