Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Краткая история создания акустического микроскопа 12
1.2. Акустическая микроскопия в исследованиях мягких биологических тканей 14
1.2.1. Акустическая гистология - исследование тонких срезов тканей 15
1.2.2. Акустическая цитология 18
1.2.3. Неинвазивные методы исследования микроструктуры тканей 22
1.3. Применении акустических микроскопов для исследования минерализованных тканей и хряща 25
1.3.1. Основные сведения о строении и механических свойствах минерализованных тканей и хряща 26
1.3.1.1. Костная ткань 26
1.3.1.2. Ткани зуба 32
1.3.3.1. Хрящ 35
1.3.2. Данные литературы об исследованиях минерализованных тканей и хряща с использованием акустических микроскопов 40
1.3.2.1. Костная ткань 40
1.3.2.2.3уб 45
1.3.3.1. Хрящ 52
1.3.3. Искусственные заменители биологических тканей 55
Заключение 56
ГЛАВА II. Аппаратура и методы исследования 60
2.1. Физические принципы работы акустического микроскопа 60
2.1.1. Физические основы формирования контраста изображений в акустическом микроскопе 61
2.1.2. Скорость ультразвука и акустический импеданс 64
2.2. Характеристики сканирующих акустических микроскопов, использованных при проведении исследований 65
2.2.1. Короткоимпульсные сканирующие акустические микроскопы, разработанные в ИБХФ РАН 65
2.2.2. Сканирующий акустический микроскоп «SONIX» фирмы Соноскан, США 68
2.2.3. Сканирующий акустический микроскоп «ELSAM» 69
2.3. Методы получения акустических изображений и формыпредставления информации в акустической микроскопии 69
2.4. Механизмы формирования артефактов акустическихизображений 72
2.5. Оптическая микроскопия и микроанатомический анализ 76
2.6. Количественные исследования с использованием акустического микроскопа 76
2.7. Связь акустических и механических параметров биотканей 78
2.8. Характеристика экспериментальных объектов и объем проведенных исследований 81
2.8.1. Подготовка биологических образцов для исследования 81
2.8.2. Стоматологические пломбировочные материалы 84
2.8.3. Характеристика материалов, используемых для замещения дефектов костной ткани 86
2.9. Статистическая обработка результатов исследования 87
2.10. Биологические эффекты ультразвука 89
ГЛАВА III. Собственные методические разработки 91
3.1. Хранение образцов и использование фиксаторов 92
3.2. Выбор иммерсионной жидкости 99
3.3. Специализированные методы, разработанные для исследования структуры и свойств биологических тканей и их синтетических аналогов 101
3.3.1. Метод измерения скорости ультразвука в образцах биологических тканей и замещающих их материалов 101
3.3.2. Неразрушающий метод количественной оценки упруго-механических свойств биологических тканей и их искусственных заменителей 102
3.3.3. Метод получения акустических изображений (С-сканов) поверхности плоско-параллельных препаратов 103
3.3.4. Особенности морфометрии структурных элементов тканей и материалов на изображениях, полученных в акустическом микроскопе 103
3.3.5. Неповреждающий метод получения акустических изображений внутренней структуры (Б- и С-сканов) на плоско параллельных препаратах 104
3.3.6. Неинвазивный метод измерения толщины слоев биологических тканей на плоско-параллельных препаратах 105
3.4.Особенности исследования в акустическом микроскопе объектов с неровной поверхностью 106
3.4.1. Метод исследования внутренней структуры биологических объектов с неровной поверхностью 109
3.5. Основные положения комплекса специализированных методов для исследования минерализованных тканей и замещающих их искусственных материалов с помощью акустического микроскопа 110
ГЛАВА IV. Исследование микроструктуры и свойств костной ткани 113
4.1.Результаты исследования микроструктуры костной ткани в акустическом микроскопе 113
4.2. Количественная оценка состояния образцов костной ткани по измерению скорости продольного распространения ультразвука 125
4.3. Исследование взаимосвязи микроструктуры, акустических и механических свойств компактной костной ткани при моделировании изменений ее композиционного состава 126
4.3.1. Деминерализация 126
4.3.2.Деорганификация 133
4.3.3. Дегидратация 137
4.4. Методические подходы к оценке возможности прижизненныхисследований костной ткани 13
4.4.1. Исследование костной ткани эмбрионов травяной лягушки. 141
4.4.2. Исследование костной ткани эмбрионов перепелки 144
4.5. Перспективы прижизненных исследований костной ткани человека 147
Заключение 148
ГЛАВА V. Исследование микроструктуры медицинских полимерных композитов на основе полиамида, полиэтилена и гидроксиапатита методами акустической микроскопии 152
5.1. Микроструктура поверхности образцов медицинских композитных материалов по данным акустической микроскопии 152
5.1.1. Материалы на основе полиамида 152
5.1.2. Материалы на сверхвысокоплотного полиэтилена 159
Заключение 165
ГЛАВА VI. Акустическая микроскопия в исследовании твердых тканей зуба 167
6.1. Гистологические особенности твердых тканей зуба на акустических изображениях 167
6.1.1. Микроструктура тканей зуба в норме 167
6.1.2. Тканизубапри патологии 174
6.2. Количественная оценка акустических параметров тканей зуба с использованием акустического микроскопа 181
6.3. Исследование возможности количественной оценки тканей зуба по особенностям отражения ультразвукового сигнала 187
6.3.1. Исследование отражения ультразвука на плоской поверхности продольных спилов зуба человека 188
6.3.2. Исследование нешлифованной поверхности цельного зуба 191
6.4. Экспериментальные исследования внутренней структуры зуба 194
Заключение 203
ГЛАВА VII. Акустомикроскопическое исследование стоматологических пломбировочных материалов 206
7.1. Исследование микроструктуры цементов, используемых для пломбирования корней зубов 206
7.2. Взаимосвязь акустических параметров, микроструктуры и механических свойств стеклополиалкенатного цемента «Дентис» 213
7.2.1. Результаты оценки акустических и механических параметров образцов цемента «Дентис», приготовленных с различным исходным соотношением порошка и воды 214
7.2.2. Результаты исследования микроструктуры поверхности образцов цемента «Дентис», приготовленных с различным соотношением воды и порошка при замешивании 216
7.3. Оценка качества пломбирования зубов с применением гуттаперчевых штифтов 221
7.3.1. Исследование микроструктуры герметика 221
7.3.2. Исследование микроструктуры гуттаперчи 222
7.3.3. Оценка результатов пломбирования с помощью гуттаперчи и силлера на плоско-параллельных срезах 223
7.4. Оценка возможности исследования пломбировочного материала на целом зубе 229
Заключение 232
ГЛАВА VIII. Морфо-физиологическое исследование хряща и костной ткани в суставе бедренной кости млекопитающих методами акустической микроскопии 233
8.1.Результаты исследования структуры суставного хрящана продольных спилах 233
8.2. Количественная оценка состояния хряща 243
8.3. Комплексное морфологическое исследование состояния хряща на целых головках суставов с применением акустического микроскопа 250
Заключение 257
Обсуждение результатов 260
Выводы 285
Список цитируемой литературы 288
- Акустическая микроскопия в исследованиях мягких биологических тканей
- Характеристики сканирующих акустических микроскопов, использованных при проведении исследований
- Выбор иммерсионной жидкости
- Основные положения комплекса специализированных методов для исследования минерализованных тканей и замещающих их искусственных материалов с помощью акустического микроскопа
Введение к работе
Актуальность проблемы. Разработка научно-методических основ комплексного структурно-функционального анализа биологических тканей и их синтетических заменителей, создание новых эффективных методов диагностики состояния живых систем являются актуальными задачами современной биологии и медицины [Е.В.Боровский, В.К.Леонтьев, 2001; А.ИЛЗоложин и др., 1999; Ю.И.Денисов-Никольский и др., 2003; СГШиронов и др., 2001; В.Н.Павлова и др., 1988; В.И.Савельев, 1996; P.Ammann, R.Rizzoli, 2003; G.Boivin, PJ.Meunier, 2003; R.G.Craig, J.M.Powers, 2001; P.Laugier et al., 2000, 2002]. В существующих приборах, предназначенных для исследования микроструктуры, формирование контраста изображений имеет различную физическую природу и может быть обусловлено вариациями: диэлектрических свойств вещества (оптическая и трансмиссионная электронная микроскопия), микрорельефа поверхности (сканирующая электронная микроскопия), физической плотности (рентгенография, денситометрия, компьютерная томография) и др. Появление акустической микроскопии открыло возможности для изучения пространственного распределения механических характеристик биологических тканей с одновременным анализом их микроструктуры. Контраст изображений, получаемых в акустическом микроскопе, определяется особенностями взаимодействия с объектом акустической (упруго-механической) волны, сфокусированной в тонкий ультразвуковой пучок диаметром от нескольких сотен до долей микрона. Это позволяет получать сведения не только о закономерностях распределения физико-механических свойств на поверхности и в толще образца в виде растровых (точечных) изображений, но и осуществлять количественную оценку локальных значений акустических параметров (скорость звука, акустический импеданс, поглощение) на микроскопически малых участках ткани или материала [С.И.Березина, 1979; М.А.Кулаков, А.И.Морозов, 1983; Р.Г.Маев, 1988, 2002; G.A.D.Briggs, 1992; М.Норре, 1985; R.A.Lemons, C.F.Quate, 1974, 1975; R.D.Weglein, 1979, 1980 и др.]. При этом ведущее значение приобретает тесная связь акустических параметров с механическими свойствами вещества исследуемого образца, благодаря чему изучение в акустическом микроскопе дает возможность на одном и том же образце сопоставить особенности его микроструктуры с локальными значениями механических показателей (модуль упругости, модуль сдвига, коэффициент Пуассона) [Y.Bar-Cohen, 1996; R.E.Green, 1973; J.A.Hildebrand, D.Rugar., 1984; D.A.Sinclair et al., 1984 и др.].
Важным и перспективным представляется применение акустомикроскопических методов для комплексного исследования микроструктуры и механических свойств биологических тканей, выполняющих опорную функцию: костной ткани, хряща, эмали и дентина зубов. Углубленное исследование морфо-механических взаимосвязей в этих тканях имеет большое значение для решения ряда практических вопросов экспериментальной биологии, медицинской диагностики, поскольку нарушение соответствия структуры и функционального состояния ткани, обеспечивающего адаптивные возможности в условиях воздействия разнообразных факторов среды, является решающим в распознавании стадии перехода от нормальных процессов к патологическим [П.К.Анохин, 1980; А.Й.Воложин, Ю.К.Субботин, 1987; Ю.И.Денисов-Никольский, 1996; А.Г.Кочетков и др., 1997; Д.С.Саркисов, 1994].
В настоящее время акустические микроскопы применяются, главным образом, для исследования микроструктуры и механических свойств металлов, сплавов, современных промышленных материалов [Р.Г.Маев, 2000; G.B.Chapman, 2000; G.M.Crean et al., 1995; G.C.Knollman, R.C.Yee, 1988; J.Krautkramer, H.Krautkramer, 1983; A.J.Miller, 1985 и др.]. Разработаны специализированные акустомикроскопические методы для некоторых видов мягких тканей - кожи, тканей глаза, а также для исследования живых клеток в культуре [T.Agner, J.Serup, 1989, 1990; P.Altmeyer et al., 1992; J.Bereiter-Hahn et al., 1992, 2002; F.S.Foster et al., 1990, 1993; J.A.Hildebrand, D.Rugar, 1984; C.J.Pavlin, F.S.Foster, 1994, 1995; J.Serup et al., 1984; R.H.Silverman et al., 1995, 1997]. Применению акустического микроскопа для исследования минерализованных тканей и хряща посвящены лишь единичные работы. Содержащиеся в них сведения являются отрывочными и не дают детального представления об акустических свойствах этих биологических тканей на микроскопическом уровне. Существенным фактором, тормозящим развитие микроскопических ультразвуковых исследований, является отсутствие научно обоснованных методов изучения тканей и их синтетических заменителей с учетом биологических аспектов. Важность углубленного изучения взаимосвязи структуры и биофизических свойств на уровне тканей не вызывает сомнений. Выяснение структурно-функциональных связей в тканях является не только фундаментальной, но и прикладной проблемой, решение которой позволяет раскрыть механизмы возникновения и развития многих распространенных заболеваний, научно обосновать разработку эффективных методов их лечения [Д.С.Саркисов, 1994]. Этим и определяется актуальность разработки научно-методических основ применения акустической микроскопии для неповреждающего комплексного исследования структуры и механических свойств биологических тканей и их синтетических заменителей.
1.2. Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования являлась разработка научно-методических основ применения акустической микроскопии для комплексного анализа структуры и физических свойств биологических тканей и синтетических материалов медицинского назначения. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать методологию комплексного структурно-функционального анализа биологических тканей и их синтетических аналогов с использованием теоретических и экспериментальных подходов акустической микроскопии.
2. Исследовать акустические свойства тканей, выполняющих опорную функцию (минерализованные ткани и суставной хрящ), в норме и при некоторых патологических состояниях.
3. Изучить закономерности структуры минерализованных (костная ткань, эмаль и дентин зуба) и неминерализованных (хрящ) тканей в норме, при патологических и моделируемых в условиях эксперимента состояниях на основе анализа акустических изображений.
4. Установить структурно-функциональные взаимосвязи в биологических тканях с учетом их композиционного состава по данным акустической микроскопии.
5. Оценить возможности применения методов акустической микроскопии для исследования стоматологических пломбировочных материалов.
6. Провести экспериментальный анализ возможностей неинвазивной оценки состояния минерализованных биологических тканей с применением акустической микроскопии.
1.3. Научная новизна результатов. Разработана методология исследования биофизических свойств различных тканей и их синтетических заменителей с учетом их реального состояния, позволившая впервые:
-выявить взаимосвязи между акустическими и механическими параметрами, необходимые для интерпретации результатов
неразрушающего количественного анализа физико-механических свойств минерализованных тканей и хряща;
-на основе изображений, получаемых с помощью акустического микроскопа, провести комплексный анализ морфо-функциональных характеристик Биологических тканей и их искусственных аналогов (костная ткань, дентин и эмаль зуба, хрящ, стоматологические пломбировочные материалы, медицинские композиты);
-осуществить комплексное исследование костной ткани в норме и в процессе воздействия различных физико-химических факторов, приводящих к изменениям ее композиционного состава;
-сформулировать основные принципы использования акустических микроскопов для неразрушающих исследований синтетических материалов медицинского назначения на основе установленных в работе закономерностей связи микроструктуры, акустических и механических параметров;
-показать эффективность использования методов акустической микроскопии для выявления дефектов, возникающих при затвердевании стоматологических пломбировочных цементов, а также для контроля формирования структуры и механических свойств в зависимости от исходного состава;
-провести детальное исследование микроструктуры и акустических свойств тканей зуба млекопитающих в норме и установить характер их изменений при возникновении некоторых патологических состояний;
-определить скорость звука и акустический импеданс хряща в норме и при патологических изменениях и на основе выявленных структурно-функциональных взаимосвязей разработать новый метод измерения толщины суставного хряща, а также оценки состояния поверхности субхондральной кости без изготовления специальных препаратов.
1.4. Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты позволили создать теоретические и практические основы для широкого внедрения сравнительно нового научного метода - акустической микроскопии, - в медико-биологические исследования и медицинское материаловедение. Разработаны научно-методические подходы к практическому применению акустической микроскопии для решения разнообразных задач экспериментальной биологии и медицины, в том числе для неинвазивной оценки морфо- функционального состояния минерализованных тканей и хряща в норме, при различных неблагоприятных воздействиях или наличии патологических изменений.
Полученные новые данные об особенностях микроструктуры и акустических свойствах эмали, дентина, костной ткани и хряща расширяют представление о структурно-функциональных взаимоотношениях в тканях в норме и патологии, при выборе адекватных методов лечения, подборе искусственных материалов или биоимплантатов для замещения дефектов пораженных тканей.
Результаты диссертации имеют фундаментальное и прикладное значение и могут найти применение как в научно-экспериментальных исследованиях в области биофизики, биоматериаловедения, морфологии, общей патологии, так и при создании новых медицинских диагностических приборов.
Научно-практические положения, отражающие особенности взаимосвязи между структурной организацией ткани и ее механическими свойствами, вносят вклад в развитие нового научного направления - акустической гистологии.
1.5. Реализация результатов исследований. Новые сведения о структурно-функциональных взаимосвязях в минерализованных тканях, а также предложенный комплексный метод исследования минерализованных тканей, внедрены в практику работы Международного Центра по исследованию современных .материалов Института биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН. Результаты диссертационной работы используются в практике научных исследований в Центральном научно-исследовательском институте стоматологии, в Межведомственном научно-исследовательском и учебно-методическом центре биомедицинских технологий, в Московском государственном медико-стоматологическом университете, в МГУ им. М.В.Ломоносова, ЗАО «Стомадент», МГАВМиБ им. К.И.Скрябина.
1.6. Рекомендации по использованию научных положений.
Результаты диссертации необходимо учитывать в практике работы кафедр гистологии, морфологии человека и животных, биофизики, биоматериаловедения, травматологии и ортопедии. Полученные данные могут быть использованы при составлении учебных пособий по биологии, биофизике, функциональной и видовой морфологии, биомеханике и медицинскому материаловедению, их целесообразно включать в учебный процесс биологических, медицинских и ветеринарных ВУЗов.
Результаты диссертации представляют интерес для фундаментальных исследований, связанных с изучением механизмов изменения структуры и механических свойств биологических тканей, а также их синтетических заменителей в условиях воздействия биохимических, физико-химических, механических факторов и экологических стрессоров.
Установленные акустические параметры минерализованных тканей в норме и в условиях патологии следует использовать при разработке новых диагностических приборов в челюстно-лицевой хирургии, стоматологии, травматологии и ортопедии, для оценки состояния биоимплантатов в процессе консервации и хранения.
Разработанные методы акустомикроскопического анализа тканей могут быть использованы в патоморфологических исследованиях как в комплексе с классическими методами, так и самостоятельно.
Уточненные данные локальных значений скорости ультразвука и акустического импеданса биологических тканей необходимо учитывать в практике медицинской ультразвуковой диагностики.
1.7. Апробация работы. Материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на Ученом совете ИБХФ им.Н.М.Эмануэля РАН, 1999; П-м Съезде биофизиков России, Москва, 1999; на семинарах Школы физики Виндзорского университета, (Канада), 1999, 2000, 2001, 2003 гг.; на международном конгрессе «World Congress on Medical Physics and Bioengineering», Чикаго (США), 2000; на международном конгрессе «Medical Imaging» 2000, Калифорния (США), 2000; на 25-м, 26-м и 27-м международных симпозиумах «Acoustical Imaging», Бристоль (Великобритания), 2000; Виндзор (Канада), 2001; Саарбрюкен, (Германия), 2003; на научной конференции «Костная пластика в современной травматологии и ортопедии», Москва, 2001; на IV Украинской конференции «Остеопороз: эпидемиология, клиника, диагностика, профилактика и лечение», Харьков, 2001; на 1-м Евразийском конгрессе "Медицинская физика", 2001; на семинаре по биомеханике Института механики МГУ, 2001; на семинаре кафедры биофизики биологического факультета МГУ, 2001; на 29 совещании Института механики МГУ «Биомеханика-2002», Москва, 2002; на научных конференциях НИЦ БМТ, Москва, 2000, 2002; на биофизическом семинаре ИБХФ им.Н.М.Эмануэля РАН, 2003; на 5-м Международном конгрессе по морфологии, Уфа, 2002; на 6-й Всероссийской конференции по биомеханике, "Биомеханика-2002", Нижний Новгород, 2002; на заседании Проблемной комиссии «Репродукция клеток, тканей и биопротезирование»
Межведомственного научного Совета РАМН и МЗ РФ, Москва, 2003; на 5-й научно-технической конференции «Медико-технические технологии на страже здоровья, Шарм-Эль-Шейх, Египет, 2003.
1.8. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 333 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания использованной аппаратуры, объектов исследования и 6 глав описания исследований, включающих собственные методические разработки, полученные результаты и их обсуждение. Далее следуют выводы, библиографический список использованной литературы (130 отечественных и 374 зарубежных источника). Текст содержит 34 таблицы и 106 иллюстраций.
1.9. Основные положения диссертации, выносимые на защиту.
1. Разработанная методология комплексного структурно-функционального анализа биологических тканей и их синтетических аналогов с применением акустической микроскопии, представляющая собой совокупность высокоинформативных методов изучения структуры и физико-механических свойств на одном и том же объекте с учетом его реального состояния, расширяет возможности гистоморфометрических и биомеханических исследований, повышает их точность, эффективность, обеспечивает воспроизводимость получаемых данных.
2. Скорость звука и акустический импеданс, являясь интегральным отражением особенностей микроструктуры, химического состава, плотности и локальных упруго-механических характеристик, могут служить критериями оценки нарушений композиционного состава (изменение гидратации, соотношений минерального, органического компонентов) костной ткани, возникающих при патологических процессах или моделируемых в условиях эксперимента. Изменения акустических показателей имеют большую выраженность по сравнению со значениями физической плотности и находятся в прямой взаимосвязи с характеристиками механической прочности.
3. Для зубов человека в норме характерна широкая вариабельность величин скорости звука в эмали (от 5450 до 6200 м/с) и дентине (от 3360 до 4500 м/с), обусловленная индивидуальными особенностями и состоянием организма (возраст, характер питания и т.д.); различия скорости звука в норме в пределах одного зуба не превышают 4,5% для эмали и 5,5% для дентина. При патологических изменениях (кариес) скорость звука в эмали и дентине по сравнению с аналогичными показателями здоровых тканей того же зуба снижается на 8-18%; относительная величина интенсивности отраженного ультразвукового сигнала в области кариозного поражения на 10-30% ниже, чем в области здоровой эмали того же зуба.
4. Наружный, средний и поверхностно-глубокий слои суставного хряща характеризуются специфическими морфологическими особенностями и закономерным распределением региональных акустических свойств: акустический импеданс межклеточного вещества в наружном и поверхностно-глубоком слоях выше, чем в среднем слое. Наблюдаемое с возрастом уплотнение межклеточного вещества сопровождается увеличением скорости звука в хряще (от 1670м/с у молодых до 1710 м/с у старых животных), а нарушение структурной организации (появление трещин, деформация лакун хондроцитов, разволокнение и т.п.) - снижением скорости звука (до 1590 м/с); сочетанное проявление этих двух состояний обусловливает индивидуальную вариабельность величины скорости звука в суставном хряще в широких пределах.
5. В твердых минерализованных тканях размеры зон патологических нарушений, регистрируемые на акустических изображениях, превышают таковые, полученные в световом микроскопе.
Это свидетельствует о возможности выявления реальных размеров областей функциональных изменений посредством измерения акустических характеристик, что не позволяют другие методы, базирующиеся на измерении минеральной плотности (оптическая микроскопия, денситометрия и др.).
6. Разработанный и экспериментально апробированный акустомикроскопический метод, позволяющий осуществлять комплексный количественный неразрушающий морфо-механический анализ биоимплантатов и искусственных медицинских композитов в условиях их ограниченного (несколько мм) количества, является эффективным инструментом для осуществления адекватного индивидуального подбора материалов в соответствии со структурой и механическими свойствами замещаемых тканей в челюстно-лицевой хирургии, стоматологии, травматологии и ортопедии.
Акустическая микроскопия в исследованиях мягких биологических тканей
Первые акустические изображения биологических тканей были получены создателями сканирующей акустической микроскопии R.A.Lemons и C.F.Quate [1974, 1975]. Уже тогда были очевидны достоинства акустической микроскопии - высокий- контраст акустических изображений, возможность работать с нативными тканями и живыми клетками, наблюдать биологические процессы в реальном масштабе времени. Но главное - акустические изображения, в отличие от оптических и электронно-микроскопических, передают иную -механическую микроструктуру исследуемого объекта. Анализ опубликованных по этой проблеме работ позволил выделить три основные направления, наметившиеся в исследованиях с использованием акустического микроскопа: 1) акустическую гистологию — изучение микроструктуры тканей на тонких срезах; 2) акустическую цитологию - прижизненные исследования микроструктуры и механических свойств культивируемых клеток; 3) прижизненные исследования тканей с практическим выходом в неинвазивную медицинскую диагностику. 1.2.1. Акустическая гистология - исследование тонких срезов тканей Поскольку вплоть до середины 80-х годов ткани внутренних органов исследовались, главным образом, в сканирующих лазерных микроскопах или сканирующих акустических микроскопах трансмиссионного типа, необходимо было готовить достаточно тонкие срезы. Техника подготовки препаратов для подобных исследований имела много общего с методами классической гистологии.
Тонкие срезы изготавливали либо после фиксации, обезвоживания и заключения в парафин или полимерные смолы, либо после замораживания образца на замораживающем микротоме. Такая обработка была необходима для обеспечения жесткости образцов и получения правильных плоскопараллельных препаратов. В ряде работ методического характера было установлено, что различные способы фиксации и дальнейшей обработки оказывают разное влияние на акустические свойства биологических тканей, особенно на поглощение [H.Okawai et al., 1988; H.Sasaki et al., 2002; Van der Steen et al, 1992a,b]. В частности, после фиксации формалином выявлено снижение скорости звука в печени на 0,9-1,5% [J.C.Bamber et al., 1979; A.F.W.Van der Steen et al., 1992(b,c)], в тканях мозга на 0,6% [F.W.Kremkau et al., 1981]. Заключение в парафин приводит к значительному уменьшению скорости звука и существенному повышению поглощения. Фиксация этанолом и формалином изготовленных в замораживающем микротоме срезов улучшала качество акустических изображений. В отдельных работах исследовали нефиксированные незамороженные образцы тканей, покрытые майларовой или полиэтиленовой пленкой [A.F.W.Van der Steen et al., 1991]. В этот период было получено большое количество акустических изображений тонких срезов самых разнообразных тканей человека и животных: легкого, почки, печени, миокарда, селезенки, кожи, склеры глаза, семенников, мышц [О.В.Колосов и др.,1986,1987; М.А.Кулаков, А.И.Морозов, 1985(6); Р.Г.Маев, 1985, 1988; Р.Г.Маев и др., 1989; Т.А.Сенюшкина, 1988; P.L.Carson et al., 1991; A.Korpel et al.,1971; L.W.Kessler, 1974; R.A.Lemons, C.F.Quate, 1975; H.Okawai et al., 1987; RSasaki et el., 1997; D.A.Sinclair et al.,1984; D.A.Sinclair, Smith, 1982; K.M.Tervola, 1985 и др.]. При исследовании тканей одним из важнейших является вопрос о корреляции тканевого состава с акустическими свойствами. Механические свойства на уровне ткани определяются содержанием воды, свойствами соединительной ткани, давлением в кровеносных сосудах и интерстициальной жидкости, особенностями межклеточного вещества, агрегацией и взаимодействием клеток. О Брайеном с соавторами [W.D.O Brien et al.,1988] было установлено, что скорость ультразвука в ткани печени не зависит от содержания протеинов, но находится в положительной корреляции с содержанием воды и в обратной связи с содержанием липидов, а поглощение звука увеличивается с возрастанием содержания в печени гликогена [P.L.Carson et al., 1991]. С помощью акустического микроскопа были не только получены первые изображения срезов тканей, но и уточнены их основные акустические параметры — поглощение, скорость звука, акустический импеданс. Результаты ряда исследований [Р.Г.Маев, 2002; Т.А.Сенюшкина 1988; W.D.O Brien, 1977, 1981; S.Fields, F.Dunn, 1973] позволили связать проявление акустического контраста отдельных гистологических структур с содержанием в них фибриллярных белков. Из гистологических исследований в оптической микроскопии известно, что злокачественные образования, как правило, связаны с разрастанием коллагена [А.Хэм, Д.Кормак, 1982]. Поэтому возникло предположение, что такого рода нарушения в тканях будут хорошо выявляться в акустической микроскопии. Первые эксперименты в этом направлении были выполнены R.A.Lemons и C.F.Quate [1975], которые получили высококонтрастные изображение тонких (5 мкм) срезов фиксированной формалином опухоли молочной железы в трансмиссионнм акустическом микроскопе на частоте 600 МГц. Тем самым была продемонстрирована возможность быстрого выявления патологических нарушений без необходимости использования трудоемких методов окрашивания [R.A.Lemons, C.F.Quate, 1975]. В лазерном сканирующем акустическом микроскопе на срезах, полученных в замораживающем микротоме, изучена динамика изменений акустических параметров и микроструктуры кожи собаки в области заживающей раны [W.D.O Brien et al., 1981; J.E.Olerud et al., 1990]. Установлено, что в процессе формирования рубца повышаются и скорость звука (с 1540 до 2000 м/с) и поглощение, что коррелирует с локальным повышением содержания коллагена в этой области. Была подтверждена эффективность использования акустического микроскопа, работающего на частоте от 100 до 400 МГц, в патоморфологии при исследовании опухолевых заболеваний печени [K.Itoh et al.,1983], желудка [Y.Saijo et al., 1991], Еще одним объектом акустической микроскопии стала сердечная мышца, поврежденная инфарктом.
Поскольку некротизированные области в сердечной мышце заменяются соединительной тканью, то область инфаркта выявляется в акустическом микроскопе за счет повышенной концентрации фибриллярных белков [D.E.Yuhas, L.W.Kessler, 1979; Y.Saijo et al., 1997]. Аналогичный механизм лежит в основе формирования контраста
Характеристики сканирующих акустических микроскопов, использованных при проведении исследований
Прототип настольного широкопольного короткоимпульсного сканирующего акустического микроскопа (рис.2.4, 2.5), изготовленного в Центре акустической микроскопии Института химической физики РАН (в настоящее время Международный центр по исследованию современных материалов Института биохимической физики РАН), работает на частоте звуковых волн в диапазоне 10-100 МГц (К.И.Маслов, 1992). Кювета с образцом, погруженным в иммерсионнуюжидкость, закрепляется на предметном столике. Быстрое сканирование, формирующее столбцы в растре изображения, осуществляется вдоль оси у, а медленное — вдоль оси х. Шаг сканирования по обеим осям 50 мкм. Максимальный размер площади сканирования 12 х 12 мм. Система микроскопа позволяет работать со сменными линзами 15, 25, 50 и 100 МГц. Коэффициент усиления: 20 - 60 дБ. Акустическая линза соединяется коаксиальным кабелем с высокочастотной частью микроскопа. В высокочастотной части расположена система генерации задающего импульса, система комутации и АЦП, работающий по принципу стробоскопа для повышения эффективной частоты дискретизации. Разрядность АЦП 8 бит, максимальная эффективная частота дискретизации 16 МГц. Программное обеспечение, разработанное на основе Inprice Delphi 3.02, позволяет получать визуальные изображения в виде А-, Б- и С-сканов (см.раздел 2.3). Обеспечивается возможность сохранения изображений в графическом формате и импортирование изображения в другие программы для последующей обработки.
На базе описанной модели в 1999-2000 г.г. в Международном центре по исследованию современных материалов ИБХФ РАН была разработана новая усовершенствованная модель акустического микроскопа (рис.2.6.). При разработке этой модели использованы современные электронные системы управления прибором и новейшие компьютерные программные продукты, что позволило расширить функциональные возможности микроскопа.
Сканирующий акустический микроскоп «SONIX» фирмы Соноскан, США является коммерческим прибором многофункционального назначения (рис.2.7). Общая схема устройства и принципы работы сходны с таковыми описанного выше сканирующего микроскопа ИХФ РАН. Одним из основных отличий является то, что объект исследования помещается не на предметный столик, а в объемный резервуар, наполненный иммерсионной жидкостью (вода). Микроскоп снабжен сменными акустическими линзами с частотой 25, 50 и 100 МГц.
Ряд акустических изображений получен при помощи представленного на рис.2.8. акустического микроскопа «ELSAM», изготовленного фирмой Leitz в Германии [A.Thaer et al.,1982; М.Норре, 1985]. Отражательный микроскоп «ELSAM» представляет собой систему, включающую стандартный оптический микроскоп со сменными объективами и акустический микроскоп со сменными линзами. Оба микроскопа с высокой степенью точности (±5 мкм) могут устанавливаться над одним и тем же местом объекта. Это позволяет проводить сравнительные исследования оптических и акустических изображений объекта. Акустический микроскоп работает в диапазоне частот от 100 МГц до 2 ГГц. В настоящей работе использовали линзы 100 МГц, 200 МГц и 400 МГц, имеющие радиус кривизны 40 мкм и половинный угол раскрытия 9», = 50. Время сканирования зависит от размеров сканируемой площади и от числа линий на кадр. Минимальное время сканирования 1,3 сек, максимальное 42 сек. Оптические изображения регистрируются при помощи видеокамеры «Sony» и в цифровом виде хранятся в памяти компьютера.
В акустической микроскопии приняты традиционные формы представления полученной информации: А-сканы и различные виды растровых изображений: Б-сканы, С-сканы, Д-сканы и т.д. Зондируя поверхность образца короткоимпульсным фокусированным ультразвуковым сигналом в одной точке, мы получаем осциллограмму, передающую последовательность отражения сигнала от поверхностей образца и от элементов внутренней структуры. Эта осциллограмма называется А-скан (рис.2.9.).
Выбор иммерсионной жидкости
В качестве иммерсионной среды при исследовании материалов в акустическом микроскопе могут использоваться различные жидкости. Выбор иммерсионной среды, сходной или отличающейся по акустическому импедансу от объекта исследования, представляет собой самостоятельную задачу в зависимости от исследуемого класса объектов и каждой конкретной проблемы. Выбор иммерсионной среды определяется несколькими параметрами, основные из них: величина скорости звука, коэффициент затухания звука, низкая по отношению к образцу реакционная способность. В большинстве .жидкостей поглощение на частотах, применяемых в акустической микроскопии, столь велико, что сигнал после прохождения линзовой системы трудно зарегистрировать [J.Attal, C.F.Quate, 1976; F.S.Foster, D.Rugar, 1983, 1985; J.E.Heiserman et al., 1980; РТ.Маев, 2002; Т.А.Сенюшкина, 1988].
Величина скорости звука в иммерсионной жидкости определяет, в первую очередь, длину волны на рабочей частоте микроскопа, а, следовательно, его разрешение. Чтобы повысить разрешение, стараются использовать жидкости с наиболее низкой скоростью звука в иммерсии. В частности, использование криогенных жидкостей, имеющих очень низкие скорости звука и коэффициенты поглощения, позволило на препаратах исследовать ядро клетки, особенности строения хромосомного аппарата [F.S.Foster, D.Rugar, 1985; J.E.Heiserman et al., 1980 ]. Однако, вместе с тем, значение скорости звука в иммерсии также определяет формирование контраста акустических изображений. Соотношение между скоростями звука в объекте и иммерсии и, следовательно, различие в акустических импедансах иммерсии и образца, определяют долю энергии, отраженной от образца и прошедшей в него. Подбирая иммерсию с акустическим импедансом, близким к импедансу объекта, удается повысить эффективность проникновения сходящегося акустического пучка вглубь образца. Тем самым в отражательной микроскопии появляется возможность исследовать внутренние структуры образца, а в трансмиссионной — исследовать более толстые образцы. Для минерализованных тканей характерны большие величины акустических импедансов. При исследовании их внутренней структуры желательно было бы использовать жидкие металлы, также имеющие высокие импедансы (ртуть - 19,69-10 г/(сек-см ); галлий 17,48-10 г/(сек-см ). В ряде случаев при исследовании препаратов, использование таких иммерсионных сред оправдано. Но при этом следует учитывать как токсичность веществ, так и методические проблемы - при работе с ртутью из-за плохой смачиваемости трудно добиться хорошего акустического контакта, галлий, наоборот, из-за высокой адгезивности, пачкает образцы и линзы. В нашей работе мы ограничились использованием в качестве иммерсионных сред воды и физиологического раствора (0,9% NaCl), подразумевая, что разрабатываемые методические подходы должны в перспективе обеспечивать возможность исследований in vivo. Как иммерсионная среда вода обладает рядом достоинств: хорошей смачиваемостью, высоким поверхностным натяжением (а = 72.75 дин/см при Т = 20"С), низкой реакционной способностью.
Измерение скорости ультразвука в биологических тканях, пломбировочных материалах и медицинских композитах проводится на плоско-параллельных срезах, спилах или шлифах костной ткани, тканей зуба или срезах хряща. Толщина плоско-параллельных препаратов должна в несколько раз превышать длину волны на используемой частоте ультразвука, но при этом, с учетом высокого поглощения высокочастотного ультразвука в биологических тканях и полимерных материалах, обеспечивать прохождение ультразвукового сигнала через весь образец. Площадь поверхности препарата должна на 1-2 порядка превышать длину используемой волны. Экспериментально установлено, что для плоско-параллельных препаратов исследованных нами тканей и материалов оптимальной была толщина 0,5-1,5 мм при площади поверхности не менее 4-5 мм . В случае, если из-за сильного поглощения звука при данных размерах не удается зарегистрировать акустический сигнал, отразившийся от нижней поверхности образца, необходимо использовать линзу с меньшей частотой ультразвука.
На поверхности образцов на глаз, или с нанесением метки, выделяется несколько точек (см. рис.3.1), в которых после исследования в акустическом микроскопе микрометром или толщиномером проверяется толщина образца. Такая разметка полезна и при проведении неоднократных повторных измерений: последующие измерения проводятся в таком же порядке, как и начальные.
Образец крепится на столике акустического микроскопа, таким образом, чтобы его поверхность была перпендикулярна оси линзы и находилась в фокусе ультразвукового пучка. Измерив в режиме А-сканирования разницу между временем отражения ультразвукового сигнала от верхней и нижней поверхности образца, так называемое «время пролета», а также измерив толщину образца, вычисляем скорость ультразвука в исследуемом материале по формулам, представленным в разделе 2.6 (стр.76-77). Измерение таким методом обеспечивало хорошую (до 99,99%) воспроизводимость результатов.
Подготовка образца к исследованию в акустическом микроскопе и выбор его параметров проводится так же, как и для измерения скорости ультразвука (раздел 3.3.1). После измерения в режиме А-сканирования «времени пролета» продольной и поперечной (если возможно) акустических волн определяется плотность образцов. Условные значения эффективного динамического модуля упругости (или эффективного модуля продольной волны), модуля сдвига, модуля Юнга 103 и коэффициента Пуассона вычисляются по формулам, приведенным в разделе 2.7 (стр.79). Выбор параметров акустической линзы и величины шага сканирования акустического микроскопа производится в соответствии с 1) размером наименьшего элемента структуры исследуемой ткани или материала, 2) с качеством обработки плоской поверхности спила, шлифа или аншлифа. Следует довести обработку поверхности до такого состояния, чтобы величина её неровности была меньше, чем характерный размер исследуемых структур. При этом подбирается линза с такой частотой, при которой длина акустической волны в иммерсионной среде меньше, чем характерный размер исследуемых структур. Длина шага сканирования линзы по быстрой и медленной осям микроскопа устанавливается не более длины волны ультразвука в используемой иммерсионной среде. Ширина временных ворот устанавливается в соответствии с величиной скорости звука в исследуемом объекте и характерными размерами его тканевых структур во избежание влияния глубже лежащих слоев ткани на изображение поверхности.
Основные положения комплекса специализированных методов для исследования минерализованных тканей и замещающих их искусственных материалов с помощью акустического микроскопа
Исходя из анализа данных литературы и результатов собственных методических экспериментов, основные положения специализированного комплексного метода по исследованию минерализованных тканей и замещающих их искусственных материалов в акустическом микроскопе могут быть сформулированы следующим образом. 1. Для лучшей сохранности акустических свойств минерализованных тканей и хряща в период до проведения исследований в акустическом микроскопе можно рекомендовать хранить их в течение 1-5 дней в физиологическом растворе с добавлением тимола при температуре +4С. При необходимости использования в качестве фиксаторов спиртов, формалина или других фиксаторов необходимо дополнительно оценивать происходящие при этом изменения акустических параметров объекта. 2. Материалы, предназначенные для замещения дефектов живых тканей (пломбировочные, остеозамещающие материалы), до и в процессе исследования держать в воде или физиологическом растворе. 3. При работе с биоматериалом рекомендуется использовать в качестве иммерсионной среды воду или физиологический раствор. 4. Для работы с хрящом при проведении измерений (с учетом среднего поперечного размера лакун хондроцитов 30-50 мкм) использовать акустическую линзу с частотой до 50 МГц, а для выявления особенностей микроструктуры - 50 МГц и выше. Акустические изображения компактной костной ткани быка, полученные на частоте 25 МГц, отражают незначительные вариации акустического импеданса в толще диафиза, отчетливо видны каналы и поры костной ткани (рис.4.1). На изображении поперечного спила (рис.4.1 .А) в верхней части находится внутренняя поверхность диафиза, формирующая костномозговой канал. Можно видеть, что прилегающий к костномозговому каналу участок шириной около 600 мкм характеризуется меньшими значениями акустического импеданса.
На частоте 25 Мгц на акустических изображениях радиального спила (рис.4.1 .В) также выявляется неоднородность распределения участков с различным содержанием минерального вещества, придающая зернистый характер компактной кости в толще диафиза. Слева расположен край, прилегающий к костномозговому каналу. Можно видеть, что и на радиальном шлифе выявляется зона, характеризующаяся более низким импедансом. получение акустических изображений поверхности и внутренней структуры образца или ткани на частоте 25-50 МГц; -измерение времени прохождения акустического сигнала через образец для вычисления локальных значений скорости ультразвука, акустического импеданса и условного модуля упругости ткани на частоте 25-50 МГц; -получение акустического изображения поверхности объекта или поверхности его срезов на частоте 200-400 МГц для детального исследования микроструктуры объекта и определения вклада отдельных элементов в формирование акустических и упруго-механических свойств ткани или материала. Акустические изображения компактной костной ткани быка, полученные на частоте 25 МГц, отражают незначительные вариации акустического импеданса в толще диафиза, отчетливо видны каналы и поры костной ткани (рис.4.1). На изображении поперечного спила (рис.4.1 .А) в верхней части находится внутренняя поверхность диафиза, формирующая костномозговой канал. Можно видеть, что прилегающий к костномозговому каналу участок шириной около 600 мкм характеризуется меньшими значениями акустического импеданса. На частоте 25 Мгц на акустических изображениях радиального спила (рис.4.1 .В) также выявляется неоднородность распределения участков с различным содержанием минерального вещества, придающая зернистый характер компактной кости в толще диафиза. Слева расположен край, прилегающий к костномозговому каналу.
Можно видеть, что и на радиальном шлифе выявляется зона, характеризующаяся более низким импедансом. На тангенциальном спиле (4.1.Б) можно видеть те же особенности структуры компактной кости, что и на радиальном (4.1.В). Следует отметить некоторый наклон вертикальной исчерченности. Учитывая, что спил был проведен параллельно длинной оси кости, можно думать, что наклон является естественным и, в таком случае, он может быть обусловлен спиральным характером упаковки остеонов в объеме цельной кости. Аналогичные данные были получены M.Petrtyl et al. [1996], которые, используя трудоемкую технику наполнения каналов гаверсовой системы специальными красителями, выявляли пространственную архитектуру остеонов. Было показано, что остеоны ориентированы не продольно, параллельно длинной оси кости, а имеют характерный наклон 7-8 к продольной оси кости, обусловленный характером функциональной адаптации кости к воздействию доминирующих напряжений. Анализ степени наклона остеонных каналов важен для оценки механической прочности.
Полученные нами результаты демонстрируют, что информация такого рода может быть получена без дополнительной специальной обработки при исследовании в акустическом микроскопе. Более подробную информацию можно получить на акустических изображениях спилов костной ткани, исследуемых на частоте 200 МГц. На рис.4.2 для сравнения представлены оптическое (в отраженном свете) и акустическое изображение поперечного спила нефиксированного, необезвоженного, недекальцинированного, не окрашенного, не пропитанного смолами одного из образцов компактной костной ткани человека (75 лет). Несмотря на то, что гистологическая обработка не проводилась, на изображении, полученном в оптическом микроскопе, не составляет труда выявить основные структурные элементы компактной костной ткани: лакуны костных клеток, остеоны, хорошо различима концентрическая упаковка ламелл, края центральных каналов Гаверсовой системы.
