Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13
1.1. Стволовые клетки человека 13
1.2. Мультипотентные мезенхимные стромальные клетки жировой ткани 19
1.2.1. Жировая ткань 19
1.2.2. Фенотипическая характеристика ММСК жировой ткани, CD - маркерный профиль 22
1.2.3. Потенциал дифференцировки ММСК жировой ткани 25
1. Адипогенез 25
2. Остеогенез 28
3. Хондрогенез 35
1.3. Иммуномодуляторный эффект ММСК жировой ткани 42
1.4. Перспективы применения ММСК жировой ткани 46
1.5. Заключение 55
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 57
2.1. Материалы и методы 57
2.1.1. Оборудование 57
2.1.2. Реактивы и расходные материалы 58
2.1.3. Метод получения ММСК жировой ткани 59
2.1.4. Морфологический анализ 60
1. Микроскопия 60
2. Анализ митотического индекса 60
3. Время цитогенерации 61
4. Оценка жизнеспособности 61
2.1. 5. Иммунофенотипирование 61
2.1.6. Кариотипирование 62
2.1.7. Анализ клеточного цикла 63
2.1.8. Дифференцировка ММСК жировой ткани 64
1. Адипогенная дифференцировка 64
2. Остеогенная дифференцировка 64
3. Хондрогенная дифференцировка 64
2.1.9. Молекулярный анализ полученных двухмерных структур, при на правленной остео- и хондродифференцировке 65
2.1.10. Иммуноцитохимия и иммуногистохимия 67
1. Иммуноцитохимия с использованием Novostain Universal Detection Kit (DAB-kit) 67
2. Иммуногистохимия 68
3. Специфическая окраска клеток 68
2.1.11. Доклинические испытания с применением ММСК ЖТ 69
2.1.12. Молекулярный анализ локализации ММСК ЖТ в организме экспериментальных животных (по Y-хромосоме) 70
2.1.13. Метод получения трехмерных трансплантатов хрящевой ткани...70
2.1.14. Доклинические испытания - трансплантация ТТХТ на основе ММСК жировой ткани в организм иммунодефицитных мышей 71
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 72
2.2.1 Метод выделения ММСК из жировой ткани 72
2.2.2. Морфология и кариотип ММСК жировой ткани 73
2.2.3. Анализ клеточного цикла 76
2.2.4. Иммунофенотипирование ММСК жировой ткани 81
2.2.5. Дифференцировка ММСК жировой ткани 88
2.2.6. Молекулярный анализ полученных двухмерных структур, при направленной остео- и хондродифференцировке 96
2.2.7. Доклинические исследования физиологического распределения и локализации ММСК ЖТ в организме мышей 98
2.2.8. Создание трехмерных трансплантатов хрящевой ткани (ТТХТ) 99
2.2.9. Гистологический и иммуногистохимический анализ ТТХТ, полученных на основе коллагена и полимолочной кислоты 102
2.2.10. Доклинические испытания - трансплантация ТТХТ на основе ММСК жировой ткани в организм иммунодефицитных мышей Balb/C nude 106
2.2.11. Иммуногистохимический анализ полученных ТТХТ после in vivo теста 108
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 111
4. ВЫВОДЫ 129
5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ 131
6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ
ВЫВОДОВ 132
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 133
ПРИЛОЖЕНИЕ 165
- Стволовые клетки человека
- Фенотипическая характеристика ММСК жировой ткани, CD - маркерный профиль
- Молекулярный анализ полученных двухмерных структур, при на правленной остео- и хондродифференцировке
Введение к работе
Многие годы ученые проводят исследования по изучению механизмов поддержания гомеостаза и процессов восстановления поврежденных органов и тканей в организме человека. Результатом данных исследований явилось понимание основ регуляции различных процессов в организме, а также были открыты различные типы клеток, обладающих свойством самовоспроизведения и широким спектром дифференцировки, названные «стволовыми клетками» (СК). Открытие стволовых клеток и изучение их биологии позволило получить новые перспективы для глубокого исследования процессов развития, дифференцировки, регенерации и лечения наследственных и дегенеративных заболеваний. Было выявлено, что эти клетки посредством секреции различных цитокинов и факторов роста, а также участием в ответной реакции на подобную экспрессию регуляторных белков другими клетками участвуют в поддержании гомеостаза и регуляции репаративных процессов в поврежденных органах и тканях, в том числе в процессах обновления клеток крови.
В настоящее время выделяют эмбриональные стволовые (тотипотент-ные) клетки (ЭСК); гемопоэтические и эпидермальные стволовые клетки (ГСК и ЭпСК), а также мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК) взрослого организма. Среди популяций этих клеток выделяют ММСК. Впервые они были выделены в 1974 году из костного мозга русским ученым А. Фриденштейном. Было показано, что в костном мозге присутствует определенный тип клеток (колониеобразующая единица, КОЕ), принципиально отличных от ГСК, различающихся по размерам, морфологии, пролиферативной способности, экспрессии щелочной фосфатазы и различной способности к остеодифференцировке in vivo, обеспечивающие защитное микроокружение другим клеткам и составляющие основу костного мозга. Эти клетки были названы «стромальными клетками костного мозга» (СК КМ) [89-92]. В дальнейшем различные группы исследователей продемонстрировали, что эти клетки обладают способностью к дифферен-цировке in vitro в различные типы клеток [35, 42, 59, 62, 76, 89-92, 104,119, 133,148,166,196-198,218,236,277].
Интенсивные исследования в данном направлении продемонстрировали, что популяцию ММСК можно получить и из других тканей взрослого организма - синовиальной оболочки [69, 228], надкостницы [93, 182], скелетных мышц [52,132], жировой ткани [290,291], ткани костного мозга [33,131, 132, 89-92, 218, 236], пуповинной крови [36, 82, 100, 144], периферической крови [150, 293], эпителия [58] и кожи [257], роговицы и сетчатки глаза [240, 258], пульпы зубов, головного и спинного мозга [37,60,132,220,240], стенок кровеносных сосудов [229], печени [8, 51, 270], селезенки и тимуса [89], желудочно-кишечного тракта [8,270], поджелудочной железы [209,292] и др.
Показано, что ММСК обладают свойством пластичности [199, 270] и широким спектром дифференцировки. К их свойствам относят также отсутствие экспрессии на их поверхности белков П-го класса комплекса гистосов-местимости и наличие экспрессии целого ряда иммуносупрессорных белков [155, 156, 211]. Эти особенности ММСК позволяют использовать их в разработке схем лечения многих дегенеративных заболеваний человека, в том числе в протезировании с использованием биоматериалов, содержащих ММСК.
Наиболее актуальным на сегодняшний день является восстановление тканей опорно-двигательного аппарата, в частности, хрящевой ткани. При этом известно, что трансплантация собственной и донорской ткани - ограничена возможностями получения и сохранения здоровой и жизнеспособной хрящевой ткани, возможна реакция иммуноотторжения аллотрансплантата, недостаточное обеспечение инфекционной безопасности материала и др. Также известно, что трансплантация алло- и аутохондроцитов ограничена свойствами высокоспециализированных клеток хрящевой ткани, в том числе и ограниченными возможностями хондроцитов к делению, с особенностями пациента и донора, связанные с наличием дегенеративных процессов и отсутствием здоровой хрящевой ткани для получения хондроцитов, а также с низкой эффективностью применения в лечении повреждений хряща высокоспециализированных клеток, приводящие к образованию не функциональной фиброзной хрящевой ткани. В связи с этим разрабатываются различные технологии получения функциональной хрящевой ткани с применением трехмерных носителей в сочетании с ММСК взрослого человека.
В широком применении забор ткани для получения и исследований ММСК производят в основном из костного мозга. Процедура забора костномозговой ткани достаточно болезненна и затруднительна. В связи с этим, является актуальным использование альтернативного и легкодоступного источника для получения ММСК, например, жировая ткань (ЖТ).
В связи с этим, является актуальным получение ММСК из альтернативного и легкодоступного источника - жировой ткани, а также использование их в биотехнологических разработках с целью получения хрящевой ткани для заместительной терапии при лечении заболеваний опорно-двигательного аппарата человека и животных.
В соответствии с вышеизложенным, определились цель и задачи исследований.
Цель диссертационной работы: выделение и характеристика мульти-потентных мезенхимных стромальных клеток из жировой ткани и использование их в создании трехмерных трансплантатов хрящевой ткани.
Для достижения намеченной цели необходимо было решить следующие задачи:
1. Разработать и оптимизировать способ выделения из жировой ткани клеток с фенотипом подобным ММСК и охарактеризовать их;
2. Провести анализ потенций ММСК ЖТ к направленной дифференци-ровке in vitro; 3. Изучить влияние двух индукторов (TGF-pl и TGF- РЗ) на дифферен-цировку ММСК ЖТ в клетки хрящевой ткани;
4. Оптимизировать существующий способ загрузки клеток в порооб-разный цилиндрический матрикс для создания трёхмерных трансплантатов хрящевой ткани человека in vitro и охарактеризовать их;
5. Провести доклиническое изучение ТТХТ человека в организме им-мунодефицитных мышей (Balb/C nude).
Научная новизна.
Впервые в России разработан простой, недорогой и эффективный метод выделения ММСК из ЖТ человека и их очистки от других клеточных типов, заключающийся в ферментативной обработке ЖТ раствором коллагена-зы в среде Игла в модификации Дюльбекко с последующей градиентной фильтрацией полученной суспензии. Новизна подтверждена патентом РФ №2252252 от 20.05.2005 г.
Впервые разработан метод получения ММСК из ЖТ человека с эффективностью 10б клеток/1 г ЖТ с жизнеспособностью 96%. Охарактеризованы иммунобиологические и морфо-функциональные особенности полученных популяций клеток in vitro. Установлено, что ММСК ЖТ характеризуются высокой адгезивной и клонообразующей способностями и культивируются в питательной среде с низким содержанием глюкозы.
Впервые разработан эффективный способ загрузки трехмерного мат-рикса ММСК ЖТ и подобран оптимальный основной индуктор хондрогенеза TGF-P3.
Впервые созданы ТТХТ на основе различных биоматриксов и ММСК ЖТ и проведены доклинические испытания полученных ТТХТ в организме мышей Balb/C nude. Изучено влияние матриксов на основе коллагена и DD,-LL-полимолочной кислоты (OPLA) на формирование структуры XT. Выявлено, что для получения ТТХТ значительное преимущество имеет пористый матрикс OPLA. In vivo тесты показали, что полученные ТТХТ не токсичны и не туморогенны.
Практическая значимость.
Экспериментальные данные по получению популяции ММСК ЖТ представляют практический интерес для биотехнологии, медицины и ветеринарии, что обусловлено невысокой стоимостью разработанного метода в сочетании с высокой эффективностью. На базе ООО «Бьюти Плаза» создана технологическая линия выделения ММСК из ЖТ.
Разработаны и утверждены Федеральной службой (ФС) по надзору в сфере здравоохранения и социального развития методические рекомендации «Способ выделения мезенхимальных стволовых клеток из подкожно-жировой клетчатки человека» (per. № ФС-2006/268-У), в которых изложены условия, позволяющие рационализировать метод выделения данных клеток.
Разработан метод эффективной загрузки трехмерных матриксов ММСК ЖТ для получения хрящевой ткани с эффективностью 68%.
Подобран эффективный индуктор хондрогенеза - TGF-33.
В опытах на экспериментальных животных показано, что полученные ТТХТ не обладают свойством туморогенности и не оказывают токсического влияния на организм животных.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы апробированы на: Международном симпозиуме «Herbsttagung der Gesellschaft fur Biochemie und Molekularbiologie» (Германия, 2004); Международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация и клеточная терапия» (Санкт-Петербург, 2004); VII-ом Международном конгрессе по клеточной трансплантологии (США, 2004); Российском симпозиуме «Лазерная медицина» (Москва, 2004); И-ом Московском международном биотехнологическом конгрессе (Москва, 2005); Всемирной конференции по тканевой инженерии (Китай, 2005); Ш-ем Московском международном биотехнологическом конгрессе (Москва, 2006); VI-OM Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006); XI-ом съезде международного общества тканевой инженерии (Нидерланды, 2006); IV-ом Московском международном биотехнологическом конгрессе (Москва, 2007); XI-ом международном форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007). Основные положения, выносимые на защиту.
1. Способ выделения ММСК из жировой ткани, их иммунобиологическая и морфо-функциональная характеристика;
2. Зависимость эффективности дифференцировки ММСК ЖТ в клетки хрящевой ткани от индукторов, представленных трансформирующими факторами роста (TGF-pi и TGF- 03);
3. Способ загрузки клеток в порообразный цилиндрический матрикс для создания ТТХТ человека in vitro;
4. Результаты доклинических исследований полученных ТТХТ;
5. Влияние матрицы-носителя на эффективность создания трехмерных структур хрящевой ткани.
Публикации. По результатам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 5 статей в научных журналах, 11 тезисов в сборниках конференций.
Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 174 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения, выводы, данные о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (293 источника, из которых 4 отечественных и 289 иностранных). Работа содержит 10 таблиц, 21 рисунок, 10 страниц приложений.
Стволовые клетки человека
На протяжении более 100 лет проводятся исследования по изучению процессов восстановления и регенерации повреждений в организме, а также изучение механизмов замещения поврежденных участков органов и тканей функционально-полноценными здоровыми клетками. Выявление основ данных механизмов позволило бы использовать клеточные ресурсы целенаправленно и усиливать естественный репаративный потенциал клеток.
Открытие стволовых клеток и изучение их биологии позволило получить новые перспективы для более глубокого исследования процессов развития, дифференцировки, регенерации и лечения наследственных и дегенеративных заболеваний. Было выявлено, что эти клетки участвуют в поддержании гомеостаза и регуляции репаративных процессов в поврежденных органах/тканях, в процессах обновления клеток крови и др.
Первые данные об этих клетках появились в 1908 году, когда были опубликованы данные исследований русского ученого А. Максимова о том, что существует определенный тип клеток в костном мозге, участвующий в развитии и созревании клеток крови. Далее, с середины XX века, эти клетки стали использовать для восстановления гемопоэза после химиотерапии у пациентов с лейкозом и другими заболеваниями кроветворной и лимфатической систем злокачественного характера [19,41]. В последствии эти клетки были названы «гемопоэтическими стволовыми клетками» (ГСК), которые были обнаружены в дальнейшем в периферической крови взрослого человека и в пуповинной крови [36, 82, 100, 144, 150, 293]. В настоящее время ГСК применяются в восстановлении кроветворной системы после проведения химиотерапии в лечении злокачественных и аутоиммунных заболеваний [24,86,169,261].
В дальнейшем, в 1970 году ученым К. Potten были открыты клетки в коже, названные «эпидермальными стволовыми клетками» (ЭпСК) [203]. Было выявлено, что ЭпСК расположены в основании волосяного фолликула и под эпидермисом - на базальной мембране. Как было показано впоследствии, эти клетки способны восполнять утраченные клетки своей ниши и успешно применяются для восстановления кожного покрова при ожогах [63, 95, 130, 153, 163, 204]. Возможность использования для заживления ран ау-тологичных (собственных) клеток кожи, выращенных in vitro, была показана в 1942 году в работах P. Medawar [173]. Дальнейшие исследования привели к разработке методов длительного культивирования и поддержания жизнеспособности клеток кожи (фибробластов) вне организма (in vitro). В 1961 году L. Hayflick и P. Moorhead представили данные о том, что даже в оптимальных условиях культивирования in vitro эмбриональные фибробла-сты человека способны делиться только ограниченное число раз (50±10), этот феномен был назван «пределом Хейфлика» [113, 114]. В дальнейшем, были разработаны и оптимизированы различные методы выделения и культивирования клеток из дермы кожи. Однако лишь в 1970 году ученым К. Potten в коже были обнаружены ЭпСК, количество которых, как было показано позднее, с возрастом уменьшается [205, 281]. Проведенные в дальнейшем многочисленные исследования показали, что эти клетки способны восстанавливать глубокие повреждения кожных покровов, особенно эффективно в сочетании с эквивалентом дермального слоя кожи, и способны активизировать «спящие» и восстанавливать поврежденные волосяные фолликулы [128,167].
В 1974 году русский ученый А. Фриденштейн опубликовал данные, свидетельствовавшие о том, что в костном мозге присутствует определенный тип клеток (колониеобразующая единица, КОЕ), принципиально отличных от гемопоэтических стволовых клеток, различающихся по размерам, морфологии, пролиферативной способности, экспрессии щелочной фосфатазы и различной способности к остеодифференцировке in vivo, обеспечивают защитное микроокружение другим клеткам и составляют основу КМ. Эти клетки были названы «стромалъными клетками костного мозга» (СК КМ) [89-92]. В дальнейшем различные группы исследователей продемонстрировали, что эти клетки обладают способностью к дифференцировке in vitro в различные типы клеток [35,42, 59, 62, 76, 89-92,104,119,133,148, 166, 196-198, 218, 236, 277] и были названы «мезенхимными стволовыми клетками» (МСК).
Фенотипическая характеристика ММСК жировой ткани, CD - маркерный профиль
По результатам цитофлуориметрического и иммунофлуоресцентного анализа определен иммунофенотип ММСК ЖТ человека, культивированных in vitro [290, 291, 103, 276, 282]. Группы ученых, независимо друг от друга, выделили ММСК ЖТ и определили набор характерных для них поверхностных белков, при этом CD-профиль ММСК ЖТ у разных групп несколько отличался [13,103,136,199,213,227,266, 276,282,290,291]. При сопоставлении данных различных научных групп по поверхностным антигенам МСК ЖТ можно выделить следующие категории белков: Молекулы адгезии. ММСК жировой ткани экспрессируют tetraspan protein (CD9), р-1-интегрин (CD29, Fibronectin receptor), Platelet/endothelial cell adhesion molecule (PECAM-1, CD31) а2Ь-интегрин (CD41b), аі-интегрин (CD49a/VLA-l, collagen/laminin receptor), х2-интегрин (CD49b), аЗ-интегрин (CD49c), а4-интегрин (CD49d), а5-интегрин (CD49e/VLA-5, Fibronectin receptor), а6-интегрин (CD4917VLA-6, Laminin receptor), aV-интегрин (CD51, Vitronectin receptor), intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1, CD54), activated lymphocyte cell adhesion molecule (ALCAM, CD166) [13,98,136,199,213,227, 266].
При этом белки - МНС class II co-receptor (CD4), МНС class I co-receptor (CD8a), aL-интегрин (CD 11a), ab-интегрин (CDlib), аХ-интегрин (CD 11 с), p-2 интегрин (CD 18), intercellular adhesion molecule-3 (ICAM-3, CD50), neural cell adhesion molecule (NCAM, CD56), endothelial leukocyte adhesion molecule І (Е-селектин, CD62), L-селектин (CD62L), Р-селектин (CD62P) и vascular cell adhesion molecule (VCAM, CD 106) - не экспрессиру-ются на поверхности ММСК ЖТ [98,136]. Все эти результаты, скорее всего, обусловлены проведением иммуно-фенотипирования непосредственно после выделения или недлительного культивирования клеток и, соответственно, присутствием в полученных популяциях - клеток гематопоэтической и эндотелиальной линий [136,175,199, 213], которые в дальнейшем не культивируются в условиях, предназначенных для мультипотентных мезенхимных стромальных клеток, и подвергаются апоптозу. В то же время Zuk Р. с коллегами не обнаруживала экспрессию этих белков на поверхности ММСК ЖТ [290,291]. Более того, группа ученых под руководством Zuk Р. детектировала наличие экспрессии стромальными клетками ЖТ Stro-1, a Gronthos и его коллеги - нет [103]. При этом многие научные группы сходятся во мнениях об отсутствии экспрессии этими клетками CD4, CD8, CD14, CD16, CD50, CD56, CD61, CD104 и отмечают экспрессию белков семейства TGF-p рецепторов - SH2 и SH3 [196, 197, 290, 291], которые являются различными эпитопами маркера CD 105 и CD73 соответственно [25, 87].
Различия в данных по CD-профилю ММСК ЖТ у различных групп исследователей может быть обусловлено различиями в методах выделения ММСК, длительности их культивирования до проведения иммунофенотипи-рования, использовании моноклональных антител на разные эпитопы одних и тех же антигенов, а также различиями в чувствительности методов иммуноцитохимии и проточной цитофлуориметрии [103,276,282,290,291].
Иммунофенотип ММСК ЖТ сопоставим с данными по ММСК, выделенных из костного мозга (КМ) человека и скелетной мускулатуры [70, 103, 124, 198, 227, 266, 276, 282, 290, 291]. Тем не менее, различия существуют: ММСК ЖТ не экспрессируют NCAM (CD56), а ММСК, выделенные из мышечной ткани - экспрессируют [103, 282]. Была выявлена разница в экспрессии CD-маркеров между ММСК КМ и ММСК ЖТ, таких как CD49d (а4-интегрин) и CD106 (VCAM) [136, 196, 197, 277, 290, 291]. Несомненно, при сравнительной оценке CD-профиля ММСК КМ и ЖТ не выявляется строгого соответствия в экспрессии поверхностных антигенов данных клеток [136, 245,266,291].
Проведены исследования отдельных генов популяций ММСК КМ и ЖТ и выполнена работа по сравнительному анализу панели из 28 генов [38], а так же проведен тотальный скрининг 172 уникальных генов методом Mi-croarray-анализа для проведения сравнительной оценки трех популяций ММСК ЖТ [136]. Были выявлены определенные различия и особенности как в самой популяции МСК ЖТ, так и в сравнении с ММСК других тканей взрослого человека [136, 227, 266], что, несомненно, требует проведения в этой области дальнейших исследований.
Молекулярный анализ полученных двухмерных структур, при на правленной остео- и хондродифференцировке
Направленную дифференцировку in vitro проводили при двумерном культивировании ММСК ЖТ (на пластике - для остеодифференцировки и в осадке - для хондродифференцировки). В качестве контроля были использованы клетки, культивированные в отсутствие индукторов. В процессе диф-ференцировки клетки были проанализированы на экспрессию генов, специфичных для клеток костной и хрящевой тканей методом ПЦР-анализа с применением стадии обратной транскрипции на 14, 21 и 28 сутки после начала индукции.
В качестве маркеров, специфичных для клеток костной ткани были выбраны остеопонтин (osteopontin, OP), костный сиалопротеин (bone sialoprotein II, BSP) и остеокальцин (osteocalcin, ОС), а для клеток хрящевой ткани - коллаген П-го типа (Collagen II), коллаген Х-го типа (Collagen X) и аггрекан (Aggrecan).
Выделение РНК:
Выделение РНК из клеток проводили с использованием набора SV Total RNA Isolation System (Promega, США), согласно рекомендациям производителя. Клетки трипсинизировали и дважды промывали DPBS. К клеточному осадку добавляли 175 мкл лизирующего раствора. К лизату добавляли 350 мкл буфера для разведения (SV Dilution Buffer), аккуратно смешивали и инкубировали 3 мин. при -70С. Смесь центрифугировали со скоростью 13000 g в течение 10 мин. Супернатант переносили в чистую пробирку и добавляли 200 мкл 95% этанола. Раствор переносили в колонку (spin column assembly) и центрифугировали со скоростью 13000 g в течение 1 мин. Колонку промывали 600 мкл раствора для промывки (SV RNA wash solution), и наносили 50 мкл инкубационной смеси, содержащей ДНКазу I. После 15 мин. инкубации при комнатной температуре, добавляли 200 мкл стоп-раствора (SV DNAse stop solution), центрифугировали со скоростью 13000 g в течение 1 мин., и дважды промывали раствором (SV RNA wash solution) как было описано выше. РНК элюировали в 100 мкл воды свободной от нуклеаз и хранили при -20С.
Концентрацию выделенной РНК определяли путем измерения оптической плотности при длине волны 260 нм по формуле 10.D. = 40 мкг РНК/мл. ОТ-ПЦР:
Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 10 мкл. 1 мкг РНК в объеме 6,5 мкл вносили в тонкостенную пластиковую пробирку объемом 0,2 мл, добавляли 250 нг праймера олиго-(17)сГГ (Promega, США), денатурировали при +90С в течение 2 минут, после чего быстро переносили в лед. К денатурированной РНК вносили 3 мкл реакционной смеси содержащей следующие компоненты: Mo-MuLV буфер (100 мМ трис-НС1 (рН 8,3), 30 мМ MgCl2, 750 мМ КС1,100 мМ DTT), по 0,5 мМ каждого из дНТФ, 5 ед. ак. ингибитора РНИаз (Promega, США) и 15 ед. ак. Mo-MuLV обратной транс криптазы (Promega, США). Смесь инкубировали 45 минут при +42С, затем 10 минут при +94С.
ПЦР проводили в тонкостенных пластиковых пробирках объемом 0,2 мл. Общий объем реакционной смеси составлял 25 мкл. В реакционную смесь входили следующие компоненты: ПЦР - буфер (85 мМ ацетата калия, 25 мМ трицина (рН 8,7), 8% глицерина, 1 % диметилсульфоксида), 1,5 мМ AcMg, по 0,4 мМ каждого из дНТФ, по 10 пМ прямого и обратного прайме-ров, 2,5 мкл ДНК (продукт обратной транскрипции) и 5 ед. ак. Taq-ДНК по-лимеразы.
Инкубацию реакционной смеси проводили при следующих условиях: предварительная денатурация при +94С - 3 мин; далее 35 циклов по схеме: 1) денатурация +94С - 20 сек; 2) отжиг праймеров +55С - 20 сек; 3) элонгация +72С - 40 сек. После окончания циклов проводили заключительную элонгацию при +72С в течение 5 мин.
