Содержание к диссертации
Введение
Аналитический обзор 6
1.1 Народнохозяйственное значение можжевеловых лесов 6
1.2 Химический состав хвои Juniperus 7
1.3 Культура клеток и тканей растений в решении задач биотехнологии 12
1.3.1 Вторичный метаболизм в условиях in vitro 22
1.3.1 Культивирование хвойных пород в условиях in vitro 26
Методическая часть 32
2.1 Объект исследования 32
2.2 Исследование химического состава хвои Juniperus sibirica В 34
2.3 Определение влажности 38
2.4 Определение суммарного содержания алкалоидов 38
2.5 Определение содержания подофиллотоксина в хвое 39
2.6 Определение флавоноидов 40
2.7 Определение сапонинов 41
2.8 Количественное определение витаминов 42
2.9 Определение содержания хлорофилла А, Б и каротина 44
2.10 Разделение липидов на силикагеле 45
2.11 Спектрометрическое определение содержания белка 46
2.12 Определение минеральных компонентов 47
2.13 Определение концентрации редуцирующих веществ 48
2.14 Определение легкогидролизуемых полисахаридов 49
2.15 Определение трудногидролизуемых полисахаридов 50
2.16 Определение содержания лигнина 51
2.17 Определение содержания эфирного масла 52
2.18 Определение экстрактивных веществ 53
2.19 Введение в культуру Juniperus sibirica В 53
2.20 Получение каллусной ткани Juniperus sibirica В 54
2.21 Иммобилизация растительных тканей на инертные носители 56
2.22 Методы оценки физиологического состояния культуры 57
2.23 Определение содержание подофиллотоксина в клеточной биомассе методом ВЭЖХ 58
2.24 Определение подофиллотоксина в клеточной биомассе методом ИК спектров 59
3 Экспериментальная часть 61
3.1 Химический состав хвои Juniperus sibirica В 61
3.2 Культивирование Juniperus sibirica В. в условиях in vitro 69
3.2.1 Получение интактных стерильных растений и введение в культуру in vitro 69
3.2.2 Влияние фитогормонов на каллусогенез Juniperus sibirica В 73
3.2.3 Влияние типа эксплантов Juniperus sibirica В. на каллусогенез 76
3.2.4 Получение каллусных культур 80
3.2.5 Влияние способа культивирования на рост каллусной ткани Juniperus sibirica В 83
3.2.6 Микроклональное размножение Juniperus sibirica В 88
3.2.6.1 Стимулирование развития пазушных (спящих) почек 88
3.2.6.2 Культивирование побегов Juniperus sibirica В 93
3.2.6.3 Укоренение размноженных побегов Juniperus sibirica В. и адаптация к условиям in viv о 94
4 Выделение подофиллотоксина из хвои и каллусной ткани Juniperus sibirica В 100
5 Микроклональное размножение Juniperus sibirica В. в условиях in vitro 105
Выводы 108
Список используемых источников 109
Приложение 122
- Народнохозяйственное значение можжевеловых лесов
- Объект исследования
- Химический состав хвои Juniperus sibirica В
Введение к работе
В настоящее время существуют традиционные биотехнологии для получения пищевых продуктов, фармацевтических средств с использованием животных, растений, микроорганизмов.
Современный этап биотехнологии связан не только с интенсификацией и улучшением имеющихся биологических технологий, но и с появлением принципиально новых объектов, которыми являются культивируемые ткани и клетки высших растений.
Культивируемые клетки высших растений способны синтезировать традиционно используемые продукты растительного происхождения, создавать принципиально новые вещества, трансформировать дешевые предшественники в ценный продукт. Преимуществом данного метода является возможность получения продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий, круглогодично и сохраняя при этом естественные ареалы ценных лекарственных растений
Культура клеток и тканей растений, как один из разделов биотехнологии, является не только одним из альтернативных источников необходимых биологически активных веществ, но и нетрадиционным методом охраны и восстановления генофонда лекарственных растений. Длительное микрочеренкование in vitro является одним из путей упрощения и повышения эффективности клонального микроразмножения ценных лесных пород.
Применение метода культуры изолированных меристем in vitro открывает большие перспективы для оздоровления генофонда древесных и травянистых растительных форм от грибных и бактериальных патогенов, вирусов, микоплазменных, вироидных и нематодных инфекций. Этот метод широко используется для получения и оздоровления посадочного материала многих экономически важных видов.
Одним из таких видов, нуждающимся в изучении и защите, является можжевельник. Несмотря на многовековую историю применения можжевельника, как лекарственного средства, данный вид - Juniperus sibirica В
является малоизученным. Можжевельник широко применяется в народной медицине различных стран из-за значительного содержания в хвое и ягодах биологически активных веществ. В последнее время, благодаря своим антисептическим и декоративным свойствам, можжевельник используется в озеленении парков и садов.
Традиционные способы восстановления и переработки можжевельника не обеспечивают высокие потребительские свойства производимой продукции.
В целях совершенствования использования данного уникального вида необходимо применять меры к внедрению современных биотехнологий переработки сырья, ориентированных на выпуск экологически чистой продукции с высокими потребительскими качествами.
Одной из таких технологий является культура клеток и тканей растений in vitro, которая является альтернативным источником для получения биологически активных веществ и, кроме того, рассматривается как нетрадиционный метод охраны лекарственных растений.
Народнохозяйственное значение можжевеловых лесов
Род можжевельник включает в себя около 70 видов, из которых 21 естественно распространен в Российской Федерации и на территории сопряженных государств. Это невысокие деревья, кустарники или стланики, произрастающие в различных природных зонах и высоких поясах гор [1-5].
В России наибольшие ареалы произрастания имеют два вида: можжевельник обыкновенный (Juniperus communis L.) и можжевельник сибирский (Juniperus sibirica В.). Можжевеловые леса распространены в большинстве своем в высокогорье и выполняют важные средообразующую, водорегулирующую, водоохранную, почвозащитную и противоселевую роли. По данным профессора Б.П. Токина один гектар можжевеловых насаждений может выделить летом за один день в окружающую атмосферу до 30 кг летучих веществ (фитонцидов) [6], образуя своего рода "противомикробную зону". Данного объема летучих фракций фитонцидов теоретически достаточно, чтобы простерилизовать огромный город, в то время как один гектар лиственного леса выделяет около двух, а хвойного до четырех кг фитонцидов. Кроме того, арчевники, так же как горные реки и водопады, повышают отрицательную ионизацию воздуха, оказывающую благоприятное воздействие на организм человека. Следовательно, можжевеловые леса являются наиболее благоприятными местами для размещения домов отдыха, санаториев и курортов [7].
Различные формы и окраска можжевельников позволяют широко их использовать в озеленении, для создания зеленых композиций в парках, скверах и аллеях [8]. К сожалению, арча еще недостаточно вошла в практику лесопаркового строительства в России.
Исследование физико-механических свойств древесины можжевельников показало, что отдельные виды имеют древесину, отличающуюся более высокой прочностью, мягкостью и устойчивостью к гниению по сравнению с такими породами, как ель и сосна [9].
В настоящее время в медицине, в пищевой, парфюмерной, табачной и кожевенной промышленности применяются можжевеловые шишкоягоды, хвоя, древесина и эфирное масло.
Таким образом, практически все части фитомассы арчи имеют практическое значение, однако площади арчевников и запасы фитомассы в России ограничены. Следовательно, первейшая задача лесоводов - создание в горных районах страны крупных массивов арчевников, имеющих защитное и отчасти промышленное значение [7].
Объект исследования
Лекарственные растения и получаемые из них фитопрепараты издавна используются для лечения, а также с целью профилактики многих заболеваний человека. В настоящее время ухудшение экологической ситуации, техногенное воздействие человека на окружающую среду приводит к исчезновению многих видов лекарственных растений.
В частности, постоянно сокращаются насаждения Jmiperus sibirica В. -растения, содержащего уникальный комплекс биологически активных веществ, используемых в медицине, парфюмерии и пищевой промышленности. Jmiperus sibirica В. - относится к роду вечнозеленых хвойных растений из древнейшего семейства Cupressaceae Neger [118].
Jmiperus sibirica В. (рисунок 2.1) распространен в Западной Европе, в Арктической зоне Европейской части России, в горах Средней Азии, Сибири и Дальнем Востоке, на севере до Анадыря и Камчатки [5]. Этот вид содержит сапонины, каротиноиды, винную, яблочную, галловую, юниперовую и аскорбиновую кислоты, ситостерин, полисахариды, дубильные вещества, воска, эфирные масла и минеральные соли [4, 5, 7,119,120].
Неоценимы санитарно-гигиеническое и лечебно - профилактическое значение можжевеловых насаждений. По данным Б.П. Токина 1 га данных насаждений может выделить за 1 день в атмосферу до 30 кг фитонцидов [6].
Таким образом, этот вид ценен как в насаждениях, так и для получения биологически активных веществ. Использование методов культуры клеток и тканей растений in vitro является одним из приоритетных путей для сохранения и восстановления генофонда данного вида.
Химический состав хвои Juniperus sibirica В
На территории Красноярского края произрастает несколько видов можжевельников. Наибольший ареал произрастания имеет вид Junipenis sibirica В. Значительный запас этого растения, довольно большое применение в народной медицине и недостаточность сведений о его химическом составе послужило причиной выбора объекта исследования.
Исследование химического состава хвои Junipenis sibirica В. проводилось по схеме, приведенной в методической части на рисунке 2.1. Полученные результаты по содержанию основных компонентов хвои Juniperus sibirica В. представлены в таблице 3.1.
Из полученных результатов, приведенных в таблице 3.1, следует, что хвоя Juniperus sibirica В. содержит значительное количество углеводов (38,17 %), экстрактивных веществ (37,46 %). Состав экстрактивных веществ Juniperus sibirica В. представлен сложной смесью соединений различных классов, многие из которых являются ценными для медицинской и пищевой промышленности. В связи с этим представляло интерес исследование влияния природы растворителя на выход экстрактивных веществ Juniperus sibirica В.
Для достижения наибольшего извлечения экстрактивных соединений использовали полярные и неполярные растворители. На рисунке 3.1 приведено содержание экстрактивных веществ хвои Juniperus sibirica В,, извлекаемых полярными и неполярными растворителями.
Исходя из полученных результатов, приведенных на рисунке 3.1, следует, что наибольшее количество экстрактивных веществ извлекается при использовании в качестве растворителя 96 %-го этилового спирта, а наименьшее количество экстрактивных веществ извлекается этилацетатом. Так как максимальное извлечение экстрактивных веществ наблюдали при использовании этилового спирта, то в ходе дальнейших исследований был проведен эксперимент с использованием в качестве растворителя- этилового спирта различной концентрации (рисунок 3.2.).
Концентрация этирового спирта, %
Рисунок 3.2 - Зависимость выхода экстрактивных веществ от концентрации растворителя
Полученные результаты показали, что наибольшее извлечение экстрактивных веществ достигается при использовании в качестве экстрагента 40 %-ного раствора этилового спирта.
В дальнейших исследованиях представляло несомненный интерес изучение химического состава водно-спиртовых экстрактов хвои Juniperus sibihca В. В водно-спиртовом экстракте было определено содержание липидов и их групповой состав. Результаты эксперимента приведены в таблице 3.2.
Из полученных результатов следует, что наибольшее содержание в водно-спиртовых экстрактах составляют нейтральные липиды (1,61%).
Содержание наиболее ценных биологически активных веществ Juniperus sibirica В. приведены в таблице 3.3
Одним из наиболее практически значимых биологически активных веществ, присутствующем в растении Juniperus sibirica В., является подофиллотоксин. Полусинтетические производные подофиллотоксина, этопозид и тенипозид, обладают выраженной антивирусной и антиопухолевой активностью [17]. Химический синтез подофиллотоксина трудно выполним и экономически не выгоден. Поэтому имеет большое практическое значение поиск дикорастущих растений содержащих подофиллотоксин. Одним из таких видов является Juniperus sibirica. В. Содержание подофиллотоксина в хвое J. sibirica составило 0,0018 % от а.см. и было подтверждено ТСХ, ВЭЖХ и ИК-спектрами (Приложение А).
Согласно данным, приведенным в таблице 3.3, установлено высокое содержание аскорбиновой кислоты (21,78 + 0,16) мг% в хвое Juniperus sibirica В.
Анализ литературных источников показал недостаточность сведений о качественном и количественном составе эфирного масла Juniperus sibirica В. В связи с этим было определено количественное содержание эфирного масла в хвое Juniperus sibirica В., исследован его индивидуальный состав.
Эфирное масло хвои Juniperus sibirica В. представляет собой подвижную жидкость светло-желтого цвета. Количественное содержание эфирного масла в хвое Juniperus sibirica В. составило (1,92 ± 0,02) % а.см. Определение индивидуального состава эфирного масла проводилось методом газожидкостной хроматографии (приложение Б). Индивидуальный состав эфирного масла хвои Juniperus sibirica В. приведен в таблице 3.4.
