Содержание к диссертации
Введение.
1. Литературный обзор.
1.1. Аппликационные лекарственные средства (АПЛС).
-
Аппликационные лекарственные средства для лечения ран.
-
Системы трансдермальной доставки биологически активных веществ (БАБ) и лекарственных препаратов.
1.2.Морфо - функциональные особенности кожи.
1.2.1. Биологическая специфика транспорта веществ в кожу. 1.3.Эпидермальный фактор роста, его биологическая роль в организме,
возможности использования в медицинской практике.
1.3.1. Повреждения кожного покрова и ранозаживляющие свойства ЭФР. 1.4.Моделирование кожной проницаемости различных веществ.
-
Общие принципы построения математических моделей и их программного обеспечения в биологии и медицине.
-
Прогнозирование коэффициентов проницаемости с помощью регрессионных моделей.
-
Моделирование транспорта веществ с помощью феноменологических законов диффузии Фика.
2. Материал и методы.
2.1. Культивирование рекомбинантного штамма Escherichia coli,
2.2.Методы криогенного хранения рекомбинантного штамма Escherichia coli
при температуре жидкого азота. 2.3.Выделение и очистка чЭФР.
-
Выделение чЭФР из периплазматической фракции.
-
Выделение чЭФР из культуральной жидкости. 2.4. Анализ полученного препарата чЭФР.
2.4.1. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле.
-
ВЭЖХ (аналитический вариант).
-
Аминокислотный анализ.
2.5.Определение биологической активности ЭФР in vitro.
-
Получение суспензий клеток различных слоев эпидермиса.
-
Анализ включения предшественников синтеза ДНК в базальные клетки эпидермиса.
2.6.Методы математического моделирования диффузионных процессов
транспорта чЭФР. 2.7.Разработка программного обеспечения полученных математических
моделей. 2.8.Определение коэффициентов диффузии.
2.9. Анализ сходимости расчетных и экспериментальных результатов.
-
Экспериментальная проверка однослойной модели.
-
Экспериментальная проверка двуслойной модели.
-
Экспериментальная проверка модели, описывающей процесс пропитывания АПЛС.
2.10. Получение АПЛС, содержащих чЭФР.
-
Стерилизация растворов чЭФР.
-
Конструирование АПЛС, содержащих чЭФР.
-
Проверка ранозаживляющих свойств АПЛС.
-
Количественные методы анализа.
-
Статистическая обработка результатов. 3. Полученные результаты и их обсуждение.
3.1.Оптимизация условий культивирования и хранения рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента фактора роста эпидермиса человека (чЭФР).
4 3.2.Выявление основных биологических свойств цитокина, отражающих
особенности взаимодействия ЭФР с рецепторним аппаратом клеток
эпидермиса.
3.3.Моделирование диффузионных процессов транспорта БАВ в кожу с
учётом морфо-функциональных особенностей кожного покрова.
3.4.Разработка математической модели и её программного обеспечения на
основе результатов исследования биологических свойств
рекомбинантного цитокина для прогнозирования основных параметров
АПЛС, используемых в качестве раневых покрытий.
3.5.Математическое и программное обеспечение расчета технологических
параметров диффузионных процессов пропитывания АПЛС.
3.6.Экспериментальная проверка ранозаживляющих свойств АПЛС с ЭФР.
Заключение.
Выводы.
Список литературы.
5 Список сокращений.
АПЛС-аппликационное лекарственное средство БАВ-биологически активное вещество ДНР-длительно незаживающие раны ИЛ-интерлейкин МАО-моноаминооксидаза ТТС-трансдермальные терапевтические системы ТФР-трансформирующий фактор роста ФРФ-фактор роста фибробластов ФРЭС-фактор роста эндотелия сосудов ЧСА-сывороточный альбумин человека ЭФР-фактор роста эпидермиса ЭФРР-рецептор фактора роста эпидермиса ЕгЬВ-рецептор семейства фактора роста эпидермиса HB-EGF-гепаринсвязывающий ЭФР-подобный фактор IPTG-изопропил 1 (3-D -тиогалактозид NDF-новый дифференцирующий фактор РОРОР-1,4-ди (2,5 фенилоксазол) бензин РР02,5-дифенилоксазол SDGF-амфирегулин STF-поверхностное натяжение в воде TEWL-уровень потери транедермальной воды ТОР^грансформирующий фактор роста TTF-трансдермальная терапевтическая форма VGF-фактор роста вируса осповакцины
Введение к работе
Актуальность работы. Биотехнологические методы исследования занимают в последние годы значительное место при разработке и конструировании аппликационных лекарственных средств [163, 222]. АПЛС содержащие БАВ биотехнологического происхождения активно применяются при ожогах, лечении ран различной этиологии, кожных болезней и ряда соматических заболеваний [104, 116, 169, 170].
Однако получение АПЛС с необходимым терапевтическим эффектом затруднено сложным характером взаимодействия биологически активных и вспомогательных веществ с различными структурами кожного покрова, отсутствием чётких концентрационных и временных характеристик транспорта БАВ из АПЛС и ряда других процессов.
Применение методов математического и компьютерного моделирования с учетом физико-химических и, в том числе, диффузионных параметров БАВ, морфо-функциональных особенностей кожного покрова дает возможность определить ряд . основных показателей разрабатываемого АПЛС, усовершенствовать технологию его конструирования и получения ещё до проведения сложных медико-биологических экспериментов. Это особенно актуально в тех случаях, когда в качестве лекарственных препаратов для АПЛС выступают вещества биотехнологического происхождения, такие как рекомбинантные цитокины, плазмиды, антисмысловые олигонуклеотиды, получение которых требует значительных энергетических и экономических затрат.
В связи с этим целью настоящего диссертационного исследования являлась разработка методов математического и компьютерного моделирования для описания транспорта БАВ и их применение в процессе создания АПЛС с использованием субстанций биотехнологического происхождения (на примере фактора роста эпидермиса человека - чЭФР).
7 В задачи настоящего исследования вошли:
Отработка условий культивирования и хранения рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента чЭФР.
Изучение биологических свойств цитокина, отражающих особенности взаимодействия чЭФР с клетками эпидермиса с целью использования полученных данных при конструировании АПЛС.
Моделирование процесса доставки БАВ в кожу с учётом морфо-функциональных особенностей кожного покрова.
Создание математических моделей и компьютерных программ, позволяющих прогнозировать параметры АПЛС на основе биологических свойств чЭФР.
Разработка методики расчета времени пропитывания АПЛС для достижения необходимой концентрации БАВ с помощью математического и компьютерного моделирования.
Оптимизация на основе разработанных математических моделей технологических условий конструирования АПЛС и проверка их ранозаживляющих свойств.
Научная новизна работы. На примере использования в качестве БАВ биотехнологического происхождения рекомбинантного белка чЭФР впервые проведено математическое и компьютерное моделирование диффузионных процессов для прогнозирования основных параметров АПЛС с регулируемым высвобождением лекарственных препаратов. Предложена двухслойная математическая модель и ее программное обеспечение для изучения транспортных процессов БАВ в кожу с учётом морфо-функциональных особенностей кожного покрова, С помощью математической модели АПЛС, используемых в качестве раневых покрытий определены начальная концентрация цитокина в лекарственной форме, ее оптимальные размеры, диапазон коэффициентов диффузии, обеспечивающих необходимую плотность
8 потока ЭФР. Созданы математические модели и компьютерные программы, позволяющие рассчитывать время пропитывания носителя, необходимое для получения заданной концентрации веществ в АПЛС при различных технологических условиях. Изучены оптимальные условия культивирования и режим хранения рекомбинантного штамма Escherichia coli - продуцента чЭФР.
Научно-практическая значимость. Предложенный в диссертации подход и разработанная методология построения математических моделей и компьютерных программ позволяют осуществлять выбор оптимальных параметров при конструировании АПЛС еще до проведения медицинских экспериментов, что снижает затраты на их доклиническую разработку и испытание. Экспериментально обоснованные условия культивирования и хранения, обеспечивают гарантированное получение лекарственной субстанции. На основе результатов математического и компьютерного моделирования была разработана схема конструирования и созданы АПЛС, содержащие чЭФР, обладающие ранозаживляющими свойствами.
Математическая модель, построенная с учетом морфо-функциональных особенностей кожного покрова, дает возможность перехода на новую технологию применения АПЛС, позволяющую прогнозировать время и условия их использования. Предложенные модели могут быть также использованы в косметологии, парфюмерии, стоматологии для анализа процессов проницаемости биологически активных веществ в различные ткани организма, количественной оценки риска чрезкожного проникновения токсических веществ и химических соединений. Полученные результаты могут лечь в основу одного из перспективных направлений в биомедицинской технологии - компьютерному конструированию аппликационных лекарственных средств нового поколения, использоваться в производсве АПЛС с ранозаживляющими свойствами.
9 Апробация работы и публикации. Материалы диссертации докладывались на XI и XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» 2004-2005гг., 3 Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспектива развития» 2005г. г. Москва, 3
Российской конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» 2005г. г. Москва, 3-4 Всероссийской конференции по «Биомедицинской технологии» 2005-2006гг. г. Москва. Основные результаты диссертации опубликованы в 6 статьях и 4 тезисах.
Связь исследования с федеральными научными программами и планами НИР. Диссертационная работа соответствует одному из «Приоритетных направлений и Критических технологий федерального уровня», утверждённых Президентом РФ 30.03.02г. «Компьютерное моделирование», а таюке приоритетным направлениям по отделению медико-биологических наук
РАМН и МЗ РФ на 2000-2005 гг. «Разработка новых лекарственных средств с помощью современных методов и создание биомедицинских технологий коррекции состояния организма»; и на 2006-2010гг. «Разработка новых оригинальных лекарственных средств». Исследование проводилось согласно плану теоретических и прикладных НИР ВИЛАР.
Положения, выносимые на защиту.
Условия культивирования и хранения рекомбинантного штамма Е. coli -продуцента чЭФР, обеспечивающие гарантированное получение лекарственной субстанции.
Методология применения математического и компьютерного моделирования для прогнозирования базовых свойств АПЛС с использованием субстанций биотехнологического происхождения (на примере чЭФР).
Анализ диффузионных процессов транспорта БАВ в кожу с учетом морфо-функциональных особенностей кожного покрова на базе двухслойной математической модели и её программного обеспечения.
Математическая модель, построенная на основе результатов исследования биологических свойств чЭФР, для прогнозирования параметров АПЛС, используемых в качестве раневых покрытий.
Методика расчёта времени пропитывания АПЛС для достижения необходимой концентрации БАВ с помощью математического и компьютерного моделирования.
Схема конструирования АПЛС, содержащих чЭФР, с заданными диффузионными параметрами и результаты проверки их ранозаживляющих свойств.
