Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Характеристика хрящевой ткани животных 9
1.1.1. Гликозаминогликаны: хондроитинсульфаты, гиалуроновая кислота 11
1.1.2. Коллаген 15
1.1.3. Белки неколлагеновой природы 18
1.1.4. Другие компоненты хрящевого матрикса: коллагеназы, тканевые ингибиторы металлопротеиназ матрикса 21
1.2. Биологическая активность компонентов, входящих в состав хрящевой ткани 26
1.3. Известные способы использования хрящевой и костно-хрящевой ткани сельскохозяйственных животных и рыб для получения биологически активных веществ, обладающих хондропротекторными свойствами 30
2. Материалы и методы исследования 40
2.1. Материалы исследований 40
2.2. Методы исследований 43
2.2.1. Метод определения протеолитической активности ферментов 43
2.2.2. Метод определения коллагенолитической активности ферментов... 43
2.2.3. Количественное определение гексозаминов 44
2.2.4. Количественное определение гиалуроновой кислоты 44
2.2.5. Количественное определение хондроитинсульфатов 45
2.2.6. Метод определения гексоз 46
2.2.7. Определение содержания свободных гексозаминов 46
2.2.8. Определение содержания коллагена 46
2.2.9. Определение неколлагеновых белков 48
2.2.10. Определение фракционного состава ферментативных гидролнзатов из хрящевой ткани гидробионтов методом ВЭЖХ 48
2.2.11. Метод определения ингибиторной активности ферментативных гидролнзатов из хрящевой ткани гидробионтов на казеинолитическую, коллагенолитическую активности ферментов 50
2.2.12. Определение качественного состава свободных дисахаридов методом капиллярного электрофореза 50
2.2.13. Определение состава аминокислот 51
2.2.14. Определение содержания белковых компонентов 51
2.2.15. Метод определения накопления растворимых белковых компонентов 51
2.2.16. Определение острой токсичности ферментативного гидролизата . 52
2.2.17. Исследование противовоспалительной активности ферментативного гидролизата из хрящевой ткани на животных 52
2.2.18. Клинические испытания БАД к пище «Артротин» из хрящевой ткани гидробионтов при полиостеоартрозе 54
2.2.19. Статистическая обработка результатов 54
3. Результаты и обсуждение 55
3.1. Обоснование выбора сырья 55
3.1.1. Размерно-массовая характеристика сырья 55
3.1.2. Химический состав хрящесодержащего сырья и хрящевой ткани гидробионтов 56
3.1.3. Массовая доля хрящевой ткани и содержание гексозаминов в источниках сырья 58
3.1.4. Исследование антипротеазной активности компонентов хрящевой ткани, полученных разными способами 60
3.1.5. Классификация источников сырья, содержащих хрящевую ткань гидробионтов, для получения биологически активных компонентов 64
3.2. Подбор условий деполимеризации протеогликановых комплексов хрящевой ткани гидробионтов 66
3.2.1. Предварительная обработка хрящевой ткани 66
3.2.2. Обоснование параметров ферментативного гидролиза протеог-ликанового комплекса хрящевой ткани 69
3.3. Состав ферментативных гидролизатов из хрящевой ткани гидробионтов 80
3.3.1. Количественное содержание гексозаминов, хондроитинсульфатов, гиалуроновой кислоты, гексоз, коллагена и неколлагеновых белков 80
3.3.2. Фракционный состав ферментативных гидролизатов из хрящевой ткани гидробионтов.. 84
3.3.3.Исследование состава свободных дисахаридов 90
3.3.4. Аминокислотный состав 98
3.3.5. Минеральный состав 99
3.4. Антипротеазная активность ферментативных гидролизатов из хрящевой ткани гидробионтов 102
3.5. Технология биологически активной добавки к пище из хрящевой ткани гидробионтов 106
3.6. Оценка безопасности и исследование биологической активности БАД
к пище «Артротин» 113
3.7 Гехнико-экономические показатели промышленного производства БАД к пище «Артротин» 117
Выводы 118
Список литературы 119
Приложения 134
- Гликозаминогликаны: хондроитинсульфаты, гиалуроновая кислота
- Биологическая активность компонентов, входящих в состав хрящевой ткани
- Исследование противовоспалительной активности ферментативного гидролизата из хрящевой ткани на животных
- Предварительная обработка хрящевой ткани
Введение к работе
Актуальность проблемы. Работы по поиску, выделению и испытанию биологической активности компонентов хрящевой ткани сельскохозяйственных животных и некоторых акул известны с 1950-х годов (Prudden, 1957; Folkman, 1963,1976; Langer, Brem, 1976; Lee, Langer, 1983; Cho, Kim, 2002).
Основными компонентами хрящевой ткани животных являются гликозаминогликаны, такие как хондроитинсульфаты, дерматансульфаты, гиалуроновая кислота, которые вместе с коллагеном II типа образуют сложный протеогликановый комплекс (Слуцкий, 1969; Павлова, 1988).
Имеются многочисленные сведения о влиянии гликозаминогликанов и гексозаминов, являющихся предшественниками макромолекул суставного хряща, на метаболизм и регенерацию хрящевой ткани за счет использования «готового строительного материала» и способности накапливаться в очагах воспаления (Серов, Шехтер, 1981; Игнатова, Гуров, 1990; Palmieri et al„ 1990; Алексеева и др., 1995; Данилевская, Николаев, 2002; Руденко, 2005). Активность гликозаминогликанов определяется количеством функциональных групп в молекуле, обеспечивающих высокую гидрофильность и поверхностно-активные свойства (Шитов, 1992). Количественно преобладающим белком протеогликанового комплекса хрящевой ткани является коллаген, который не только выполняет механические функции, но играет важную роль в дифференциации и пролиферации клеток, что определяет применение этого белка и его растворимых производных при остеопорозе (Пат. РФ 2082416; Пат. WO 9605851; Пат. US 6025327), артритах (Пат. US 5856446; заявка № WO 98/44929). Важную роль в метаболизме хрящевого соединительнотканного матрикса играют тканевые ингибиторы металлопро-теиназ (ТИМП), подавляющие активность эндогенных коллагенолитических ферментов (КФ 3.4.24) - инициаторов воспалительных процессов и деполимеризации хрящевой ткани (Риггз, 2000; Хасигов, 2001; Tryggvason et al., 1987; Fosang et al., 1996; Stracke et al., 2000).
В настоящее время для получения хондропротекторов используется ко-стно-хрящевая ткань крупного рогатого скота (заявка РФ № 97116345/14; пат. РФ № 2153812; заявка WO № 9945798). Наряду с этим перспективными для получения подобных препаратов представляются костно-хрящевые ткани, являющиеся отходами при разделке рыбы и направляемые на получение кормовой муки. Аргументом в пользу привлечения рыбных отходов для получения биологически активных веществ является их недоиспользован-ность и значительный объем. Кроме того, на примере акул известно, что концентрация ТИМП значительно выше у гидробионтов (Lee, Langer, 1983).
В целом о составе хрящевой ткани рыб имеются единичные разрозненные сведения, а для хрящеподобной ткани беспозвоночных они отсутствуют.
Исследование состава биологически активных компонентов хрящевой ткани гидробионтов позволит обосновать и расширить сырьевую базу биопрепаратов, обладающих хондропротекторным действием, и обеспечить рациональное использование рыбного сырья.
Цель работы заключалась в исследовании состава и биологической активности компонентов хрящевой ткани гидробионтов для обоснования технологии биологически активной добавки к пище на ее основе.
Задачи исследований: исследовать химический состав хрящевой ткани гидробионтов и выявить рациональные источники получения БАДов, обладающих хондропротектор-ными свойствами; осуществить подбор рациональных параметров ферментативного гидролиза хрящевой ткани рыб и головоногих моллюсков с помощью протеаз; исследовать антипротеазную активность хрящевой ткани гидробионтов до и после ферментативного гидролиза; определить количественный и качественный состав углеводных компонентов; обосновать и разработать технологию биологически активной добавки из хрящевой ткани гидробионтов на основании ферментативного гидролиза; исследовать состав полученной БАД к пище; провести оценку безопасности, биологической активности и клинические испытания полученной БАД.
Научная новизна. Установлен количественный и качественный состав углеводов хрящевой ткани промысловых гидробионтов Дальневосточного региона.
Научно обоснован биотехнологический способ ферментативной деструкции хрящевой ткани гидробионтов, позволяющий перевести в растворимое состояние биологически активные вещества и сохранить их антипротеаз-ное действие.
Впервые установлено ингибиторное действие компонентов хрящевой ткани рыб и кальмаров, а также препаратов на их основе по отношению к ме-таллопротеиназам и сериновым протеазам. Наличие высокой антипротеазнои активности является основным отличительным признаком препаратов из хрящевой ткани гидробионтов.
Показано, что в процессе ферментативного гидролиза хрящевой ткани гидробионтов образуются свободные три-, ди- и моносульфатированные дисахариди как продукты распада протеогликановых комплексов.
Впервые установлена противовоспалительная активность ферментативных гидролизатов хрящевой ткани гидробионтов при остеоартрите, асептическом воспалении и псевдотуберкулезном инфекционном артрите.
Практическая значимость работы определяется выявлением перспективных источников сырья из костно-хрящевых отходов при разделке промысловых гидробионтов дальневосточных морей для получения БАДов.
Разработан эффективный биотехнологический метод переработки хрящевой ткани гидробионтов, включающий ферментативный гидролиз.
7 Обоснованы рациональные условия предобработки и ферментативного гидролиза хрящевой ткани гидробионтов.
Метод получения препарата защищен патентом РФ № 2250047 «Пищевой общеукрепляющий профилактический продукт из хрящевой ткани гидробионтов и способ его получения».
Разработана и утверждена нормативная документация на ткань хрящевую рыб и головоногих моллюсков мороженую (ТУ № 9283-242-004 72012-03, ТИ № 36-239-03) и БАД к пище «Артротин» из хрящевой ткани гидробионтов (ТУ № 9283-243-00472012-04, ТИ № 36-240-04).
По результатам экспертной оценки и санитарно-гигиенических исследований в Федеральном центре Госсанэпиднадзора РФ «Артротин» соответствует требованиям СанПиН и зарегистрирован как БАД к пище (санитарно-эпидемиологическое заключение № 77.99.03.928.Т.000750.04.04 от 11.04.2004 г).
Препарат выпускается в ОАО «Биополимеры», Приморский край, г. Партизанск с 2004 г. Установлена экономическая эффективность производства.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на региональной конференции «Актуальные проблемы морской биологии, экологии и биотехнологии» (Владивосток, 1999); Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной 140-летию со дня рождения Н.М.Книповича (Мурманск, 2002); Международной конференции "Региональное природопользование и управление морскими биоресурсами: экосистемный подход" (Владивосток, 2003); Международном симпозиуме «Пищевые биотехнологии: проблемы и перспективы в XXI веке» (Владивосток, 2004); 5-м Международном форуме «Биотехнология и современность» (Санкт-Петербург, 2004); 10-м Международном конгрессе по реабилитации в медицине и иммунореабилитации (Афины, Греция, 2005), конференции Общества Биотехнологов России по пищевой и морской биотехнологии (Светлогорск, 2006).
Положения, выносимые на защиту:
Хрящевая ткань гидробионтов является перспективным источником биологически активных компонентов: глюкозамина, хондроитинсульфатов, гиалуроновой кислоты, дисахаридов, коллагена и ингибиторов протеиназ.
Видовые особенности хрящевой ткани гидробионтов проявляются в составе моно-, ди-, трисульфатированных и несульфатированных дисахаридов хондроитинсульфатов и гиалуроновой кислоты и активности тканевых ингибиторов протеиназ.
Биотехнология БАД к пище из хрящевой ткани гидробионтов на основе ферментативного гидролиза обеспечивает получение поликомпонентного продукта, проявляющего хондропротекторные свойства.
Публикации: по теме диссертации опубликовано 13 научных работ.
Структура и объем работы» Диссертация включает введение, обзор литературы, методическую часть, экспериментальную часть, заключение, выводы, список литературы, содержащий 202 источника (в том числе 68 зарубежных). Работа изложена на 157 страницах, содержит 22 таблицы, 33 рисунка и 10 приложений.
Гликозаминогликаны: хондроитинсульфаты, гиалуроновая кислота
Гликозаминогликаны хрящевой ткани животных в основном представлены гиалуроновой кислотой, хопдроитинсульфатами разных типов (А, Б, С, Д, Е), хондроитином и относятся к группе кислых гликозаминогликанов. В зависимости от наличия сульфатных групп гликозаминогликаны подразделяют на несульфатированные (гиалуроновая кислота и хондроитин) и суль-фатированные (хондроитинсульфаты). Благодаря обилию сульфатных, а также карбоксильных групп уроновой кислоты, ГАГ являются полианионами и имеют отрицательный заряд, что позволяет им связываться с белками и ли-пидами. При этом образуются протеогликаны и гликолипиды. Именно отрицательный заряд определяет такие физико-химические свойства ГАГ как высокая вязкость и резистентность к компрессии, что особенно важно для компонентов суставного хряща, суставной жидкости и других элементов опорно-двигательного аппарата. С другой стороны, их взаимодействие с внеклеточными макромолекулами, белками, компонентами клеточной поверхности обеспечивает структурную организацию соединительнотканного матрикса. ГАГ при нейтральных значениях рН связываются со всеми растворимыми коллагенами. Взаимосвязь коллагена и ГАГ обеспечивают прочность, упругость и эластичность хрящевой ткани.
Гиалуроновая кислота (ГК) содержится в основном веществе многих видов соединительной ткани в различных количествах (Balazs, 1965; Степаненко, 1978; Игнатова, Гуров, 1990). В хрящевой ткани она образует крупные полимеры, которые очень гигроскопичны, удерживают большой объем воды и за счет электростатических сил, при определенном рН среды, формирует комплексы с протеогликанами (Марри, Греннер и др., 1993). Молекулы гиа-луроновой кислоты состоят из чередующихся остатков глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина. Эти дисахаридные фрагменты связаны в молекуле р-1,4 связями. По данным разных авторов (Balazs, 1965; Степаненко, 1978; Игнатова, Гуров, 1990) молекулярная масса ГК варьирует от 100.000 до 13.000.000 Да, и ее величина зависит от способов и источника выделения, метода определения. В растворе макромолекула ГК имеет конформацию беспорядочно свернутого клубка. При слабом подкислении растворов гиалуроно-вой кислоты происходит необратимое снижение вязкости в 2,5 раза. Под действием минеральных кислот происходит гидролиз молекулы с образованием глюкозамина, глюкуроновой кислоты, двуокиси углерода и уксусной кислоты. Хондроитинсульфаты (ХС) состоят из чередующихся дисахаридных остатков несульфатированной уроновой кислоты (очень редко сульфатиро-ванной) и сульфатированного N-ацетилгалактозамина. В литературе накоплен значительный объем информации о физико-химических свойствах и особенностях химического строения ХС (Кочетков, 1967; Степаненко, 1978; Иванкин и др., 1984; Tanaka, 1978; D Arcy, Carney, Howe, 1994). Хондроитинсульфаты, из-за биохимического разнообразия дисахаридов (основанном на количестве, положении сульфо-групп и процентного содержания подобных дисахаридов), представляют гетерогенную группу соединений, имеющих различную молекулярную массу и подразделяются на несколько типов: А, Б, С, Д, Е (Abdel Fattah, Hammad, 2001). Как правило, хондроитинсульфаты содержат около 40 дисахаридных компонентов и имеют молекулярную массу от 13 500 до 80 000 Да (Степаненко, 1978). В силу своей гидрофобное ХС с помощью двух типов белков прочно присоединяются к гиалуроновой кислоте. До ста молекул ХС может присоединиться к одной молекуле гиалуроновой кислоты (Марри, Греннер и др., 1993.). Полианионная молекула ХС является неотъемлемой частью протеогликановои структуры и ответственна за ячеистые и физико-химические свойства хряща. Кроме того, ХС служит основой для синтеза гиалуроновой кислоты.
Имеются многочисленные сведения о содержании и качественном составе хондроитинсульфатов и гиалуроновой кислоты в тканях крупного рогатого скота, так как животное сырье является основным источником для их выделения (Balazs, 1965; Иванкин и др., 1984; Мударисова и др., 1997; Иванкин, Неклюдов, 1998). В литературе приводятся данные о гликозаминогл и капах мяса теплокровных животных, где они оценивались как эквивалент степени полимеризации основного вещества мышц, характеризующий процесс созревания мяса (Соловьев, Кузнецова, 1963).
Скрининг гексозаминов в сырье водного происхождения преимущественно проведен в мышцах, коже, слизях на поверхности кожи разных видов промысловых рыб и моллюсков (Сафронова, 1980). По обобщающим данным Ханта (Hunt, 1970), в соединительных тканях морских беспозвоночных находится около 1 % кислых гликозаминогликанов, имеющих сходство с хонд-роитинсульфатами А и С хрящей позвоночных. Методами гистохимии достаточно подробно исследован состав гликозаминогликанов и места их локализации в мышцах, коже и костях рыб (Кузьмин, Сафронова, 1974; Сафронова, 1976). Отдельные участки позвоночной кости различаются по составу гликозаминогликанов. Полоска ткани между хордой и телом позвонка содержит гиалуроновую кислоту и нейтральные гликозаминогликаны, в концах остистых отростков позвонков обнаруживаются гиалуроновая кислота, хондрои-тинсульфат и нейтральные гликозаминогликаны, в волокнистой оболочке позвонка и многих прилегающих к ней мягких тканях - только нейтральные гликозаминогликаны.
Данные по содержанию гексозаминов в костях рыб приводятся без указания возраста объектов (Сафронова, 1980), в то время как имеются достоверные данные, что содержание гексозаминов и их качественный состав у наземных животных, человека и рыб с возрастом изменяется (Слуцкий, 1969; Balazs, 1965; Prodi, І966; Rosenberg et al., 1965; Masumura, 1971). Сведений о количестве гексозаминов именно в хрящевой ткани промысловых гидробио-нтов не приводится вообще. Имеются данные по содержанию гексозаминов в хрящевой ткани кита (Киселев, Мрочков, 1975; Иванкин, 1984) и акулы Squalus acanthias (Doyle, 1968), которые в настоящее время не являются объектами масштабного промысла.
Биологическая активность компонентов, входящих в состав хрящевой ткани
Гликозаминогликаны участвуют в реализации большого числа жизненно важных процессов и входят в состав различных тканей. Кроме структурно-механических функций, они участвуют в процессах биологического узна--вания, межклеточного взаимодействия, где важную роль играют специфические углеводные последовательности гликозаминогликановых цепей, степень их сульфатирования и размер (Слуцкий, 1969; Poole, 1986; Ruoslahti, 1989).
Имеются многочисленные сведения о биологической активности гли-козаминогликанов и препаратов, содержащих гексозамины (Игнатова, Гуров, 1990; Шитов, 1992; Алексеева и др., 1995; Данилевская, Николаев, 2002; Timothy, Michael et all, 2000; AbdelFattah, Hammad, 2001; пат. РФ 2077328; пат. WO 69444). Активность гликозаминогликанов, обусловленная полианионной структурой, зависит от наличия в каждой дисахариднои единице хотя бы одной отрицательно заряженной карбоксильной или сульфатной группы, обеспечивающей высокую гидрофильность и поверхностно-активные свойства, Гиалуронат по сравнению с другими гликозаминогликанами имеет наименьший заряд, тем самым и проявляя наименьшие хондропротекторные свойства.
Кроме этого, гликозаминогликаны являются предшественниками макромолекул суставного хряща, и введение их в организм вызывает определенное стимулирующее действие и облегчает регенерацию хрящевой ткани за счет использования "готового строительного материала" и способности накапливаться в очагах воспаления (Шитов, 1992; Рудеико, 2005). Следовательно, обеспечивая адекватное поступление гликозаминогликанов, в первую очередь глюкозамина (галактозамина) и хондроитина сульфата возможно оказывать регуляторное воздействие на хондроциты и фибробласты, создавая бо-. лее комфортный режим для продукции гликозаминогликанов, протеоглика-нов и коллагена. При этом создаются благоприятные метаболические условия для восстановления клеток при действии на них неблагоприятных факторов.
При пероральном введении глюкозамина моносульфата и хондроитина сульфата было установлено быстрое и практически полное всасьгоание, что свидетельствует об их хорошей биодоступности (Palmieri et al, 1990). Изучение фармакокинетики глюкозамина моносульфата на собаках при всасывании с помощью радиоизотопного метода, было обнаружено, что после однократного орального введения препарат быстро обнаруживался в плазме (t 1/2 = 13 мин) и исчезал из нее (t 1/2 = 118 мин) (Setnikar et al, 1986). Через 30-60 мин было обнаружено его связывание с глобулинами. Пик связывания с глобулинами приходился на 8 ч после применения препарата, затем отмечали постепенное снижение связывания (t 1/2 = 3 дня). При изучении распределения было отмечено быстрое элиминирование из крови в соединительную ткань с избирательным накоплением глюкозамина моносульфата в суставном хряще. Значительные количества были обнаружены в печени и почках. В остальных органах глюкозамин моносульфат был выявлен в следовых количе 28 ствах, что можно объяснить обычными процессами диффузии. Аналогичные исследования были проведены и на кроликах.
Фармакокинетику глюкозамина у человека изучали методом хромато-графического исследования, где было выявлено сходство с результатами, полученными на кроликах и собаках. При изучении биодоступности хондрои-тина сульфата у собаки радиоизотопным методом (Palmieri et al, 1990) было установлено, что при пероральном применении она превышала 70%. Уровень препарата быстро нарастал в плазме с максимумом через 28 ч. При распределении выявлен тропизм к хондроитин-содержащим тканям, в первую очередь суставному хрящу.
Таким образом, гликозаминогликаны имеют высокую биодоступность при пероральном введении и способность избирательно накапливаются в синовиальной жидкости, что делает такую форму их поступления более предпочтительной.
Хондроитин сульфат и глюкозамин обладают широким спектром терапевтического действия и высоким индексом безопасности. Многочисленные исследования по изучению токсичности и побочных эффектов доказали их безопасность (Timothy et al, 2000; Abdel Fattah, Hammad, 2001).
Известно, что гликозаминогликаны являются активными стимуляторами регенерации костной ткани (Серов, Шехтер, 1981). Отмечено ингибирующее действие глюкозамина на образование различных опухолей. Воздействие глюкозамина на рост карциносаркомы проверено in vivo на крысах. При введении глюкозамина внутривенно и подкожно у испытуемых животных (в 56 % случаев) отмечена регрессия опухолей и значительное удлинение срока жизни. Ингибирование роста опухолей наблюдалось при использовании глюкозамина и других аминосахаров. Для иных сахароз подобного эффекта не выявлено (Bekesi et al., 1969; Bekesi, Winzler, 1970).
В исследованиях in vivo показано, что хондроитинсульфаты обладают противовоспалительной активностью, стимулируют синтез гиалуроновой кислоты и протеогликанов и ингибируют действие протеолитических ферментов (Abdel Fattah, Hammad, 2001). Было также показано, что хондроитин-4-сульфат влияет на сердечнососудистую систему. Он высвобождается тромбоцитами и участвует в регуляции свертывания крови, препятствуя образованию тромбов, вызывающих нарушение микроциркуляции в тканях. Предлагают использовать хондроитинсульфаты в комплексах с супсроксиддисму-тазой и каталазой в качестве антитромботических средств (Максимепко и др., 1999). Как компоненты лекарственных средств, хондроитинсульфаты стимулируют пролиферацию эндотелия роговицы глаза (Пат. РФ 2077328, 1997), репарацию кожи (Пат. РФ 2092156, 1997), эффективны при профилактике циститоподобных симптомов (Пат. US 6083933, 2001) и при лечение старческой деменции (Пат. WO 69444, 2001). В клинических исследованиях продемонстрирована эффективность хондроитинсульфата в отношении влияния на болевой синдром и функциональное состояние суставов (Алексеева и др., 1995; Данилевская, Николаев, 2002; Timothy et al., 2000). Лафонт и др. (La-font et al., 1992) отмечают, что хондроитинсульфат-С акульих хрящей при обработке культуры нервных клеток не только увеличивает их рост, но и специфически стимулирует аксонный рост, в то время как дерматансульфат стимулирует рост дендридов. Точный механизм влияния гликозаминоглика-нов на указанные процессы пока не выяснен.
Исследование противовоспалительной активности ферментативного гидролизата из хрящевой ткани на животных
Острую токсичность ферментативного гидролизата из хрящевой ткани осетра, лососевых, кальмара исследовали на базе Пермской государственной фармацевтической академии в соответствии с рекомендациями Фармакологического комитета РФ (Руководство ..., 2000) по Прозоровскому (Прозоровский и др., 1978).
Токсичность определяли на белых лабораторных мышах обоего пола массой 19-20 г. Исследуемый гидролизат из хрящевой ткани гидробионтов вводился однократно в желудок с помощью зонда в виде водного раствора в объеме 1 мл. Препарат вводили в возрастающих дозах: 2500 мг/кг, 3160 мг/кг, 5980 мг/кг и 5010 мг/кг. Каждую дозу вводили 2-м животным. Наблюдение за животными проводили в течение 10 суток, при этом, фиксировали общее состояние животных, особенности их поведения, интенсивность и характер двигательной активности, координацию движений, тонус скелетных мышц, реакцию на раздражители, потребление пищи и воды, сроки гибели или ее отсутствие.
Противовоспалительная активность ферментативных гидролизатов была исследована в НИИ эпидемиологии и микробиологии и оценена на двух модельных системах: 1) модели асептического воспаления вызванного у мышей и 2) на модели инфекционно-аллергического псевдотуберкулезного артрита у кроликов.
Асептическое воспаление вызывали введением в подушечку стопы левой задней конечности мыши 50 мкл 0,75 % раствора каррагинана. В контралатеральную конечность вводили такой же объем изотонического раствора. Препараты, содержащие ферментативный гидролизат (25 %), аскорбиновую кислоту (1,5 %), микрокристаллическую целлюлозу (73,5 %), вводили через зонд в дозировке 1,2 мг/ мышь в сутки в течение 15 дней. Мышам контрольной группы вводили дистиллированную воду. Через 7 и 15 суток после инъекции каррагинана конечность ампутировали по линии голеностопного сустава, взвешивали и определяли разность массы правой и левой конечности по формуле:
% прироста массы лапки = (А В/А) 100 %, где А - масса опытной лапки, В - масса контрольной лапки. Противовоспалительную активность препаратов из хрящевой ткани гидробионтов, представляющих ферментативные гидролизаты, определяли и оценивали по результатам прироста массы лапки после введения препаратов из хрящевой ткани гидробионтов при асептическом воспалении
Экспериментальный артрит вызывали путем антигенного раздражения тканей правого коленного сустава животных, предварительно (за 7 суток) сенсибилизированных культурой псевдотуберкулезного микроба штамм 512. Животных сенсибилизировали подкожным введением в правое бедро суспензии бактерий в дозе 2 10 микробных клеток. Через 7 и 14 суток кроликам в полость коленного сустава в асептических условиях вводили корпускулярный псевдотуберкулезный антиген, доза которого составляла м.к.. Инфицированных животных разделили на две группы: опытная группа (20 кроликов) животных после введения антигена в полость сустава в течение 14 дней получала ежедневно однократно ферментативный гидролизат, растворенный в дистиллированной воде, перорально в количестве 22,5 мг (исходя из расчета: 0,5 мг на мышь массой 20 г); контрольная группа (6 кроликов) не получала лечения (Исачкова, Тимченко, Сомов, 1984).
На базе Приморского краевого центра профилактики остсопороза было проведено клиническое исследование БАД к пище «Артротин» одновременно с обычным медикаментозным лечением НПВС.
БАД применяли 28 пациенток в возрасте от 50 до 55 лет, состоящих на учете в Приморском краевом центре профилактики остеопороза по поводу заболеваний опорно-двигательного аппарата - полиостеоартроза в сочетании с остеопеническим синдромом (доклинической стадии остеопороза). Все испытуемые изъявили желание и дали согласие на участие в клиническом исследовании. БАД принимали по 2 капсулы 2 раза в день в течение 2 месяцев. Наблюдение за пациентками проводилось 6 месяцев от начала приема БАД.
У всех испытуемых диагноз остеоартроза был подтвержден рентгенологически, при этом у 6 была I стадия, у 20 - II и у 2 - III рентгенологическая стадия процесса. Основным клиническим проявлением остеоартроза была боль в суставах.
Контрольную группу составили 15 женщин того же возраста с остеопеническим синдромом (Т-критерий был в среднем по группе - 2,1 ±0,1). Средняя продолжительность заболевания составила 2,1 года, а суммарный индекс Лекена - 6,9, что достоверно не отличалось от пациенток опытной группы. В контрольной группе пациентки в среднем 6,2 дня в месяц вынуждены были принимать НПВП в связи с болями в суставах, что также достоверно не отличалось от пациенток в опытной группе.
В динамике наблюдения проводился осмотр пациенток врачом-ревматологом и оценка выраженности болевого синдрома, функциональной способности суставов. Исходно и через 6 месяцев проводилось исследование плотности костной ткани на ультразвуковом костном денситометре. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью пакета программ Statistica 6.0. и «Microsoft Excel», определяя стандартное отклонение (5), доверительный интервал (р). В настоящее время, при разделке рыбы для пищевых целей остается много недоиспользуемых отходов, в частности костно-хрящевые ткани (головы, плечевые и грудные плавники, позвоночная кость с хвостовым плавником). Однако наличие биологически активных веществ в хрящевой ткани гидробионтов, позволяют использовать их для получения полезных для здоровья человека компонентов и препаратов на их основе. Нами была рассмотрена возможность использования хрящевых и кост-но-хрящевых отходов, образующихся при разделке промысловых видов рыб и головоногих моллюсков Тихоокеанского бассейна. Анализ имеющейся справочной литературы (Кизеветтер, 1971; Справочник по химическому составу, 1998; Бассейновые нормы отходов..., 2003) по массовому соотношению отдельных частей промысловых гидробионтов позволил оценить выход хрящевых и костно-хрящевых отходов, по отношению к неразделанной особи. Установлено, что в сумме голова, плавники и кости (таблица 3) составляют для хрящевых рыб - 20,0-44,1 %, для осетровых рыб - 24,8-41,1%, лососевых - 14,0 - 36,4 % , тресковых - 21,7-48,8%, головы кальмара без щупалец - 5-6 % от неразделашгого сырья. Выход костно-хрящевых отходов гидробионтов определяется возрастными особенностями и зависит от времени вылова объектов. Установленный нами выход собственно хрящевой ткани для хрящевых рыб составляет 15-12 %, калуги - 10 %, лососевых - 5%, тресковых - менее 1 % и кальмаров - 2 %.
Предварительная обработка хрящевой ткани
По количеству гексозаминов, выходу очищенной хрящевой ткани и суммарной антипротеазной активности сырьевые источники для технологических целей нами было предложено ранжировать на три основные группы: I - наиболее перспективные, II - перспективные, III -неперспективные (Рис. 13).
К наиболее перспективным отнесены объекты, в хрящевой ткани которых содержание гексозаминов не менее 2400 мг/% и содержанием хрящевой ткани не менее 10 % от массы гидробионта (акулы, скаты, осетровые рыбы). К перспективным - с содержанием гексозамииов не менее 1000 мг/% и содержанием хрящевой ткани не менее 1,8 % (кальмары). К перспективным для получения биопрепаратов можно отнести виды с содержанием гексозамииов 150-300 мг/% и хрящевой ткани не менее 5% (лососевые рыбы), так как содержание активного начала компенсируется выходом хрящевой ткани. К неперспективным видам отнесли многочисленных в плане уловов рыб семейства тресковых (содержание гексозамииов - 70-80 мг/% и выходом хрящевой ткани около 2 %). На основании этих показателей тресковые рыбы были исключены из последующих исследований.
Таким образом, при выборе сырья, установили предпочтительные объекты. Выявили, что обработка хряща экзогенными ферментами не приводит к потере антипротеазной активности компонентов хрящевой ткани и согласуется с данными об устойчивости тканевых ингибиторов к действию протеоли-тических ферментов (Ponton et а)., 1991). Это послужило основанием подбора рациональных параметров деполимеризации хрящевой ткани гидробионтов при создании промышленной технологии. По содержанию гексозаминов и высокой суммарной антипротеазной активности хрящевую ткань кальмара, лососевых, осетровых рыб, акул и скатов, мы рекомендуем использовать для получения БАД, содержащих эти компоненты. Однако в тканях они содержатся в виде слоборастворимых протеогликановых комплексов. Следовательно, для получения комплексного препарата из хрящевых тканей гидробионтов, необходимо разработать технологию, которая позволяла бы максимально извлечь естественный комплекс компонентов хрящевой ткани, перевести их максимальное количество в растворимое и легкоусвояемое состояние и сохранить антипротеазную актив--ность. Для этого необходимо было изучить основные параметры, протекающие при предварительной экстракции хряща и дальнейших его модификациях в технологическом процессе.
Предварительный анализ сырья и литературные данные (Иванкин, Ва-сюков, Панов, 1984; Мударисова и др., 1997; Иванкин, Неклюдов, 1998; пат. US 6149946; пат WO 96/23512) показали, что компоненты хрящевой ткани возможно частично извлечь в процессе экстракции. Для выделения проте-огликанов предложено огромное количество методов экстракции. Щелочная экстракция весьма эффективна (пат РФ 2162331), но приводит к образованию окрашенных продуктов, подвергшихся химической модификации. Более щадящей является экстракция нейтральными солевыми растворами. Самым «мягким» вариантом экстракции, обеспечивающий частичный выход протеинполисахаридов в состоянии, близком к нативному, является метод экстракции водой (Слуцкий, 1969).
Выбор экстрагента определялся, во-первых, степенью гидрофильности извлекаемых веществ, во-вторых, сохранением нативности структуры экстрагируемых веществ. Так как гликозаминогликаны являются полиэлектролитами, то в качестве растворителя решено было использовать воду и водные растворы хлорида натрия. При проведении исследований влияний ряда параметров на процесс предобработки хрящевой ткани сравнивали содержание гексозаминов в составе экстрагируемых протеогликанов хрящевой ткани гидробионтов в зависимости от концентрации соли при одинаковой продолжительности предобработки (рис 14).
Максимальное количество гексозаминов удается выделить при солевой предобработке 1,0 % раствором хлорида натрия. Установлено, что в этих условиях экстрагируется наибольшее количество гексозаминов и низкомолекулярных белковых компонентов. С увеличением концентрации соли количество экстрагируемых высокомолекулярных протеогликанов значительно уменьшается. Содержание свободных и связанных гексозаминов, перешедших в раствор после солевой экстракции, отражено в таблице 7. Увеличение концентрации соли не оказывает влияния на содержание свободных гексозаминов. При предобработке 1 % хлоридом натрия выход гексозаминов в 5 раз выше, чем при экстракции водой. Установленная оптимальная концентрация соли в дальнейшем использовалась при предобработке хрящевой ткани других объектов.
Влияние продолжительности предобработки на количество экстрагируемых гексозаминов хрящевой ткани различных видов гидробионтов отражено на рис 15. В результате установлено, что при предобработке хрящевой ткани акулы, скатов, осетров в течение 8 -12 ч 1 %-ным раствором хлорида натрия экстрагируется до 30 % гексозаминов. При дальнейшей предобработке выход гексозаминов не меняется. Это свидетельствует о том, что концентрация гексозаминов в ткани и в растворе становится практически одинаковым. Дальнейшее настаивание хрящевой ткани не способствует выходу гексозаминов раствор. При настаивании хрящевой ткани лососевых рыб 20 %-й выход гексозаминов происходит в течение 3 ч, 30 %-й выход гексозаминов из хрящевой ткани кальмара через 4-5 ч.
