Введение к работе
Актуальность темы. Разработка нового поколения вакцин связана с использованием высокоочищенных субъединичных антигенов, способных повысить безопасность и протективность вакцин, получить высокоспецифичный иммунный ответ к бактериальным, вирусным патогенам и опухолевым клеткам. Серьёзным препятствием при создании субъединичных вакцин является недостаточная иммуногенность изолированных антигенов. Поэтому поиск эффективных адъювантов и новых способов презентации антигена иммунокомпетентным клеткам приобретает большую актуальность (Morein, Hu, 2000).
В последнее время пристальное внимание привлекают исследования мультимерной формы представления антигенов в виде иммуностимулирующих комплексов (ИСКОМ). ИСКОМ является стабильным комплексом холестерола (ХОЛ), фосфолипида и суммы сапонинов Qulaja saponaria Molina (QuilA). Иммунизация антигеном в составе ИСКОМ позволяет индуцировать реакции клеточного и гуморального иммунитета, направленные против вирусных и бактериальных антигенов (Kersten, Crommelin, 1995, 2000). Такой способ иммунизации в десятки раз усиливает образование специфических антител по сравнению с использованием убитых возбудителей или липосом (Lovgren, Morein, 1988).
Основной недостаток ИСКОМ – токсичность, обусловленная присутствием QuilA, разрушающего мембраны клеток (Kersten, Crommelin, 1995). Другой важный недостаток – отсутствие методики получения ИСКОМ, пригодной для коммерческого получения качественных препаратов комплекса с воспроизводимыми свойствами (Sun, Xie, 2009). В связи с этим разработка нового эффективного и безопасного носителя антигенов, производство и применение которого было бы экономически выгодно, представляет собой актуальную проблему.
Известно (Sjolander et al., 1997), что различные носители и адъюванты не только усиливают иммунный ответ макроорганизма к антигену, но и обладают иммуномодулирующими свойствами. В связи с этим представляется важным использование природных соединений, подобных по физико-химическим свойствам компонентам классических ИСКОМ. Мы остановили свой выбор на изменении состава липидной компоненты ИСКОМ путем замены фосфолипидов, выделенных из яичного желтка, на гликоглицеролипиды из морских макрофитов, обладающих широким спектром биологической активности в отличие от иммунологически неактивных фосфолипидов. Так, известно, что моногалактозилдиацилглицерол (МГДГ) зеленых водорослей обладает противоопухолевой активностью (Morimoto et al., 1995), сульфохиновозилдиацилглицерол (СХДГ) ингибирует ДНК-полимеразу и обратную транскриптазу ВИЧ (Gustafson et al., 1998; Loya et al., 1998; Ohna et al., 1998). Кроме того, гликоглицеролипиды из морских макрофитов содержат до 80% полиненасыщенных жирных кислот (Sanina et al., 2003, 2004), которые также иммуноактивны и могут модулировать иммуногенность комплекса. Следовательно,
Использованные сокращения: ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография, ГА – гемагглютинин вируса гриппа, ДГДГ – дигалактозилдиацилглицерол, ИСКОМ – иммуностимулирующий комплекс, КД – кукумариозид (сумма моносульфатированных тритерпеновых гликозидов из С. japonica), КДА – кукумариозид А2-2, КДG –кукумариозид G1, ГТА – голотоксин А1, МГДГ – моногалактозилдиацилглицерол, СХДГ – сульфохиновозилдиацилглицерол, ФРА – фрондозид А, ФХ – фосфатидилхолин, ХОЛ – холестерол, IL – интерлейкин, INF – интерферон-гамма, QuilA – сумма тритерпеновых гликозидов Quillaja saponaria
использование тритерпеновых гликозидов голотурий, обладающих выраженной иммуностимулирующей активностью в сверхмалых концентрациях (Aminin et al., 2010), вместо сапонина QuilA позволит повысить эффективность ИСКОМ, а способность тритерпеновых гликозидов голотурий полностью утрачивать токсические свойства в присутствии экзогенного холестерола (Попов,2002) позволит снизить токсичность ИСКОМ.
Цель и задачи исследования. Цель работы – разработка иммуностимулирующих комплексов на основе тритерпеновых гликозидов и гликолипидов из морских гидробионтов, оптимизация состава и метода получения адъювантного носителя антигенов со стандартными свойствами, более низкой токсичностью и более высокой иммуногенностью, чем у классических ИСКОМ.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Выбрать гликолипиды из морских макрофитов, пригодные для построения иммуностимулирующих комплексов.
-
Выбрать сапонины (тритерпеновые гликозиды) из морских голотурий, пригодные для построения иммуностимулирующих комплексов.
-
Исследовать токсичность (гемолитическую активность) выделенных гликолипидов и сапонинов.
-
Установить соотношения между сапонинами, гликолипидами и холестеролом, обеспечивающие наиболее эффективное формирование модифицированных иммуностимулирующих комплексов.
-
Оптимизировать способ получения иммуностимулирующих комплексов для достижения наиболее эффективного их формирования, последующего встраивания белкового антигена и получения препаратов со стандартными свойствами.
-
Исследовать токсичность (гемолитическую активность) полученных иммуностимулирующих комплексов и выбрать наиболее безопасный вариант.
-
Выбрать оптимальный способ введения полученных иммуностимулирующих комплексов в организм млекопитающего, обеспечивающий наибольшую иммуностимулирующую активность.
Основные положения, выносимые на защиту.
1.Оптимальными для формирования модифицированного иммуностимулирующего комплекса являются МГДГ из морских макрофитов и тритерпеновый гликозид из Cucumaria japonica кукумариозид A2-2 (КДА).
2.Полученный комплекс, в отличие от ИСКОМ, является тубулярным иммуностимулирующим комплексом (ТИ-комплексом) и представляет собой тубулярные частицы с внешним диаметром около 16 нм, внутренним диаметром 6 нм и длинной около 500 нм.
3.Оптимальным для формирования ТИ-комплекса является весовое соотношение компонентов кукумариозид А2-2-холестерол-МГДГ 6:2:4.
4.ТИ-комплекс может служить носителем субъединичных антигенов бактериального и вирусного происхождения.
5.ТИ-комплекс обладает высокой адъювантной активностью в отношении тримера порина из Yersinia pseudotuberculosis. Иммунизация субъединичным антигеном в составе ТИ-комплекса более эффективна, чем иммунизация в составе известных адъювантов: ИСКОМ и полного адъюванта Фрейнда, позволяет значительно повысить концентрацию специфических антител, не приводит к развитию побочных реакций.
6.Оптимизированный ТИ-комплекс обладает низкой гемолитической активностью.
7. Иммунизацию необходимо проводить минимально разбавленным препаратом ТИ-комплекса.
Научная новизна и практическая значимость.
Впервые получен высокоэффективный липидный адъювантный комплекс с принципиально новым составом компонентов и суперструктурой. Впервые показано, что гликолипид МГДГ из морских макрофитов может эффективно замещать фосфолипиды в составе ИСКОМ, не изменяя их классической структуры. Впервые установлено, что тритерпеновый гликозид КДА из C. japonica способен заместить сапонины QuilA в иммуностимулирующих комплексах с преобразованием их везикулярной суперструктуры в тубулярную (тубулярные иммуностимулирующие комплексы или ТИ-комплексы). Впервые показано, что разработанный комплекс на основе МГДГ из морских макрофитов и КДА из голотурии C. japonica обладает низкой токсичностью, высокой адъювантной активностью и способен инкорпорировать субъединичные антигены. Показана возможность использования ТИ-комплексов для создания вакцинных конструкций и разработаны оптимальные условия их практического применения.
Выполненные исследования подкреплены двумя патентами «Носитель антигенов» (№2322259) и «Иммуностимулирующий комплекс и его применение» (№ 2010115549), которые могут быть использованы в практической медицине и ветеринарии.
Апробация работы и публикации.
Результаты работы были представлены на следующих конференциях: II региональной научной конференции «Исследования в области физико-химической биологии и биотехнологии» (Владивосток, 2006), X, XI и XIII международной молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии. (Владивосток, 2006, 2007 и 2010), The Third Asian Symposium on Plant Lipids (Yokohama, Japan, 2009), IX региональной конференции студентов, аспирантов вузов и научных организаций Дальнего Востока России (Владивосток, 2010). 8th LIPIDOMICS MEETING «Membranes and Bioactive Lipids» (Лион, Франция, 2011), 52nd International Conference on the Bioscience of Lipids, (Варшава, Польша 2011), The 4th Asian Symposium on Plant Lipids, (Hong Kong, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ, из них 8 статей в ведущих рецензируемых научных журналах.
Структура и объем работы.
