Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Протеолиз, протеолитические ферменты и ферментативные белковые гидролизаты тканей гидробионтов. Обзор научной литературы по изучаемому вопросу
1. Роль протеолиза в белковом метаболизме 9
2. Характеристика протеолитических ферментов гидробионтов 12
2.1. Аспартильные протеиназы (катепсин D, пепсин, катепсин Е) 12
2.2. Сериновые протеиназы (эластаза, трипсин, химотрипсин, акрозин, 21 коллагенолитические протеиназы)
2.3. Са2+ - активируемые нейтральные протеиназы 27
3. Роль протеиназ в физиолого-биохимических адаптациях морских 30
организмов
4. Роль протеиназ в посмертных изменениях белков тканей 31
гидробионтов
5. Получение и применение белковых ферментативных гидролизатов 34
Глава II. Объекты и методы исследований 42
Глава III. Результаты собственных исследований 53
1. Спектр и тканевая локализация протеиназ морских беспозвоночных 53
1.1. Пищеварительные органы 5 3
1.2. Половые органы 5 8
1.3. Мышечные ткани 61
2. Динамика активности протеиназ в процессе годовых циклов морских беспозвоночных 62
2.1. Динамика активности протеолитических ферментов в гонадах морского ежа в процессе созревания половых продуктов 63
2.1.1. Активность катепсина D, эластазы и акрозина 63
2.1.2. Активность кальпаиноподобных ферментов 66
2.2. Динамика протеолитической активности в гонадах исландского гребешка в процессе годового цикла развития 70
2.3.Сезонные изменения протеолитической активности в гепатопанкреасе камчатского краба 72
3. Выделение и свойства протеиназ из тканей морских беспозвоночных 73
3.1. Кислая протеиназа из гепатопанкреаса камчатского краба 74
3.2. Кислая протеиназа из гонад исландского гребешка 79
3.3. Комплексные ферментные препараты из пищеварительных органов различных морских беспозвоночных 81
3.4. Ферментный препарат из гепатопанкреаса камчатского краба 87
3.4.1. Выделение, характеристика и протеолитическая активность 87
3.4.2. Сопутствующие виды гидролитической активности 96
4. Изучение гидролиза белков тканей гидробионтов 100
4.1. Оценка степени гидролиза белков 101
4.2. Зависимость эффективности гидролиза от типа фермента и белкового сырья 107
4.3. Влияние температуры на гидролиз белков 111
4.4. Влияние рН реакционной смеси на гидролиз белков 113
4.5. Зависимость эффективности гидролиза от гидромодуля реакционной смеси 115
4.6. Влияние продолжительности процесса и концентрации ферментного препарата на эффективность гидролиза белков 117
5. Обезжиривание и обесцвечивание белковых гидролизатов 127
5.1. Качественные изменения растворов белковых гидролизатов при действии на них хитозана 127
5.2. Количественная оценка действия хитозана на растворы белковых гидролизатов 128
6. Химический состав и свойства ферментативных белковых
гидролизатов 134
6.1. Гидролизаты для микробиологических целей 134
6.2. Гидролизаты для кормовых целей 141
7. Практическое использование гидролизатов и протеолитических ферментов тканей морских организмов 145
7.1. Изготовление соленой рыбной продукции. Стимуляция процесса
созревания пресервов 145
172
7.2. Повышение качества низкосортных мясных полуфабрикатов (спилок, жилка, шкура, говядина и баранина II категории) 152
7.3. Оценка пригодности белковых гидролизатов, полученных из различного сырья, для использования в составе микробиологических сред
7.4. Использование белковых гидролизатов в кормах для цыплят-бройлеров 181
7.5. Использование белковых гидролизатов в стартовых кормах для молоди атлантического лосося 188
7.6. Получение, свойства и клиническая апробация пищевого белкового гидролизата - компонента энтерального зондового питания 194
Заключение 211
Выводы 214
Рекомендации промышленности 216
Список литературы 2 *7
Приложения
(проекты НД, акты производственных проверок, протокол дегустационного совещания, патенты, грамоты, дипломы, рекламная продукция и т.д.) 247
- Роль протеолиза в белковом метаболизме
- Объекты и методы исследований
- Спектр и тканевая локализация протеиназ морских беспозвоночных
Введение к работе
Актуальность проблемы. Протеолиз in vivo - один фундаментальных биохимических процессов, прерогатива выживания организмов. В течение последних десятилетий произошла переоценка значения протеолитических реакций в регуляции метаболизма и стало ясно, что протеолиз в значительной мере определяет физиолого-биохимический статус организма и направленность обменных процессов в нем (Тутельян, Васильев, 1982; Антонов, 1983).
Протеолиз in vitro является одним из первых биотехнологических процессов, используемых человеком в хозяйственной деятельности. Общепризнанно, что технология^ производства пресервов, '(соленой продукции, а также селеного—полуфабриката для копчения основана преимущественно на ферментативных превращениях, приводящих к образованию специфических свойств продукта (Слуцкая, 1997; Шендерюк, 1976).
Белковые азотистые соединения необходимы для осуществления полноценного метаболизма практически всем живым организмам. Расщепление белковых молекул осуществляется с участием комплекса пищеварительных и внутриклеточных протеолитических ферментов. Пищеварительные железы выделяют в полость желудка и кишечника полный набор протеиназ, способных расщепить сложные белки до аминокислот, ди-и трипептидов (Мосолов, 1971).
При культивировании живых организмов возникает проблема эффективности расщепления и усвоения белковых трофических компонентов. Пищеварительная система некоторых таксономических групп не обладает способностью расщеплять нативные белки, или делает это недостаточно^ эффективв$* При некоторых физиологических состояниях осуществление полного/пищеварительного цикла не всегда возможно. Это происходит как в норме ^у_-іаод^ди-~различньіх ясивотны^^так—-и при
патологии (недостаточность,——функции 1г]*щ«ви]мпдьных желез,
механические повреждения органов пищеварения).
Белковые молекулы очень разнообразны по структуре. Легко доступные протеолитическому расщеплению глобулины и альбумины, усваиваются организмом практически полностью, а белки соединительной ткани (эластин, коллаген) расщепляются протеиназами значительно труднее (Пивненко, Позднякова, Давидович, 1997). Кератин, входящий в состав ногтей, волос, перьев практически не поддается ферментативной деградации в организме позвоночных (Файвишевский, Либерман, 1984). Усвояемость суммы белков зерна пшеницы в три раза ниже, чем белков мяса крупного рогатого скота (Дроздов, 1950). Таким образом, в некоторых случаях требуется изменение нативной структуры белковых компонентов корма (частичная или полная деструкция) для повышения их усвояемости тем или
иным организмом и осуществляется этот процесс in vitro под действием протеолитических ферментов.
Данная работа посвящена биохимии и биотехнологии протеолиза тканей морских гидробионтов, обоснованию оптимальных условий его осуществления и практической оценке эффективности введения деструктурированных белков в пищевой рацион различных организмов.
Цель работы:
теоретически и экспериментально обосновать возможность
протеолитической модификации белковых компонентов
микробиологических питательных сред, комбикормов и пищевых продуктов;
- разработать технологии использования новых видов сырья для
получения протеолитических препаратов и белковых ферментативных
гидролизатов.
Задачи исследования:
изучить спектр, тканевую локализацию и сезонную динамику активности протеолитических ферментов морских беспозвоночных: ракообразных, моллюсков и иглокожих;
выделить и изучить свойства протеиназ из тканей гидробионтов: кислых протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба и гонад исландского гребешка, кальпаинподобных ферментов из гонад морского ежа;
выявить потенциальные источники неиспользуемого белка среди отходов промысла и переработки морских гидробионтов;
изучить закономерности гидролиза in vitro при использовании протеолитических ферментов и белков морских организмов;
предложить биохимические критерии, объективно отражающие качество и степень расщепления белковых трофических компонентов;
определить оптимальные условия гидролиза белоксодержащего сырья морского происхождения, обеспечивающие необходимую степень модификации трофической компоненты для каждого исследуемого организма;
разработать технологии получения из тканей морских организмов ферментных препаратов, а также белковых гидролизатов микробиологического, пищевого и кормового назначения;
оценить возможность использования препаратов протеолитических ферментов из внутренностей морских организмов для получения белковых гидролизатов, а также для стимуляции процесса созревания соленой рыбной продукции и повышения качества низкосортных мясных полуфабрикатов;
- оценить эффективность использования белковых гидролизатов
тканей морских гидробионтов в составе микробиологических питательных
сред, в комбикормах для птицы и рыб, а также в диетотерапии
послеоперационных больных.
Научная новизна:
Систематизированы данные по активности, спектру и тканевой локализации протеиназ морских беспозвоночных. Определены источники белоксодержащего сырья и протеолитических ферментов для получения белковых гидролизатов и препаратов протеиназ из тканей морских организмов.
Определены оптимальные условия протеолиза для проведения гидролиза и получения белковых гидролизатов различного назначения. Для оценки качества и степени расщепления белков модифицированы существующие и предложены некоторые дополнительные биохимические критерии, отражающие последствия протеолиза.
3. Выделены и охарактеризованы протеолитические ферменты
морских беспозвоночных: кислая протеиназа из гепатопанкреаса
камчатского краба и гонад исландского гребешка, кальпаиноподобные
протеиназы из половых продуктов морского ежа.
4. Исследована динамика активности протеиназ в ходе годовых циклов
беспозвоночных: исландского гребешка, морского ежа и камчатского краба.
Оптимизирована схема получения протеолитических ферментных препаратов с коллагенолитическои активностью из гепатопанкреаса камчатского краба, акклиматизированного в Баренцевом море. Разработан способ получения комплексного ферментного препарата с протеолитической активностью из гепатопанкреаса морских звезд Asterias rubens и Crossaster papposus.
Разработаны технологии получения ферментативных гидролизатов из отходов переработки исландского гребешка для микробиологических диагностических сред и комбикормов для птицы и рыб (Заявка 2001115122).
Разработана технология получения ферментативных гидролизатов из отходов промысла и переработки гидробионтов для стартовых комбикормов лососевых рыб (Заявка 2000117616, положительное решение на выдачу патента от 28.11.02 г.).
8. Разработан способ обесцвечивания и обезжиривания
ферментативных гидролизатов, предназначенных для питательной основы
микробиологических диагностических сред (Пат. 2193330 RU).
9. Раскрыты механизмы, объясняющие положительный эффект
действия ферментативных гидролизатов при их введении в комбикорма для
птицы и рыб.
Практическое значение работы. Результаты диссертационной работы представляют значительный интерес для разработки технологии комплексного рационального использования ресурсов, добываемых в морях. В качестве сырья для получения протеолитических препаратов и белковых ферментативных гидролизатов предложено использовать отходы промысла и переработки морских организмов, прежде всего, беспозвоночных:
мантия, жабры, гонады исландского гребешка;
гепатопанкреас, карапаксы, жабры камчатского краба;
некондиционная северная креветка;
гепатопанкреас морских звезд;
мускулы непромысловых брюхоногих и двустворчатых моллюсков;
непромысловые, а также малоценные в пищевом отношении объекты (морской огурец, скат колючий, сайка, путассу, морской петух).
Для получения белковых гидролизатов используется ферментный комплекс из гепатопанкреаса камчатского краба и морских звезд. Применение этих ферментов позволяет изготовить соленую продукцию из гидробионтов, мышечная ткань которых не способна созревать (морской окунь, морской петух, серрипес, трубач). Разработанные ферментные препараты, за счет частичного гидролиза соединительнотканных белков, улучшают органолептические свойства мясных полуфабрикатов.
Экспериментально доказано:
возможность использования гидролизатов отходов промысла и переработки морских гидробионтов для приготовления микробиологических диагностических питательных сред: № 1 ГРМ (гидролизат рыбной муки), ГРМ-агар, ГРМ-бульон, агар Эндо-ГРМ, Левина-ГРМ;
увеличение привеса цыплят-бройлеров, содержавшихся на кормовой диете с заменой рыбной муки на кормовой гидролизат;
повышение жизнестойкости молоди атлантического лосося при замене в рецептуре стартового комбикорма рыбной муки на белковый гидролизат;
положительное воздействие гидролизата из мускула исландского гребешка на белковый обмен больных, находящихся на стационарном лечении и проходящих послеоперационную реабилитацию.
Разработаны проекты нормативной документации:
гидролизат для микробиологических питательных сред из отходов промысла гидробионтов;
гидролизат кормовой из отходов промысла исландского гребешка;
гидролизат пищевой для энтерального зондового питания из мускула исландского гребешка.
Положения и результаты выносимые на защиту:
обоснование технологии получения ферментных препаратов из тканей морских беспозвоночных и их использование для получения белковых ферментативных гидролизатов, а также в качестве стимуляторов процесса созревания и размягчения мышечной ткани рыб и наземных животных;
обоснование технологии получения белковых гидролизатов микробиологического и кормового назначения с использованием в качестве источника азота - отходов промысла и переработки морских организмов, а в качестве протеолитических ферментов — препаратов протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба и морских звезд;
положение о высоком субстратном сродстве протеиназ камчатского краба и морских звезд по отношению к белкам тканей морских организмов;
концепция о необходимости модификации белковой трофической компоненты in vitro при ряде физиологических и патологических состояний организма с целью повышения питательной ценности пищевых белков;
возможные механизмы, объясняющие положительное воздействие замены в комбикормах для птицы и рыб нативных белков на частично гидролизованные.
Апробация работы. Основные результаты диссертации представлялись и докладывались на российских и международных конференциях, совещаниях, симпозиумах и семинарах: Мурманск, 1994, 1995, 1997, 1998, 1999, 2002; Петрозаводск, 1995, 1997, 1999, 2002; Апатиты, 2000; Сыктывкар, 2000; Владивосток, 2001; Южно-Сахалинск, 2001; Москва, 2002; Адлер, 1999; Tel-Aviv, Israel, 1994; Ancona, Italy, 2001; Trondheim, Norway, 2002.
Разработанные препараты демонстрировались на тематических выставках: Морепродукты-2000 (Москва, ВВЦ); Рыба-2001 (С.-Петербург, ЛЕНЭКСПО); Рыбообработка и морские технологии, 2002 (Мурманск, Ледовый Дворец).
Публикации. Результаты исследований и теоретические основы работы наиболее полно нашли свое отражение в монографиях «Протеолиз и протеолитические ферменты в тканях морских беспозвоночных» и «Ферментативные белковые гидролизаты тканей морских гидробионтов: получение, свойства и практическое использование». Всего по материалам диссертации опубликовано 46 печатных работ.
Роль протеолиза в белковом метаболизме
Протеолиз - один из важнейших биохимических процессов, включающий в себя ферментативный гидролиз пептидных связей в веществах белковой природы. Протеолитические ферменты, обеспечивающие этот процесс можно разделить на две группы: пищеварительные и внутриклеточные.
Функции внутриклеточного протеолиза более многогранны и состоят, главным образом, в обеспечении физиологических процессов в органах и тканях, посредством ограниченного (частичного) протеолиза.
Задача пищеварительных ферментов сводится к обеспечению организма азотистыми веществами, которые необходимы для полноценного метаболизма. Пищеварительные железы выделяют в полость желудка и кишечника набор протеиназ, способных расщепить сложные белки, поступающие с пищей, до аминокислот, ди- и трипептидов (Мосолов, 1971). Последние, в свою очередь, усваиваются организмом и используются для анаболических процессов.
Внутриклеточный протеолиз имеет два направления: 1) внутриклеточное переваривание пищевых и инородных частиц, захваченных путем фагоцитоза и пиноцитоза; 2) катаболические процессы белков, составляющих сами клетки. Клетки также выделяют ферменты для внеклеточного протеолиза, в частности для пищеварения и иммунных реакций.
Известно, что протеолиз осуществляется при участии целой системы протеиназ и пептидаз. Огромное разнообразие протеолитических ферментов объясняется, очевидно, большим количеством различных белков, каждый из которых имеет свою субстратную конформацию, особенности аминокислотного состава, доступность пептидных связей для расщепления. Кроме того, для каждого фермента характерна субстратная специфичность, свой оптимум рН, зависимость от температуры, а также локализация в клетке и во внеклеточном пространстве (ВоЫеу, 1987).
В зависимости от локализации протеолитических процессов в организме и условий функционирования, спектр протеиназ значительно варьирует. Так, для полостей, где происходит пищеварение (желудок, кишечник), характерен набор пищеварительных протеиназ: гастриксины, пепсины, трипсины, химотрипсины и др. Состав протеиназ внутри клетки также различен: в цитозоле, митохондриях и рибосомах преобладают протеолитические ферменты, обычно активные при нейтральных рН, в то время как лизосомальная система, дающая максимальный вклад во внутриклеточный протеолиз, содержит катепсины, активные в слабокислой среде. Общим является то, что любая система, где имеют место протеолитические реакции, обладает набором ферментов, способным наиболее эффективно расщепить белок до аминокислот и олигопептидов (Барнард, 1977).
Внутриклеточный протеолиз, деструктивная функция которого направлена на расщепление внутриклеточных компонентов, осуществляется, главным образом, при участии лизосомного аппарата. Он позволяет устранять ошибки в транскрипции, трансляции и в посттрансляционных процессах с освобождением свободных аминокислот в качестве источников энергии из "неправильных" белковых молекул (ВоЫеу, 1987). Лизосомальные протеиназы не только обеспечивают энергией внутриклеточные процессы и избавляют клетку от ненужных белков, но и участвуют в реакциях ограниченного протеолиза, выступают в качестве инструмента выключения и переключения определенных звеньев белкового обмена (Локшина, 1979). Важную роль играют протеолитические ферменты при адаптации клеточного метаболизма к изменяющимся условиям внешней среды, в осуществлении защитных функций организма. Система внутриклеточного протеолиза принимает активное участие в ответе на изменения внутренних и внешних факторов (Лизосомальные ферменты..., 1985; Крупнова, Сидоров, 1985; Немова, Крупнова, Богдан, 1989; Немова, Крупнова, 1990; Кальций-активируемая..., 1993).
Обмен белков достаточно универсален и свойственен всем организмам. Интенсивность белкового обмена характеризует время полураспада. По этому признаку белки условно делятся на четыре главные группы: 1) очень быстро обменивающиеся белки (т/2 1 часа); 2) быстро обменивающиеся белки (т/2 =1-24 часа); 3) медленно обменивающиеся белки (т/2 24 часов); 4) белки устойчивые к действию протеиназ (коллаген, эластин, кератин и др.) (т/2 1 года).
Митохондриальные белки гораздо более стабильны, чем белки ядер, мембран, цитозоля. Локализация белков в митохондриях во многих случаях предохраняет их от протеолитического расщепления. Внутриклеточная локализация деградации очень быстро обменивающихся белков еще не совсем ясна (Intracellular protein..., 1985). Медленно обменивающиеся и значительная часть быстрообменивающихся белков деградируют в лизосомах (Дин, 1981; Barrett, 1975, 1980; Dingle, Fell, 1969; Hanson, Bohley, 1974). Это указывает на важную роль лизосом в общем протеолизе (De Duve, 1983; Hutson, Mortimore, 1982; Kominami, Ueno, 1990). Концентрация протеиназ в лизосомах достигает иногда очень высоких значений (до 1 мМ) (Дин, 1981; Bohley, 1987). Лизосомальная система играет главную роль во внутриклеточном протеолизе, так как она способна лизировать клеточные структуры и обладает огромной протеолитической способностью (Dean, 1980; Vaillant, 1978; Tapper, Sondler, 1990).
Известно, что в клетке может расщепляться белковый материал трех категорий: 1) экзогенные белки, пептиды с разной длиной цепи, поступающие в клетку из окружающей среды или пищеварительных полостей; 2) эндогенные белки, являющиеся частью самой клетки; 3) белковые частицы, синтезируемые клеткой, но предназначенные для удаления из клетки (Gordon, 1973; De Duve, 1983; Bohley, 1987). Абсолютные показатели скорости катаболизма белков зависят от многих факторов, среди которых наиболее важными являются, вероятно, следующие: концентрация субстратных белков; степень доступности пептидных связей (денатурированность) субстратных белков; значение рН среды и наличие или отсутствие ингибиторов протеиназ (Gordon, 1973).
Протеолитические ферменты лизосом (катепсины) имеют максимум активности в зоне рН 2.5-6.5 (Мосолов, 1971; Heath, 1977; Poole, De Duve, 1983; Barrett, Bohley, 1987).
Объекты и методы исследований
Объектами исследований служили представители различных таксонов беспозвоночных Баренцева моря: ракообразных - акклиматизированный камчатский краб Paralithodes camtschaticus, северная креветка Pandalus borealis; моллюсков - исландский гребешок Chlamys islandica, трубач Buccinum undatum, серрипес Serripes groenlandica; иглокожих - морской еж Strongylocentrotus droebachiensis, кукумария Cucumaria frondosa, морские звезды Asterias rubens и Crossaster papposus. Для получения белковых ферментативных гидролизатов использовали также малоценные, в промысловом отношении виды рыб: ската звездчатого Raja radiata, серую триглу (морского петуха) Eutrigla gurnardus, сайку Boreogadus saida, путассу Micromesistius poutassou.
Основная масса указанного сырья была заготовлена сотрудниками ПИНРО в различные сезоны года в Баренцевом море в ходе научно-исследовательских и промысловых рейсов, а также на береговых предприятиях, осуществляющих переработку биоресурсов (пос. Ура-губа, г. Снежногорск) сотрудниками ПИНРО.
Выбор объектов исследований был обусловлен значительными запасами этих видов гидробионтов, недостаточным развитием рациональных технологий их переработки, а также стремлением автора изучить протеолитические системы представителей различных классов морских беспозвоночных.
После разделки животных образцы тканей замораживали и хранили при -25 С до начала анализов. При определении динамики активности протеиназ в процессе созревания половых продуктов, отпрепарированную гонаду делили на две части. Первая фиксировалась для проведения гистологических исследований, а вторая часть замораживалась для дальнейших биохимических опытов.
Для гомогенизации сырья применяли 3-х кратное замораживание (минус 20 С) - оттаивание (5 С) измельченной ткани.
При оценке ростовых свойств питательных диагностических сред, полученных с использованием белковых гидролизатов, объектами исследований служили тест-штаммы следующих микроорганизмов: Shigella flexneri la 8516, Shigella sonnei «S form», Pseudomonas aeruginosa 27/99, Serratia marcescens 1, Corynebacterium xerosis 1911, Escherichia coli 3941/12 (055:K59), Staphylococcus aureus Wood-46, Klebsiella pneumoniae 3534/51, Salmonella typhi 11-901, Salmonella typhimurium 79, Citrobacter freundii 101/57, Staphilococcus aureus 96, Bacillus anthracis СТИ.
При оценке эффективности введения белковых гидролизатов в корма, объектами исследований служили: цыплята-бройлеры и молодь атлантического лосося Salmo salar.
Для осуществления ферментативного гидролиза белоксодержащего сырья использовали различные протеиназы, а также ткани, обладающие протеолитической активностью. В качестве основного ферментного препарата использовали комплекс протеиназ из гепатопанкреаса камчатского краба, полученный по нашей технологии (Мухин, Новиков, .2001; Мухин, 1999). Данный препарат, содержит более 90 % белка и проявляет активность в нейтральной среде по отношению к различным белковым субстратам: казеинату натрия (700 Е/мг); гемоглобину (100 Е/мг) и коллагену (120 Е/мг по Мандлу). Для сравнения эффективности действия использовали ферментные препараты микробиологического происхождения, обладающие протеазной и амилазной активностью - протосубтилин ГЗХ (г. Бердск) и BNZ-720 (Мексика); животного происхождения - панкреатин из поджелудочной железы крупного рогатого скота («ICN Biochemicals», США), а также гепатопанкреас-сырец камчатского краба и ЖКТ радужной форели.
Для определения рН использовали иономер универсальный ЭВ-74 (СССР). Изменение рН растворов осуществляли путем добавления в реакционную смесь растворов NaOH и НС1 (0,1-1 М) при перемешивании.
Гидролиз стандартных белков и белоксодержащего сырья проводили в термостатируемых емкостях при температурах от 5 до 70 С, в диапазоне рН от 3,6 до 9. Продолжительность гидролиза составляла от 1 до 7 часов. Количество вносимых протеолитических реагентов изменяли от 0,2 до 60 г на 1 кг сырья. Гидролиз останавливали кипячением реакционной смеси в течение 15 минут или добавлением избыточного количества ТХУ.
Концентрирование растворов осуществляли на ротационном испарителе PIP-10 М (ОАО «Химлаборприбор», Россия), доводя концентрацию сухих веществ до 50-60 %.
Высушивание концентрированных растворов гидролизатов проводили различными способами: при температуре 70-80 С в лабораторном сушильном шкафу; в вакуумном сушильном шкафу при температуре 50-60 С и вакуумметрическом давлении не менее 90 кПа; в аэрокипящем слое в установке для сушки жидких продуктов А1-ФМЯ на инертном носителе.
Центрифугирование применяли для удаления балластных примесей, используя центрифугу AVANTI J-25 "BECKMAN" (Швейцария). В зависимости от количества и объемов проб центрифугирование проводили при различных условиях: температура +4 С; скорость - от 5 до 25 тыс. об/мин (фактор осаждения 3,5-75,6 тыс. g); объем - от 12 X 10 мл до 6 X 420 мл.
Определение массовой доли общего, аминного и небелкового азота, липидов, остатка после прокаливания (золы) и воды выполняли по методическим рекомендациям ВНИРО (Технохимические исследования..., 1981), А. А. Лазаревскому (Лазаревский, 1955) и Государственным стандартам (ГОСТ 7636-85).
Спектр и тканевая локализация протеиназ морских беспозвоночных
Процесс пищеварения, как известно, обеспечивает расщепление высокомолекулярных биополимеров (белки, углеводы и др.) до мономеров, способных принимать участие во внутриклеточном метаболизме организма (У гол ев, 1961).
Специализированные пищеварительные органы претерпевали эволюционные изменения, которые носят адаптационный характер (Барнард, 1977). Наиболее высокоорганизованная пищеварительная система присуща высшим позвоночным, где осуществляется последовательная механическая и химическая обработка пищевого комка. Химическая обработка включает в себя процессы энзиматического расщепления при участии специализированных ферментов. Высокоспециализированные пищеварительные железы выделяют в полость желудка и кишечника полный набор протеиназ, способных расщепить сложный белок до аминокислот, ди-и трипептидов (Мосолов, 1971). В желудке имеет место денатурация нативной структуры белка и кислотный гидролиз, осуществляемый при участии ферментов - пепсина и гастриксина. В тонком кишечнике происходит щелочной гидролиз, обеспечиваемый трипсином, химотрипсином, эластазой и другими ферментами, активными в этой области рН, а также всасывание образовавшихся низкомолекулярных продуктов. Для проявления максимальной активности этих протеиназ, а значит и наиболее эффективного пищеварения, в полостях, где происходит ферментный гидролиз, создается соответствующий рН. В желудке позвоночных имеются специализированные клетки, выделяющие НС1 в просвет желудка (Western, Jennings, 1970), и система ее нейтрализации в тонком кишечнике (Hendrix, Bayless, 1970; Уголев, 1961). У большинства классов беспозвоночных этого не происходит (Барнард, 1977).
Говоря о ферментах, обеспечивающих процесс пищеварения у морских беспозвоночных, необходимо принимать во внимание особенности этой функции, отличающейся по ряду позиций от позвоночных животных. На схеме 4 приведены сравнительные характеристики системы пищеварительных органов животных различных таксонов.
Схема 4
Пищеварительные системы различных таксонов животных
МОЛЛЮСКИ
1. Ротовое отверстие.
2. Прямой пищевод.
3. Желудок — протоки гепатопанкреаса.(рН - нейтральная)
4. Кишечник а) нисходящий — кристаллический стебелек.
б) восходящий отделы — протоки гепатопанкреаса.
5. Прямая кишка.
РАКООБРАЗНЫЕ
1. Ротовое отверстие.
2. Пищевод.
3. Желудок а) кардиальная часть. (рН - нейтральная) б) пилорическая часть. (рН - нейтральная)
4. Средняя кишка протоки гепатопанкреаса.
5. Задняя кишка (прямая трубка).
ИГЛОКОЖИЕ
1. Ротовое отверстие.
2. Узкий пищевод.
3. Средняя кишка (делает два оборота в полости)(рН - нейтр.)
4. Задняя кишка (очень короткая).
РЫБЫ
1. Ротовой отдел.
2. Пищевод.
3. Желудок желчные протоки печени (рН 2.5-4.0)
4. Тонкий кишечник панкреатическая железа (рН 6.5-8.0)
5. Толстый кишечник.
6. Анальное отверстие.
МЛЕКОПИТАЮЩИЕ
1. Ротовой отдел.
2. Пищевод.
3. Желудок (рН - 0.8-2.0) — Печень с желчным пузырем
4. Тонкий кишечник —панкреатическая железа (рН 7.5-9.5)
5. Толстый кишечник.
6. Прямая кишка.
7. Анальное отверстие
Прежде всего, следует отметить иную, чем у позвоночных дифференциацию пищеварительных органов морских беспозвоночных, очевидно, в силу иной эволюционной судьбы. Гепатопанкреас - образование, характерное для моллюсков и ракообразных - выполняет функции печени и поджелудочной железы. Отделы кишечника выражены слабо и различаются лишь расположением в полости тела, а не выполняемыми функциями, как это имеет место у ряда позвоночных. Кроме того, все морские беспозвоночные не имеют настоящего желудка с кислой секрецией, что принципиально отличает их от позвоночных, у которых первично наличие желудка. Однако у ряда рыб желудок претерпел адаптивную дегенерацию или полную элиминацию.
В своей работе мы предприняли попытку определить у исследованных видов морских беспозвоночных набор ферментов, участвующих в пищеварении, и сделать некоторые предположения о механизме этого процесса. Обнаружено присутствие протеолитической активности при всех значениях рН, в той или иной степени, в пищеварительных органах всех изученных организмов.
Общей чертой для всех изученных объектов является наличие двух пиков активности: в кислой (рН 2,5-3,5) и слабощелочной зоне (рН 7,5-8,5) (рис. 4). Характерно, что пик активности при слабощелочных значениях рН в гепатопанкреасе краба и трубача выше, чем пик активности при низком значении рН. Для представителей иглокожих (кукумария и морской еж) наблюдается обратная картина: доля кислых протеиназ в общей активности их пищеварительного тракта больше чем щелочных. Наличие некоторой протеолитической активности в области рН 4,0-6,0 объясняется, по-видимому, тем, что зависимость активности ферментов от рН инкубационной среды графически описывается колоколообразной кривой (Мосолов, 1971) и в этой области наблюдается перекрывание диапазонов кислых и нейтральных протеиназ.
На данном этапе мы не ставили целью количественно оценить активность протеиназ. Динамика этого показателя в зависимости от различных факторов является предметом огромного числа исследований. Однако нельзя не отметить, что значения протеолитической активности в гепатопанкреасе краба на порядок выше, чем у других объектов (рис. 4). Этот факт был подтвержден многими другими исследователями (Galgani, Nagayama, 1988; Chen, Lu, Tsai, 1991; Purification and..., 1993).
Похожие диссертации на Разработка стратегии получения ферментативных белковых гидролизатов из тканей морских гидробионтов
